花蜜获得和损失的单向转变表明食物欺骗是一种稳定的进化策略gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba(兰科):解剖学和分子证据的见解gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

花蜜增益和损失是在Agiospers中观察到的重要花卉转变，在兰花中特别常见。为了理解这种转变，详细解剖数据和物种级化学生理学的可用性至关重要。我们调查了食物欺骗的演变gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba利用属系统发育学来绘制不同支系间花蜜获得和损失之间的转变图。利用27个种的新鲜材料，研究了解剖和组织化学变化与花蜜获得和损失之间的关系。花蜜的出现/消失在gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba利用GenBank上的1个核和5个质体DNA区域，对47个物种进行系统发育研究，并进行了测序。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

花蜜的有无与蜜腺内表皮组织的变化密切相关。分泌花蜜的物种表皮组织没有纹饰，与食物欺骗物种表皮上的单细胞毛状体相反。贝叶斯测试证实，花蜜的存在和花蜜的缺失优先发生gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba系统发育。此外，在系统发育中发现了独立的花蜜损失事件，表明这些过渡的限制缺乏约束。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

观赏蜜腺通过分泌挥发性有机化合物和为传粉者提供触觉刺激，可能在欺骗性授粉策略中发挥重要作用。花蜜丧失在花蜜中反复发生且明显不可逆的模式gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba这表明，食物欺骗可能构成了另一种进化稳定的策略，就像在其他兰花群体中观察到的那样。gydF4y2Ba

碎花回报是被子植物中最显眼的调整之一，打的吸引力和授粉的维护[核心作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．然而，许多物种通过模仿与食物、性伴侣或产卵地点有关的信号来欺骗它们的传粉者。花卉回报的丧失对植物种群有几个生物学意义。一般来说，传粉者通过访问遥远的植物来避免无回报的花朵，加强种群间的遗传交换，从而减少种群的遗传结构[gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba和同性通婚的程度[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．该添加人工花蜜rewardless花卉研究中观察到坐果和自花授粉[一个显著上升gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．根据Johnson等人[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，当传粉是常见的朝向rewardless品种选择是有利的，而当传粉是稀缺选择花蜜生产。gydF4y2Ba

兰花通过多种方式欺骗传粉者，但普遍的食物欺骗是最常见的策略[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．尽管许多种缺乏花蜜，但蜜腺在该科中广泛存在，在形态、解剖和位置上表现出广泛的变异。蜜腺可与唇愈伤组织、唇距、柱体或由唇、柱体和萼片边缘融合形成的花蜜距相结合[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在莱利亚科的几个属中，柱下有一个蜜腺状结构，称为珠座。库珠是一种花管，起源于唇爪和柱的融合，并穿过花梗在子房和花被管之间(附文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。有杵状突起常与gydF4y2Ba鳞翅类gydF4y2Ba授粉，这是常见的gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2BaL.（由[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba])。很少有解剖学研究深入研究这种结构(但见[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，以及花蜜是否在结构中存在，在许多物种中是未知的。在gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba，花蜜只在肿胀的鼠爪中发现，其中有丰富的花蜜是明显的[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．因此，有回报和无回报gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种只有通过观察花蜜中游离花蜜的可得性才能区分[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了理解食物欺骗的进化过程，详细的解剖学数据被绘制到系统发育中，揭示了不同进化支获得和失去花蜜之间的转变。缺少花蜜是兰科植物的一个潜在的祖先特征，因为在祖先属中缺少花蜜gydF4y2BaApostasiagydF4y2Ba和gydF4y2BaNeuwiediagydF4y2Ba，提供花粉作为奖励[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．在家族内部，在不同的进化枝中观察到独立和可逆的转变。有一些群体，食物欺骗是祖先的状态，如在Orchideae部落[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，花蜜奖励从食物欺骗中进化而来的例子，就像在属中观察到的那样gydF4y2BadisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),gydF4y2BaAnacamptisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．花蜜的增加或减少可能导致不同的解剖反应。转变可能与蜜腺的深层结构变化有关，正如在兰花亚族中观察到的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，或可能导致观察到的模式gydF4y2BadisgydF4y2Ba，在产蜜种和无蜜种之间观察到的表皮变化很少，表明亚细胞修饰可能控制产蜜[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在本研究中，我们对花蜜奖赏的进化进行了研究gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba，大约有1500种，被认为是新热带地区最大的植物属之一[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．花蜜的存在/缺乏gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba仅基于对蜜腺的视觉检查的基于种类的种类，并且在该属中很少报道详细的组织化学和/或解剖学分析[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．由于明显缺乏花蜜，许多作者认为食物欺骗是普遍存在的gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba（由[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba])。从不同数据来源收集的间接证据被解释为表明存在食品欺骗策略的集体证据。传粉者在访问一朵花后放弃花序的短暂访问时间[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，低果座[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，以及种群间核遗传结构的缺失[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]可能表明在被分析的物种中存在食物欺骗。根据(gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba]兰花中的食物欺骗往往会减少花粉师在同一开花中花费的时间，降低了锗酰胺和水果套的水平。尽管有规定的花蜜，但没有gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba已经提交了物种，详细解剖分析旨在探索土壤内部的表皮组织的结构和性质，或尾蚴。gydF4y2Ba

