棉花中LRR-RLKs的全基因组鉴定和特性揭示了SIF亚家族的功能保守性(陆地棉）

背景

作为植物中受体样蛋白激酶（RLK）的最大亚壳之一，富含少氨酸的重复 - RLK（LRR-RLK）涉及许多关键的生物方法，包括除各种生理作用之外还包括生长，发育和应力反应。拟南芥含有234 LRR-RLK，以及应激诱导因子（SIF）亚家族（ATSIF1-ATSIF4）的四个成员参与非生物和生物应激反应。在此，我们旨在鉴定和功能表征SIF亚家族在培养的四倍棉中的鉴定和功能表征陆地棉．

结果

对棉花LRR-RLK基因家族进行全基因组分析，共鉴定出543个成员，系统发育分析鉴定出6个与LRR-RLK具有高度同源性的棉花LRR-RLK家族拟南芥SIFS。在六种SIF同源物中，GHSIF1高度保守，在氨基酸序列中表现出与ATSIF亚家族的同源性46-47％。这GHSIF1使用病毒诱导的基因沉默系统特异性地针对3'非翻译区暂时沉默。与对照植物相比，暂时沉默的棉花幼苗表现出更强的耐盐性。此外，暂时沉默的植物表现出更好的生长、更低的电解质渗漏、更高的叶绿素和生物量目录

结论

通过全基因组分析，共鉴定出543个四倍体棉花LRR-RLK基因g .分子．本研究还证明了SIF家庭成员在棉花中保守的耐盐性功能。这GHSIF1可以使用基因组编辑技术敲除基因以改善棉花的耐盐性。

为了感知外部环境并有效地在细胞之间进行通信，两种动物和植物都使用血浆膜和/或细胞壁局部受体，其感知和转换信号调节基因表达。Toll样受体代表了涉及信号转导过程的最重要的激酶受体[1]．另一方面，植物受体样蛋白激酶（rlks）是最重要的膜蛋白家族，参与生长和发育，应力反应和各种其他生物过程[2]．根据细胞外结构域的结构，植物类受体蛋白激酶被分为S-RLK (S-domain RLK)、LRR-RLK (Leucine-Rich Repeat RLK)、CR4-class (CRINKLY4 RLK)、WAK (Wall Associated Kinase)、PR5-RLK (PR5-Like RLK)和Lectin类[3.，4，5，6，7，8，9]．其中，LRR-RLK是植物中最大的受体蛋白激酶亚家族之一，共有234个成员拟南芥［2，10，11，12)(表1）.LRR结构域专门识别各种细胞外信号配体并与之相互作用，赋予LRR- rlk感知质外体信号的能力[13]．FLS2(鞭毛蛋白敏感2)-BAK1(油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1)复合物的研究表明，配体与LRR结构域的相互作用诱导细胞质中激酶结构域的构象改变，使激酶结构域将磷酸盐转移到下游蛋白，促进信号从质外体转导到共质体[13]．LRR-RLKs调控植物的各种生物过程，包括类固醇感知、细胞增殖、光形态建成、生物和非生物胁迫反应[14，15，16，17，18，19]．例如，SERKs(体细胞胚胎发生受体激酶)是介导油菜素内酯信号感知的重要受体拟南芥［20.，21]．此外，SERK3/BAK1和SERK4/BKK1 (BAK1- like 1)参与FLS2或EFR触发的防御信号转导[22]．在Medicago spp。这个LRR-RLK.基因，SRLK已经被证明可以调节根对盐胁迫的反应[18]．同样，米饭Xa21D基因编码膜锚定蛋白，其负责抗病信令途径的病原体识别[23]．

由于LRR-RLK家族成员的重大重要性，已经进行了基因组分析拟南芥在大豆、小麦、柑橘、vernicia、玉米、水稻和杨树中进行LRR-RLK基因的鉴定和功能分析[12，24，25，26，27，28，29，30.]．LRR-RLKs在拟南芥分为14个亚枝(LRR-I ~ LRR-XIV，分布在所有5条染色体上[12]．在水稻、大豆和六倍体小麦中分别鉴定出309、467和531个LRR-RLKs [24，28，30.]．尽管数量大，但LRR-rlks在植物中高度保守。然而，细胞外结构域和相关结构的差异导致了片状内各个成员的功能专业化。例如，拟南芥来自Subclade的LRR-RLKS IBARCHINGINGINGION的域名负责N-糖基化和ER定位，在其他亚分支中未检测到[31]．因此，每个基因的系统发育分析和功能表征对于了解其在各种生物中的特定作用是重要的。我们最近鉴定并表征了参与生物和非生物胁迫信号传导途径的LRR-RLK基因的亚家族拟南芥［32].胁迫诱导因子（SIF）亚家族包含四个成员（SIF1–4），它们对非生物和生物胁迫作出反应。对SIF2蛋白的进一步表征表明其在大鼠应激信号转导途径中的作用拟南芥．