由于该属的大小，我们的研究集中在一个较小的分支，组gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba(美国标准gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]），其基于扩增的片段长度多态性（AFLP）指纹和塑性标记物具有先前的系统发育假设[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．对该亚属新的核和质体区域进行测序，以获得一个健壮的系统发育假说，并研究该亚属内主要分支的分化时间。利用立体显微镜和扫描电镜对所有物种的蜜腺进行了详细的解剖观察。本研究的主要目的是利用一个过时的分子系统学方法来研究花蜜奖赏在类群中的进化gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba和选择gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种识别生产花蜜和不锈素种类。解决了以下具体问题：（1）本集团在物种多样化的时间和节奏是什么gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba？(2)花蜜和特定的蜜腺类型在群体中进化了多少次?(3)解剖上的变化是否与花蜜产量的增加和减少有关?总的来说，本研究支持了花蜜损失的周期性和单向演化gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba蜜腺，其解剖特征与泌蜜种蜜腺不同。gydF4y2Ba

结构和鉴定尾蚴腺体gydF4y2Ba

EpidendrumgydF4y2Ba种具有沿花被管和花梗子房之间的花柱管定位在cuniculus（腺腔室）（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。所述cuniculus的内表皮总是腺，并且其内腔物种之间变化，并且在花蜜生产结构更宽。在这里，我们花开花描述的腺体分泌的阶段。四种腺体形态（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba(1)表皮几乎一致，没有毛状体、气孔或角质层破裂(称为“普通表皮”)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba）和三种腺体单细胞毛状体;（ii）由分泌乳头的短胞细胞组成（图。gydF4y2Ba1 hgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BapgydF4y2Ba，gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba）;(iii)中等毛状体(无花果;gydF4y2Ba1问gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BavgydF4y2Ba，gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba）;及(iv)长毛状体(Figs。gydF4y2Ba1 wgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BazgydF4y2Ba，gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，至少是中等长度的两倍。gydF4y2Ba

几乎所有能产生花蜜的花都会产生大量的分泌物，足以用葡萄糖条检测。的渗出液gydF4y2Ba大肠densiflorumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba大肠mirmecophorumgydF4y2Ba，gydF4y2BaE.夜来香gydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba大肠vesicatumgydF4y2Ba测试的正面为还原糖。这些物种的脑炎微孢子虫，以及普通的表皮类型的剩余的显示出阳性结果用于减少在表皮和实质（通常是三个细胞层）的液泡的糖，因此被确定为花蜜腺（图gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

无论大小，腺状毛都有厚的角质层和细胞壁。此外，值得注意的是，1 - 3层厚角组织构成了表皮下区域(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．所有腺毛状体和厚角组织中还原糖的缺失也很明显(图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)．相反，在透射电镜下观察到毛状体原生质体中出现亲脂液滴(图。gydF4y2Ba2 jgydF4y2Ba，gydF4y2BakgydF4y2Ba)，表明这些腺体可能起渗透压作用。综上所述，无纹饰的楔形囊均有分泌花蜜的迹象，而纹饰楔形囊未见花蜜的迹象。该模式被用于绘制系统发育树的祖先状态图，并推断该属存在食物欺骗策略gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba(见下文)。gydF4y2Ba

散度的时候gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba演化支和物种gydF4y2Ba

基于组合数据集的第一（初级校准）和第二（二次校准）分析的贝叶斯推广产生了很大程度上的拓扑，在重复运行中证明稳定。追踪器发现所有贝叶斯运行的所有参数的稳定稳定的可能性，平滑分布和高效样本尺寸。分区数据集的贝叶斯推论（主要校准= MATK和RBCL;辅助校准= MATK，RBCL，TRNL-TRNF，TRNT-TRNL，RPL32-TRNL，及其）产生了最良好的良好的树木（附加文件gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba:图S2，图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

兰科化石校准松弛分子时钟分析的最大可信度树显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2。不同支系和分支的支持值都很高，只有少数BPP值低于0.90。我们的年龄估算表明，兰科亚科和Epidendroideae在始新世开始分化，分别为51.6 Ma和42.2 Ma(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。高等附线类的多样化似乎开始于渐新世，大约。34.5 Ma。我们的年龄估计还表明，Laeliinae亚部落的多样化开始于早中新世，大约。20.1 Ma。gydF4y2Ba

高附体类的校准松弛分子钟分析的最大可信树，重点是Laeliinae亚族和属gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba，如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．支系的支持值较高，包括gydF4y2BaEncycliagydF4y2Ba，gydF4y2Ba洋兰gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaMeiracylliumgydF4y2Ba， BPP > 0.90。所有gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba种聚在一起，具有较高的支持值(PP > 0.90)，支持该属的单生。但除类群外，属内大部分分支分辨率较低，BPP < 0.90gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba．组内支持值较高gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba，只有由gydF4y2Ba大肠radicansgydF4y2Ba和gydF4y2Ba大肠flexuosumgydF4y2Ba显示支撑值低于0.90 BPP。Pinheiro等人(2009a)发现的非正式支也出现在我们的分析中。观察到四个主要进化枝，安第斯进化枝(gydF4y2Ba大肠calanthumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba大肠ibaguensegydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba大肠macrocarpumgydF4y2Ba)，它是gydF4y2BaTuberculata.gydF4y2Ba（gydF4y2Ba大肠cochlidiumgydF4y2Ba，gydF4y2Bae .依照gydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba大肠xanthinumgydF4y2Ba)和大西洋分支(gydF4y2BaE. Cinnnabarinum.gydF4y2Ba，gydF4y2BaE.牙本质gydF4y2Ba，gydF4y2BaE. Flammeus.gydF4y2Ba，gydF4y2BaE. fulgensgydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba大肠puniceoluteumgydF4y2Ba)，形成的枝gydF4y2Ba大肠orchidiflorumgydF4y2Ba和gydF4y2Ba大肠purpureumgydF4y2Ba，这是姐姐到剩余的物种（图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．根据我们的年代，属gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba在后期后期开始，大约12 mA开始了多样化。团体gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba在上新世早期，大约5.3 Ma开始多样化。gydF4y2Ba

花蜜的存在/没有转换gydF4y2Ba

祖先状态重建表明是单向的转变，大多数物种的最常见祖先状态是花蜜存在(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．从NA到NP(最小值0，最大值1，平均1.48)的转换数低于相反情况(最小值2，最大值9，平均5.06)。事实上，MCMC分析证实了限制模型的对数似然，只允许从NP到NA (gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_10gydF4y2Ba），显着优于不受限制的模型或限制模型，允许仅从NA到NP转换（gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_01gydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．花蜜的存在是大多数被检测到的祖先特征状态gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba种类，即使在植物中，也嵌套有蜜腺生产物种。群体的祖传人物gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba是不确定的，因为花蜜的存在作为这个分支的祖先特征状态在只有35%的树中被恢复。然而，在组内观察到不同的情况gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba，大多数种不产花蜜，几乎所有支系的原始祖先状态都是花蜜缺失。gydF4y2Ba

我们研究了Hágsater等人在文献中描述的1100种gydF4y2BaIcones OrchidacearumgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S2），和一个光滑的内表面的表皮是在cuniculus观察（缺乏大多数种的表皮单细胞毛状体）。一个装饰cuniculus在113种中（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S2)，表明约10.3%gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种不产花蜜。gydF4y2Ba