陆地棉是世界各地栽培的农作物之一，占全球全球棉花生产的95％以上[33]．在全球范围内，棉花种植在不同的环境条件下，受到各种生物和非生物胁迫。人棉LRR-RLK.基因，例如ghlrr-rl.，GhBRI1，ghrlk1.,GBRLK.，已经表征和证明在棉花开发和应力阻力中起重要作用[34，35，36，37]．但是，对棉花的LRR-RLK基因家族没有全面分析。在本研究中，我们对LRR-RLK基因家族进行了基因组分析g .分子使用最近发布的棉花全基因组序列（https://www.cottongen.org/data/download/genome）.鉴定了总共543个GHLRR-RLK蛋白质，其中542中，将542分为13个植物在系统发生树中。这些基因的染色体分布，基因重复，基因和蛋白质结构分析，功能注释和表达分析进一步导致了鉴定拟南芥SIF棉花的同源物的亚家族。瞬态沉默GHSIF1利用病毒诱导基因沉默(VIGS)系统使四倍体棉花具有耐盐性。综上所述，本研究证实了SIF亚家族在棉花中的功能保护，表明其在分子育种、生物技术或基因组编辑方法等作物改良方面的潜在应用价值。

鉴定LRR-RLK.基因家族在陆地棉TM-1

我们已经下载了公开可用的g .分子TM-1接入参考基因组数据，并进行全基因组相似性搜索，确定LRR-RLK基因家族使用的序列拟南芥LRR-RLK蛋白质作为查询[12]．对Blast序列进行严格过滤，发现至少有一个LRR重复序列、一个激酶结构域和一个跨膜区域，共鉴定出543个序列G. Hirsutum LRR-RLK家庭成员（附加文件1:表S1)。所有验证的全长基因组，编码和氨基酸序列g .分子LRR-RLK系列成员用其原始基因ID从参考基因组序列中获取并用于进一步表征。

棉花LRR-RLKs的系统发育分析

采用543 GhLRR-RLK和234进行蛋白序列比对和系统发育分析拟南芥LRR-RLK蛋白质序列研究进化关系[11，12]．g .分子与AtLRR-RLK组合的蛋白序列定义为相应的成员拟南芥subclade。使用拟南芥LRR-RLK作为参考文献，将542个GHLRR-RLKS分为13个亚次的邻近的系统发育树中，同时剩下一种蛋白质，CotAd_01838与一个聚集在一起拟南芥LRR receptor-like protein At1G65380 (CLV2)，未归属于任何受体拟南芥亚克莱德（图。1和附加文件1:表S1)。GhLRR-RLK各亚枝的大小差异显著。例如，最大的子枝XII包含128个成员，而最小的子枝IV只包含12个成员。广义上，GhLRR-RLK各亚枝的相对大小几乎相似拟南芥，除了Subclade I和Subclade XII（表1） [38]．在拟南芥，子分支I有44个成员，占全部AtLRR-RLKs的18.8%，但是g .分子子分支I包含13个成员，仅占总GhLRR-RLKs的2.4%。第XII亚枝，10条LRR-RLK序列仅占总数的4.3%在LRR-RLK，虽然GHLRR-RLK-XII亚基组成的128个成员组成，代表GHLRR-RLK总数的23.6％。

调查是否g .分子包含同源物拟南芥SIF子家族基因（atsif1-atsif4） [32[我们使用ATSIF1-ATSIF4蛋白产生了最大似然性系统发育树g .分子亚克拉德I lrr-rlks蛋白质显示出高同源性的蛋白质atsif2.（AT1G51850） （无花果。2）.系统发育树表明，9 GHLRR-RLK与四个非常近的进化关系拟南芥LRR-RLK（图。2）.在这9个GhLRR-RLKs中，一个棉花LRR-RLK (CotAD_41732)与AtSIF亚家族具有很高的同源性。2）.为了进一步了解ATSIFs和九个棉LRR-RLK之间的蛋白质保存，进行了多种序列分析（图。2和附加文件2:数据S1)。结果表明，9个GhLRR-RLKs中只有6个蛋白含有Malectin-like结构域，该结构域也存在于AtSIFs中(图2)。2 b）.LRR域是LRR-RLK中最关键的域之一，因为它提供了LRR-RLK，配体识别和交互的能力[39]．LRR- rlks中高度保守的LRR结构域通常表示功能保守[39]．对这6个含有malectin样结构域的LRR结构域的氨基酸序列进行比较，发现CotAD_41732与atsif的相似性最高，因为它在胞外结构域的同一区域包含两个高度保守的LRR基元(图2)。2摄氏度）.其他棉花LRR- rlks要么包含不同数量的LRR基元(如CotAD_57195, CotAD_44233, CotAD_52119, CotAD_31444)或关键LRR域的间隙(如CotAD_74481, CotAD_06671)，要么大小明显小于atsif(如CotAD_21855和CotAD_74959)(图。2摄氏度)因此，我们在下文中将表现出最高相似性的CotAD_41732称为GhSIF1。