无回报物种的进化可能有几个生物学意义，比如改变传粉者的行为、基因交换的模式、生殖隔离的类型和物种形成的速度。这些暗示在一些兰花类中尤其广为人知，如兰科亚科[gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．充分采样的系统发育和详细的解剖分析为了解无蜜物种是如何进化的提供了重要信息[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．这种信息数据集的可用性在理解令人无知的物种的演变方面是一项重大挑战。在这项研究中，使用DNA序列和Nectary解剖学的数据集来研究令人无知的物种的演变gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba，映射随着时间的推移映射花蜜产生和不锈素种类的过渡。gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba是一个单系群体，在晚中新世开始多样化，可能是从一个分泌花蜜的祖先(Figs。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．泌蜜种和无蜜种之间的转变沿着不同的时间间隔独立发生了几次。转变明显是单向的，花蜜的存在是大多数进化支最可能的祖先状态(表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．尽管在系统发育过程中发现了一些得失，但几乎所有物种都来自群gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba显示无报酬的花朵。通过比较近缘产蜜种和无蜜种的组织形态，发现产蜜量的增加或减少之后是主要的组织学变化(Figs。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)．花蜜分泌物种展示了尾蚴的均匀，未被粗糙的内表皮，具有还原糖的迹象，表明花蜜分泌。相比之下，在不锈石种类的Cuniculi中发现了腺体单细胞毛细胞。这些毛状体被鉴定为渗透镜，并且可以通过发信号推出推定奖励来发挥引用传染媒介们的重要作用。在欺骗性物种中的腺体单细胞胎儿的复发起源表明会聚功能演化，通过广泛的缺乏与花蜜损失相关的形态约束来实现，如在其他兰花组中所观察到的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多元化和金刚过渡的时间gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba

属gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba在晚中新世(约为晚中新世)开始多样化。12马,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，与安第斯山加速隆起的时期相吻合[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．事实上，兰花科在晚中新世也发生了主要的多样化率变化，而侧索龙科在安第斯山脉大抬升后沿海拔梯度发生了多样化[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．Givnish等人[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]亦强调附生习性、鳞翅目传粉和热带科迪勒拉属的发生是促使兰花多样化的重要因素。gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种分享上面讨论的大部分特征，很可能有多种生态司机对该属在该属中观察到的广泛多样化。最多gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种安第斯区域沿不同高度发生如在潮湿的森林附生和鳞翅目[授粉gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们的解剖学资料清楚地将产蜜的物种与无装饰的cunulus联系在一起，这是一个普遍的特征gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba．在1100个被分析的物种中，只有10.3%的物种有花蜜纹饰，这可能意味着花蜜的缺失。因此，与以前的报告相反[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，产生花蜜的花可能是这个属的规律而不是例外。然而，这一结果需要仔细的解释和进一步的确认，在属的研究，因为我们的样本非常有限，考虑到属的大小gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

无报酬的花如何促进物种形成一直是文献中争论的问题。Inda等[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]和givnish等人。［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba探讨了兰花多样化率增加与欺骗授粉发生之间的潜在联系。这些作者集中讨论了兰花亚科的不同属，欺骗策略的进化结果是众所周知的[gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba］．在gydF4y2BadisgydF4y2Ba，欺骗性和奖励物种之间的过渡并没有改变样本率[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．物种水平的系统发育揭示了欺骗性授粉系统和奖励授粉系统之间的转变并没有受到强烈的限制[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．因此，无报酬的物种可能会在特定的生态环境下进化，如花粉限制，并由不频繁的传粉者访问产生。另一方面，观察到的高水平的物种多样性gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba这可能是与无回报物种相比，产蜜物种具有高水平的遗传分化的结果[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．来访的花蜜产生物质时，植物种群间的遗传越来越发散的水平授粉限制它们的觅食范围。gydF4y2Ba

从组物种gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba嵌套在上新世早期开始分叉的支中(5.3 Ma，图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．蜜汁除了所有物种一直缺席gydF4y2Ba大肠orchidiflorumgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在系统发育过程中，进化过程明显不对称，从有花蜜到没有花蜜优先发生性状变化(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，分泌花蜜的物种并不是从缺乏奖赏的祖先进化而来的，这表明食物欺骗可能构成了另一种进化稳定的策略，正如在其他兰花群体中观察到的[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．众所周知，这些物种能够在恶劣的环境中茁壮成长，比如裸露的岩石、沙丘和贫瘠的土壤[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．花蜜生产消耗大量能量，花蜜损失可能代表压力栖息地的选择性优势，例如来自组的种类的那些gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba被发现。安东内利等人也观察到了类似的模式[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba在一群中gydF4y2Ba洋兰gydF4y2Ba物种(以前gydF4y2BaHoffmannseggellagydF4y2Ba)．所有这些物种都具有食物欺骗性[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，它们集中出现在极其缺乏营养的石英岩土壤和岩石中。不产花蜜还有其他潜在的好处。例如，在食物欺骗兰花中普遍观察到的传粉者分享的增加可能会弥补昆虫群落的强烈波动[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．食物欺骗物种通常表现出较弱的种群遗传结构，因为当无花蜜的花朵被拜访时，传粉者会抛弃种群，远距离运输花粉，增加种群间的基因交换[gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．此外，杂交在食源性欺骗性物种中也很常见gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．种间基因交换可以通过渐渗交换适应基因来增加物种对紧张生境条件的适应反应，正如在其他植物类群中观察到的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．因此，食物欺骗可以构成特别是生态条件的替代进化稳定的策略[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，增强种内和种间的基因交换，降低杂交物种灭绝的风险。gydF4y2Ba

泌蜜和无蜜种的解剖变化gydF4y2Ba

观察蜜腺的结构(见图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 gydF4y2Ba)的描述不同于现有的关于爪的描述gydF4y2BaBrassavola鞭毛gydF4y2Ba(Laeliinae;［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)，其结构与文献中所鉴定的渗透体相似gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba单细胞毛状体排列的种。然而，分泌物中还原糖的存在，无疑地表明这些腺体是蜜腺[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．蜜腺类型和无毛状体、气孔或角质层破裂表明花蜜是由角质层孔从产蜜细胞中释放出来的[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．事实上，覆盖在蜜腺细胞上的角质层可能是完全可渗透的，允许花蜜的重新吸收gydF4y2Ba二叶舌唇兰gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),gydF4y2BaEpidendrum vesicatumgydF4y2Ba（Cardoso-gustavson，pers。obs。）。gydF4y2Ba

在兰科的IS中，渗透镜通常由单层表皮细胞形成，或者可以具有分泌毛细胞[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在这里，所有带有毛的楔形物，无论它们的大小，被确定为渗透体。这种鉴定是基于原生质体中存在许多亲脂液滴，通过透射电镜可见。亲脂液滴(当涉及细胞质中的液滴或液泡中的酚类化合物时，也分别称为脂滴/体或亲脂包涵体;［gydF4y2Ba33gydF4y2Ba])是渗透剂的典型特征，可在不同的兰花属中辨认出来[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．这些液滴最终可以在一些蜜腺中观察到(见[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba])，但可能只限于分泌的特定阶段[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．蜜腺包括单细胞的毛状体形似gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba渗透载体的描述见gydF4y2BadisgydF4y2Ba(Disinae;［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba])。事实上，腺体参与了兰花群中授粉系统的进化[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，构成无蜜花向产蜜花过渡的基本功能成分[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

原生质体中亲脂液滴的出现与挥发性有机化合物(VOC)的低极性直接相关[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba构成了花所散发的花香。事实上，在我们分析的物种中，只有无蜜蛾授粉的物种具有可用的花VOC分布gydF4y2BaEpidendrum ciliaregydF4y2Ba［gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，其中萜类化合物的出现是显著的。萜类物质的出现与细胞质中的亲脂液滴有关[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，这证实了我们基于腺毛中大量这种结构对渗透体的识别。靠近毛状体的受限腔状环境可能含有最高浓度的挥发性有机化合物，它们通过cunculus向大气中的扩散可能是传粉者的线索。从这个意义上说，楔花可以作为VOC的载体，与花蜜载体(即花蜜在释放前被限制的地方)的作用相同[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．因此，culculus可能为传粉者提供触觉和嗅觉刺激，增强它们的吸引力和探索行为，这在其他兰花类群中得到了建议[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

花蜜丧失在花蜜中反复发生且明显不可逆的模式gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba这表明，食物欺骗可能构成了一种进化稳定的替代策略，正如在其他兰花群体中观察到的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．无回报物种的进化可能有几个生物学意义，比如改变传粉者的行为、基因交换的模式、生殖隔离的类型和物种形成的速度。在不同的花蜜的存在和缺失gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种提供了探索与奖励和无令人愉快的物种的生态力量相关的生态力量。不幸的是，gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba是一种鲜为人知的兰花属，尽管它的多样性令人印象深刻。为了了解这两种策略进化的生态条件，我们需要了解传粉者、生殖生物学和有回报和无回报物种的种子设置等信息。群体遗传学和系统地理学的研究主要集中在群体中的种gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba（由[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)，这降低了我们了解提供花蜜物种间基因交换模式的能力。例如，我们的假设，花饰蜜腺可能提供触觉刺激传粉者需要通过监测传粉者的行为，观察渗透的深度，停留的时间和移动的喙在库珠内。我们知道，由于该属的大小，我们的样本是有限的，一些结论可能会被谨慎地解释，例如利用库珠藻的内部形态推断出分泌花蜜的种类。尽管如此，我们的研究提供了新的见解和假设，需要在未来的研究中进行检验，以澄清什么进化机制参与了超多样性属的多样化，如gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