染色体分布GhLRR-RLKs

进一步调查进化历史GHSIF1以及其他GhLRR-RLKs，我们分析了它们在A和D亚因素的染色体分布g .分子(无花果。3.和附加文件1:表S2)。这GhLRR-RLK基因分布在两个亚基因组的所有染色体上，但频率不同。3.）.在543个基因中，A和D亚基因组分别有179和219个基因被证实;而145个基因位于支架上(附加文件)3.：图S1）。A和D亚基因组的9号染色体和4号染色体上分别存在最多32个和46个基因以及最少一个和三个基因（图。3.和附加文件3.:图S1)。GHSIF1位于脚手架1841.1(附加文件3.:图S1和附加文件1:表S2)。

鉴定了共42例串联复制事件（TDES）涉及分布在亚亚亚亚，III，VIII_1，X_4，XI_1，XII_1和XII_2中的110个基因（图。3.）.Subclade XII_1显示了最多14个涉及40个基因的事件，然后是亚麻XII_2，其中12个事件涉及32个基因。在42个TDE中，在8染色体上观察到13个（Chr。3,5,6,8,9,10,12和13）（图。3.)， d亚基因组8条染色体(Chr. 1、3、5、6、9、10、11和13)上发现15条染色体。其余14个tde在10个未指定的支架上观察(Scaffold 2911.1有3个重复事件，Scaffold 235.1和3068.1各有2个重复事件)。总的来说，分析表明LRR-RLKs中存在高比例的串联重复，约占LRR-RLKs的1/5。

基因结构(外显子-内含子组织)分析GhLRR-RLKs

543的外显子-内含子结构GhLRR-RLK基因,包括GHSIF1，根据其亚洲分析并在不同的群体中进行分析和组织。如附加文件所示3.：图S2（A-I），基因的外显子-内含子结构LRR-RLK.基因在亚分支间表现出较高的变异，而在亚分支内，基因在外显子数量、大小和位置上表现出相似的结构。进化支内基因结构的保守性表明LRR-RLK.片中的基因确实在系统发育树中具有非常紧密的进化关系。基于外来内含子结构，GhLRR-RLKs可以分为三组（附加文件3.：图S2 A-I）。所有亚克士I，II，V，VI-2，VIII（1和2）的所有成员，以及大多数亚克斯XIII成员都包含多个但相对较短的外显子，而Subclade III，IV（1和2），VI-1，vii，ix，x（1-4），xi（1-4），亚亚xiii的两个成员CotAD_01838由几个长的外显子组成。Subclade XII（1＆2）基因显示出独特的模式，具有长外显子和短外显子的组合。

蛋白质结构分析

GHLRR-RLKS在其长度范围为234至1878氨基酸残基（AA）（附加档案3.：图S3和附加文件1表S1)，平均长度为~ 855.8 aa，平均分子量为94.2 kDa。亚分支XII中的CotAD_60784蛋白是最小的GhLRR-RLK蛋白，长度为234个aa，最长的蛋白是CotAD_44505蛋白，长度为1878个aa。GhLRR-RLKs的等电点(pI)范围为4.88 ~ 9.622和附加文件1:表S1)。GhSIF1蛋白由874个aa组成，分子量为98.2 kDa, pI为5.07。

为了研究蛋白结构，将每个GhLRR-RLKs分别置于Blast2GO服务器上进行InterProScan域分布分析[40)(附加文件3.：图S4和附加文件1:表S3)。根据Transoscan分析的结果，LRR和蛋白激酶样结构域（KD）是543GHLRR-RLK蛋白中的两个最保守的结构域，而KD在与LRR结构域相比时，KD较少，因为它在CotAd_01838中不存在是系统发育树中的一个异常值（附加文件3.:图S4)。在13个GhLRR-RLKs中鉴定出malectin样结构域，包括GhSIF1(附加文件3.:图S4)。其他蛋白质结构域，如环核苷酸结合结构域（IPR000595），含有核苷三磷酸水解酶（IPR027417），Kinesin Motor结构域（IPR001752），糖苷水解酶超家族（IPR017853），RHO GDP-解离抑制剂结构域（IPR024792），半乳糖结合结构域样（IPR008979），GNK2 - 同源结构域（IPR002902），遍在蛋白结构域（IPR000626），泛素相关结构域（IPR029071）和叶绿素A / B结合蛋白结构域（IPR023329）也被鉴定在一些GHLR中RLK序列，表明GHLRR_RLK可能涉及不同的功能，例如蛋白质结合，Kinesin，糖苷水解酶，ubiquitin相关或轻接收（附加文件）3.：图S4和附加文件1:表S3)。

使用图案对齐和搜索工具的图案分析（http://meme-suite.org/tools/mast.LRR家族(CL0022)中存在8个LRR亚基序(LRR_1, LRRNT_2, LRR_3, LRR_4, LRR_5, LRR_6, LRR_8, LRR_9)， 13个亚分支中存在malectin -样结构域(附加文件)3.：图S5 A-K）[41，但这些领域的分布是高度分散的。其中LRR_1和LRR_8结构域最为丰富，分别在96.3%和71.0%的序列中被鉴定。LRR_3和LRR_5是最罕见的，分别在3.8%和3.3%的GhLRR-RLKs中鉴定出。此外，有相当数量(69.2%)的亚枝I成员在n端具有Malectin-like结构域，而不是LRRNT_2。有趣的是，n端Malectin-like域只存在于亚枝I中，这意味着该亚枝成员比其他亚枝成员具有更多的特殊功能。虽然malectin样结构域也在其他亚分支(III, VIII-2和XI-4)的四个LRR-RLKs中被发现，但它们位于蛋白质的c端而不是n端。391个GhLRR-RLKs由n端不同的信号肽组成(附加文件)3.:图S6 & Additional文件1：表S4），但每个GHLRR-RLK都包括跨膜域（附加文件1：表S4）。蛋白质结构分析表明，GHSIF1由22-AA信号肽，苹果直蛋白样结构域，LRR-8基序，跨膜结构域和细胞内激酶结构域组成（附加文件3.：图S5 A和附加文件1：表S4）。

功能注释和基因本体分析

用BLAST2GO软件进行的细胞分量分析显示542GhLRR-RLK其中538个蛋白定位于细胞部分，其次是细胞器(286个)、膜部分(209个)、共质体(206个)和细胞连接(206个)3.:图S7和“附加”文件1：表S3），而一些蛋白质预计是细胞外（95）。生物过程分析（附加文件3.:图S7和“附加”文件1：表S3）显示了GhLRR-RLKs are involved in ‘cellular process’ (504), ‘response to stimulus’ (502), ‘single-organism process’ (498), ‘biological regulation’ (476), ‘signaling’ (411), and ‘metabolic process’ (410). Some proteins obtained the GO terms ‘developmental process’ (335), ‘multicellular organismal process’ (321), ‘reproduction’ (261), which were followed by ‘multi-organism process’ (168), ‘cellular component organization or biogenesis’ (146), and ‘localization’ (109). Molecular function analysis showed mostGhLRR-RLKS显示的“催化活性”（517），'绑定'（513），'信号传感器活动'（152）和“分子传感器活动”（127）函数（附加文件3.:图S7和“附加”文件1:表S3)。具体的细胞成分、生物过程和分子功能的详细信息被执行并在附加信息中呈现(附加文件)3.：图S8-S10）。具体来说，GHSIF1被预测为脱落酸激活信号通路的负调控因子，表明它可能在非生物胁迫耐受机制中发挥负调控作用(Additional file1:表S3)。此外，BLAST2GO也表示GHSIF1甚至可以对生物压力做出反应(附加文件1:表S3)。

GhLRR-RLK不同器官和纤维发育阶段的基因表达分析

公开获得的棉花转录组数据集来自g .分子TM-1用于研究叶片中的543LRR-RLK基因的表达模式，并穿过不同的纤维发育阶段（ - 3， - 1,0,1,3,5,10,20和25dPa（日柱）航天藻））（图。4和附加文件1:表S5和S6)。通过绘制转录组数据集获得的自归一化对数转换RPKM值，生成亚分支特异性热图，以显示LRR-RLK基因的表达模式(附加文件)3.：图S11）。大多数亚克拉片VI_2，VIII_2，IX，X_2，X_3，X_4，XI_2，XI_3和XI_4的基因显示出在棉花纤维发育的所有阶段表达更高的表达，这表明这些亚亚基因在纤维发育中的潜在作用。然而，I，II，III，IV_1，IV_2，V，VI_1，VII，VIII_1，X_1，XI_1，XII_2和XIII亚基的成员显示了纤维的各个阶段具有低，中等的和高表达水平的基因簇发展。除了一个高表达基因的小亚簇外，属于群体XII_1的大多数基因均低至中等表达。

进一步证实表达LRR-RLK.基因，用26次进行定量PCR分析GhLRR-RLK基因(每个亚枝有两个代表性基因)包括GHSIF1（cotad_41732.)， 5 dpa胚珠，5 dpa纤维。如图所示。5，大部分GhLRR-RLK基因在胚珠和叶组织中的表达量显著高于纤维组织中的表达量CotAD_00571，CotAD_52735和CotAD_71119,在所有三种组织中以类似水平表达。具体来说，CotAD_22753无法在任何组织中检测到，与转录组结果一致。

基因表达与瞬间沉默atsif.同族体棉花

实时PCR结果显示GHSIF1在盐处理的根组织中显着下调（图。6A),类似于拟南芥SIF1和SIF2表示潜在的作用GHSIF1棉花的耐盐性[32]．为进一步研究GHSIF1，我们瞬间沉默了GHSIF1烟草嘎嘎病毒(TRV)介导的病毒诱导基因沉默系统在棉花植株中的表达[42]．371 BP.GHSIF1将cDNA片段插入到TRV-2中至瞬时沉默GHSIF1该区域是从特定的3'UTR（非翻译区）中选择的，因为编码区在这些基因中表现出高度的同源性LRR-RLKs．用PTRV1和PTRV2渗滤十天旧棉花植物，用PTRV1和PTRV2渗透（GHSIF1）以及PTRV1和PTRV2（空）作为控制。叶样品的控制和GHSIF1浸液10天后采集靶向植物进行基因表达分析。的表达GHSIF1在VIGS中显著下调(GHSIF1)，与对照植株比较(图。6B.）.为确保VIGS介导的特异性抑制GHSIF1，另一个基因的表达cotad_21855，这与66％相似GHSIF1对编码序列(CDS)进行分析。基因表达分析表明CotAD_21855在pTRV2(GHSIF1）沉默的植物，表明Vigs系统的特殊性GHSIF1(无花果。6B.）.

评估耐盐性的GHSIF1沉默的植物

在300mM NaCl的情况下评估基因沉默的植物2周的耐盐性2周。棉花植物有GHSIF1与对照植物相比，沉默表现出更好的性能（图。6C.＆d）.结果表明GHSIF1沉默的植物显示出明显较长的芽和比对照植物更多的生物量（图。7）.以前的研究表明，盐胁迫诱导反应性氧物质，这导致叶绿素降解和膜渗透性，导致叶绿素含量的降低和高电解质泄漏[43，44]．结果表明，叶绿素含量显著升高，而电解质渗漏量显著降低GHSIF1沉默的植物比在对照植物中（图。7e.＆f），表明倒闭GHSIF1棉花的基因导致耐盐性增加。

在植物中，LRR-RLK是最重要的膜锚定受体之一，其将痉挛信号转化为Syplast，然后触发下游响应。各种研究表明，LRR-RLK涉及植物中许多基本生物过程，例如植物激素感知，植物发育和对不利环境的反应[14，15，16，17，18，19]．LRR-RLK基因家族中存在大量的基因，由于功能冗余，使得个体成员的功能鉴定变得困难。拟南芥由于它们相对较少的数量和遗传和基因组资源的可用性，为LRR-RLK基因的功能表征提供了优秀的典范。我们之前已经确定并表现出来拟南芥SIF2，盐耐盐性的负调节器[32]．目前的研究确定了一个同系物atsif.通过系统发育分析和功能性地表征在使用瞬时基因沉默系统中耐盐性的作用。

棉花LRR-RLK基因家族构成了植物王国最大的基因家族之一

由于其在信号转导，植物发育，光学发生和非生物/生物/生物应激反应中的不同作用，LRR-RLK构成了植物和动物王国中最大的基因家族之一。本研究确定了543LRR-RLK基因，数量远大于二倍体植物种类拟南芥（234）和大米（309）。它也比古多倍体大豆（467）和异源六倍体小麦（531）大[12，24，28，30.]．这种大量基因可能是由于棉花的复杂的同种异体外基因组和长进化史以及诸如专业纤维的复杂性状。除了复杂的基因组之外，棉花在植物王国中生产最长的单细胞，由〜96％纤维素组成，需要精确发育调节。

种植棉花(g .分子)是一个异源四倍体生物体，是两个二倍体亲缘祖先杂交的结果G. Arboreum.(AA)和G. Raimondii.(DD) [45]．两个祖细胞中的每一个都提供了一组13染色体g .分子导致栽培的植物基因组加倍g .分子（一种_t一个_tD_tD_t；2n= 4× = 52) [46]．染色体位置的分析提供了关于基因对特定染色体的位置的信息。但是，它不提供关于其起源的性质的信息，因此我们进行了基因重复分析。染色体分布分析表明，分布模式LRR-RLK.a亚基因组和d亚基因组的基因非常相似(图2)。3.和附加文件3.：图S1）在数量和位置而言。然而，A-和D-子组织上的LRR-rlks的数量不等于，因为亚亚组携带179个基因，而D-亚基因携带219个基因，这可能是由于杂交前的父母类二倍体物种的独立演变四倍体物种。

LRR-RLK蛋白质结构的多样性和功能意义

外显子-内含子结构分析显示各亚枝之间具有保守的模式，而蛋白质基序分析显示同一亚枝内的蛋白质成员具有相似的基序、定位模式和潜在的相似功能(附加文件)3.：图S2 A-I和附加文件3.:图S5 A-K)。例如，细胞外Malectin-like结构域(IPR024788)有助于识别内质网的glc - n-聚糖并与之结合[47]．在拟南芥，所有具有n端malectin -样结构域的LRR-RLKs被归为亚枝I，其中一些已被证实参与了生物抗逆性[48，49]．细胞外n端Malectin-like结构域是一种复杂的结构，为蛋白质提供识别和结合内质网glc - n-聚糖的能力拟南芥含有该结构域的LRR-RLK蛋白已被证明参与生物应力阻力[47，48，49]．同样，在棉花中，9个LRR-RLKs中鉴定出n端malectin样结构域，系统发育分析均属于亚分支I。由于LRR-RLK蛋白的功能多样，这些蛋白都有专门的功能专一域。例如，胞外LRR结构域允许RLK感知特定配体，跨膜结构域允许RLK牢牢地锚定在质膜上，而蛋白激酶样结构域提供其磷酸化能力，允许RLK将信号转导到下游信号通路。在存在细菌病原体时，LRR结构域拟南芥BAK1将立即与另一个LRR- rlk蛋白FLS2的LRR结构域形成复合物[13]．由该细胞外复合物引起的构象变化将激活Bak1的激酶结构域自身磷酸盐本身，然后转膦酸化酸酯胺域的FLS2，然后激活下游信号级联[50]．

LRR-RLK涉及棉花中多种生物过程

LRR-RLK基因家族是棉花中涉及多种功能的多基因家族，但数量很少GhLRR-RLK基因已经在功能上表现出[34，35，36，37]．生物过程分析表明GhLRR-RLKS具有多种分子功能，例如对刺激（502），生物调节（476），信号传导（411），代谢过程（410），发育过程（335）和再现（261）的响应，这为植物开发中的潜在功能强调，通过信号转导机制（附加文件）的环境应力，新陈代谢和繁殖3.：图S7）。此外，棉是独特的，在生产具有来自种子涂层表皮细胞的高度专用的单细胞的高度专用单细胞中。这些细胞遵循具有初级和次级细胞壁沉积的独特发育模式，导致〜96％纤维素的沉积。已显示LRR-RLKS参与棉花纤维开发以及棉花中的细胞壁生物合成。ghrlk1.在开发棉纤维中诱导，预计涉及棉纤维中的二次细胞壁合成[34]．公共可用数据集的RNASEQ分析（图。4和附加文件3.：图S11）显示，在大多数纤维发育阶段，属于亚类VI_2、VIII_2、IX、X_2、X_3、X_4、XI_2、XI_3和XI_4的LRR RLKs基因高度丰富，而属于亚类I、II、III、IV_1、IV_2、V、VI_1、VIII、VIII_1、X_1、XII_2和XIII的基因表现出可变的表达模式。此外，对叶片、5 dpa纤维和5 dpa胚珠中26个基因的实时RT-PCR表达分析表明，这些基因中的大多数在所有三种组织中均有表达，但在叶片中的表达显著高于胚珠（图。5）.出26个基因，CotAD_22753在这三种组织类型中的任何一种中都无法检测到CotAD_00571，CotAD_52735,CotAD_71119在三种组织中表现出一致的表达（图。5）.

GHSIF1棉花耐盐性是负调控因子吗

由于LRR-RLK基因家族和功能冗余中存在大量基因，对其在植物生长，发展和压力反应中的作用的完全了解落后。在拟南芥，只有35个基因具有功能特征[12这表明LRR-RLK家族基因功能特征的复杂性。这些基因在四倍体棉花中具有更大的基因家族和更长的生命周期，并且存在转化障碍，因此很难对这些基因进行功能分析GhLRR-RLK基因在棉花。本研究对棉花LRR-RLKs进行了全面的分析，有助于利用翻译研究和先进的功能基因组学工具对棉花基因进行快速鉴定和表征。特别是，有了特征的信息拟南芥基因，可以预测和功能表征各自的棉花同源基因。我们最近发现了一个AtLRR-RLK基因家族的亚家族(SIF基因家族;SIF1-SIF4)，这被证明与生物和非生物的应激反应有关。特别是，敲出SIF1和SIF2显著提高了小麦的耐盐性拟南芥［32]．有趣的是，系统发育分析使用拟南芥SIF基因家族显示只有一个基因，GHSIF1有非常密切的进化关系AtSIFs(无花果。2）.通过产生高度特定的vigs构建目标GHSIF1，我们已经对其在棉花耐盐性中的作用进行了功能表征，为利用翻译研究快速表征棉花基因的功能铺平了道路。瞬时沉默的棉花植株耐盐性增强GHSIF1,类似于AtSIFs在拟南芥，是植物盐耐受性的负调节剂（图。5，6和7）.由于核批分，苛刻，耗时稳定的稳定性，瞬态表征对于基因的快速功能表征是高度实用的。

本研究对四倍体棉花LRR-RLK家族基因进行了全基因组分析g .分子最终鉴定出543个GhLRR-RLKs。542个GhLRR-RLKs被归为13个亚分支，其余1个蛋白CotAD_01838未归为任何亚分支。这些GhLRR-RLK共鉴定出42个串联重复事件，涉及110个基因。我们的结果还表明，每个LRR-RLKs亚分支都具有独特的基因结构和蛋白质结构。基因表达分析和功能注释表明GhLRR-RLKS在不同的组织或细胞类型中都有时空表达，并可能参与各种生物过程。通过全基因组分析和系统发育分析，鉴定出6个拟南芥棉花中的SIF同源物。其中GhSIF1与AtSIF亚家族的氨基酸序列保守性最高。功能研究表明，大豆的耐盐功能GHSIF1是守恒的,atsif1和atsif2。这提供了沉默的绝佳机会GHSIF1使用基因组编辑技术开发耐盐性棉花GHSIF1是盐耐受性的负调节因子。

鉴定LRR-RLK基因家族g .分子

对于旱地棉花的LRR-RLK基因家族的In-Silico鉴定，g .分子参考基因组数据从The Cottongen数据库下载（https://www.cottongen.org/data/download/genome） [46，51]．拟南芥LRR-RLK家族234个基因ID来自以前的报告，其蛋白质序列来自TAIR10数据库(https://www.arabidopsis.org/） [11，12，52]．BLASTP相似性搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download）对此进行g .分子参考蛋白质组数据使用拟南芥LRR-RLK家庭蛋白序列作为默认参数的查询，具有10的电子值⁻¹⁰．通过在线HMMSCAN搜索工具（Hmmer;）分析从BLASTP搜索获得的非冗余蛋白序列用于存在富含亮氨酸的重复（LRRS）和激酶域（HMMER;https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan） [53]和NCBI的保守域数据库（CDD;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） [54]．此外，使用在线可用的TMHMM server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/tmmm/） [55]．陆地棉具有最少1个LRR重复序列、激酶结构域和跨膜螺旋结构的蛋白序列被归为一类GhLRR-RLK基因家族成员，用于进一步表征。对于确定的GhLRR-RLK基因，我们继续使用参考基因​​组中提供的原始基因ID [46]。

GhLRR-RLK蛋白的系统发育分析

根据其序列相似性进一步分类为亚克士拟南芥LRR-RLK蛋白，使用分子进化遗传学分析(MEGA) v6.06对GhLRR-RLK家族成员进行系统发育分析。棉花LRR-RLK蛋白(543)和拟南芥（234）使用MEGA v6.06的ClustalW序列比对程序进行多重比对[56]默认参数。此外，使用邻近接合（NJ）方法用Mega V6.06构建系统发育树。引导复制1000以及其他默认参数（系统发育重建，替代类型：氨基酸，型号/方法：P距离，位点之间的速率：均匀的速率和间隙缺失数据处理：部分缺失）用于产生系统发育树。基于先前分类的存在拟南芥LRR-RLK蛋白质，分支分为23 LRR-RLK子组。在Phyloonsy.fr服务器上进行ATSIF系列和GHLRR-RLK亚克拉亚核苷酸的系统发育分析（www.phylogny.fr.） [57]．

物理性质，基因结构和染色体定位分析

确定棉花LRR-RLK.将基因分为亚分支，并进一步分析其特征。从参考基因组数据中检索基因长度、蛋白质大小、染色体的位置和定位。其他物理性质，如LRR-RLK蛋白的理论pI和分子量，使用ExPASy服务器的Compute pI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/）.进行染色体定位分析，取棉花染色体坐标LRR-RLK.基因被绘制在g .分子分别使用Mapchart 2.30软件分析A-和d -亚基因组特异性染色体。在基因结构分析中，每个基因的外显子-内含子坐标GhLRR-RLK基因是从.gff文件和使用基因结构显示服务器2.0 [58]．

棉花LRR-RLK基因之间的重复

之间的串联复制LRR-RLK.通过比较它们在染色体/支架上的位置来分析基因家族。具有最大一个基因中断的相邻基因被认为是串联重复的基因。在一些情况下，如果在1 MB区域内，则最多被两种基因中断的相邻基因也被认为是串联重复的。

蛋白质结构分析，结构域分布和注释分析

共543例进行InterProScan域和Blast2GO注释分析g .分子根据软件说明书使用Blast2GO工具套件进行LRR-RLK蛋白序列分析[40]．用基于主题基于序列分析在线工具的MOTIF对准和搜索工具分析GHLRR-RLK蛋白的细胞外结构[59]．参考基序(LRR分支结构域和malectin样结构域)取自NCBI的保守蛋白结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/index.shtml）.信号肽在SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp//） [60]．使用SignalP 4.1服务器上的TMHMMSServer V.20执行跨膜域分析。

中硅基因表达分析GhLRR-RLKs

转录组数据集是从NCBI的简短读取归档（SRA）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）对于不同的棉纤维发育阶段（ - 3， - 1,0,1,3,5,10,20和25dPa）和叶子g .分子TM-1（附加文件1：表S5）。来自不同数据集的读数映射了GhLRR-RLK利用DNASTAR Lasergene包的QSeq程序(http://www.dnastar.com/t-nextgen-qseq.aspx.）.使用MEV创建各个子组的分层群集Heatmaps（http://mev.tm4.org/#/welcome)使用QSeq程序计算的自规范化日志转换RPKM（每千基每百万次读取数）值。除此之外，另一张热图显示了所有棉花的表现LRR-RLK.基因是使用QSeq热图选项创建的。

植物生长、RNA分离、cDNA合成及定量PCR分析

g .分子TM-1种子在土壤上发芽，在生长室内(Percival, Perry, Iowa)，在28°C的16 h-light/8 h-dark光周期下生长，然后移入温室成熟生产棉纤维。根据制造商的说明，使用Spectrum植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich, USA)从100 mg植物样本中分离植物总RNA。按照说明书使用iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (Bio-Rad, USA)合成第一链cDNA，总RNA为1 μg。根据制造商说明，使用FastStart Essential DNA green Master(罗氏，瑞士)进行实时PCR。采用瑞士Roche公司的LightCycler 96进行实时PCR实验。采用ΔΔCt方法计算实时PCR结果[61]．

质粒结构和瞬态基因沉默

pTRV2 (GHSIF1）质粒结构，371bp 3'UTR片段GHSIF1cDNA从g .分子NEBNext Q5高保真聚合酶(NEB，美国)cDNA池。pTRV载体从TAIR (https://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/vector_3.html） [62]．3'UTR区域GHSIF1仔细选择以避免VIGS系统的失靶。用于扩增cDNA片段的引物为正向引物5'-AAATCTAGATCAATCATAAATTGATCCTTTC-3'，带有XBA.酶切位点，与引物5 ' - aaagagctcaattcttttacaaaaaagccatc -3 '配合囊我限制网站。然后用pCR产物用Xba我和囊并亚克隆到双元载体pTRV2中，用相同的酶切酶切得到2 × p35S/CP/GHSIF1/Rbz/编号pTRV1、pTRV2（空）和pTRV2(GHSIF1)质粒然后被动员成农杆菌肿瘤术用于病毒诱导的基因沉默的菌株GV3101。在公开的议定书后进行病毒诱导的棉花的基因沉默[63]．

测定叶绿素含量和电解质泄漏的测量

为了测定叶绿素含量，从生长室从棉花植物中收集300mg最小的叶样品。然后将叶片样品切成小块并使用液氮将其研磨成细粉末，然后用5ml 80％丙酮转移至15ml猎槌管，用于叶绿素提取。在室温下孵育30分钟后，将缩斗管在4℃下以3000rpm离心15分钟，然后用10ml 80％丙酮转移到50ml猎鹰管中，并在黑暗中保持叶绿素含量确定了。

用分光光度计分别在645 nm和663 nm处测定提取物的吸光度，叶绿素浓度计算公式如下:

其中：v =提取物的体积（ml）;W =叶样品的鲜重量（mg）。

为了测定电解​​质泄漏，从最小的叶片切割新鲜的叶片并浸入5ml去离子水中。然后将样品在32℃温育2小时，使用电导率计（Fisher Scientific）测量电导率值并作为EL1签名。然后将样品在95℃-100℃下煮沸20分钟，并在样品达到室温后测量电导率值（EL2）。

统计分析

Student t检验用于确定不同数据组均值之间的统计显著性差异。P< 0.05，差异有统计学意义，标记为*。P < 0.01具有统计学高度显著性，标记为**。

AA:

氨基酸残基

BAK1：

芸苔类固醇不敏感的1-缔源受体激酶1

BKK1：

Bak1样1

cd:

编码序列

CR4类：

Crinkly4 Class Rlk.

DPA：

花后第二天

FLS2：

鞭毛敏感2

KD:

蛋白质kinase-like域

LRR-RLKs:

亮氨酸丰富的重复 - rlks

兆:

分子进化遗传学分析

NJ:

Neighbor-Joining

PI：

等电点

PR5-RLK：

pr5样rlk

rlks：

受体样蛋白激酶

SERKS：

体细胞胚胎发生受体激酶

SIF:

应力诱导因子

SRA:

短读存档

S-RLK:

S-Domain RLK

TDE：

串联重复事件

TRV：

烟草使病毒

UTR：

翻译区

中收取:

病毒诱导的基因沉默

WAK:

墙壁相关激酶

我们要感谢植物与科学系对这项研究的部分支持。

资金

本手稿中描述的这项研究部分由棉花纳入核心项目第18-092号核心项目部分支持。资金机构在研究设计，数据收集和分析或准备内没有作用。

可用性数据和材料

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

从属关系

1. 德州理工大学植物与土壤科学系纤维与生物聚合物研究所(FBRI)，德克萨斯州卢伯克79409

   Ning Yuan, kishan Mohan Rai, Vimal Kumar Balasubramanian & Venugopal Mendu

2. 旁遮普大学植物系，印度昌迪加尔160014

   Santosh Kumar阿帕德海耶

3. 克莱姆森大学遗传与生物化学系，克莱姆森，SC，29634，美国

   香港罗

贡献

VM构思了本研究并设计了实验。NY、KMR和VM进行生物信息学分析，NY进行基因功能鉴定。NY, KMR, SKU, HL, VB, VM撰写稿件。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Venugopal Mendu．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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