研究系统和分类单元取样gydF4y2Ba

属gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba近年来一直是主要分类处理的重点，主要集中在描述新种。我们的分析集中在群体上gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba由于它的单系[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba以及鲜花解剖分析的有效性。从巴西植物研究所(São Paulo, Brazil)的活体兰花标本中采集了27个物种(31份)的花朵样本，其中20个物种(24份)也被纳入系统发育研究。系统发育推断是基于GenBank中获得的序列数据和本研究产生的新数据。详情见附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：表S1。gydF4y2Ba

解剖分析gydF4y2Ba

从27种选择花的cuniculus腺体（见附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(表S1)，在花开花时的分泌期进行了调查。通过葡萄糖条(只要可能)和原位组织化学检测还原糖来评估和确定花蜜的存在。gydF4y2Ba

取花子房，纵切观察菊属表皮，立即在2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4, 0.1 M)中固定24 h。磷酸盐缓冲液洗涤，乙醇系列脱水，70%乙醇保存。材料进一步脱水至100%乙醇，在六甲基二硅氮烷(HMDS)系列(33.3,50.0,66.6%)中漂洗gydF4y2BavgydF4y2Ba/v 100%乙醇)，然后在100% HMDS中放入3次，每次1分钟[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]干燥材料。将样品安装在短柱上，在Leica Ace 200溅射系统中涂有金，并在10kV下用Fei Quanta 250观察。使用Adobe Photoshop 7.0版（Adobe Systems，Inc.，San Jose，California，美国）编辑了数字图像。gydF4y2Ba

使用Leica组织树脂(德国贺利氏古莎)的标准方法将固定的卵巢(见上)包埋，并在5-μm厚度处连续切片。切片用甲苯胺蓝O [gydF4y2Ba45gydF4y2Ba装在水里。采用奥林巴斯BX53复合显微镜，配备奥林巴斯Q-Color 5数码相机和Image Pro Express 6.3软件进行观察和数字图像采集。gydF4y2Ba

通过葡萄糖条试验(Inlab Diagnostica;Alamar Tecno scientifica，布宜诺斯艾利斯，阿根廷)，只要花蜜足够丰富，可以测试。从鲜花中摘除卵巢后，立即用微毛细管将其内部液体含量去除，并应用于葡萄糖条。为了原位检测还原糖，将新鲜的卵巢横切面用Fehling试剂、等量硫酸铜(II) (6.93% w:v)、酒石酸钠钾(34.6)和12%的氢氧化钠(w:w:v)溶液加热到预煮沸温度处理。治疗后立即在光镜下观察切片。gydF4y2Ba

卵巢区域分离，并立即固定在1.5％戊二醛中室温和0.2M二甲胂酸盐缓冲液，pH 7.25。几次洗涤用二甲胂酸盐缓冲液后，将材料后固定在1％的OsOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2 h，脱水至100%乙醇，包埋在LR White包埋介质(Ted Pella Inc.， Redding, CA, USA)。这些截面安装在铜网格上，并在80 kV下使用Jeol JEM 2100 TEM进行观察。gydF4y2Ba

分子的方法gydF4y2Ba

用于分子分析，叶样品切成小片，并转移至硅胶进行干燥。如由皮涅罗等人所述提取总基因组DNA。［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．利用Pinheiro等人的技术和引物，我们pcr扩增并测序了5个质体区域(matK, rbcL, trnL-trnF, trnT-trnL, rpl32-trnL)和一个核区域，内部转录间隔区(ITS)区域(包括5.8S基因)。[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba为trnL-trnF, trnT-trnL, rpl32-trnL, van den Berg等[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]用于matK、rbcL和ITS。我们相信更多的核标记会有帮助，但是，由于在gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba低拷贝核区域的扩增和测序是非常困难的。gydF4y2Ba

使用上述PCR引物在Macrogen，Inc。（首尔，韩国）测序扩增产物。编辑序列并使用肌肉算法对齐，肌肉算法在佐锯版5.4软件中实施的默认设置（BioMatters，Ltd，奥克兰，新西兰）。我们还通过手进行了最终编辑序列对齐。对于所有塑性和核区域，物种之间的序列长度变化很低。因此，差距通常被视为缺失数据。Genbank序列登录号和凭证详细信息总结在附加文件中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：表S1。我们包括在系统发育分析中的外组和多个特定的样品，从54种，总共58个末端载体。Pinheiro等人的两个错误识别。［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]进行校正：标识为试样gydF4y2Ba大肠myrmecophorumgydF4y2Ba之后是gydF4y2Ba大肠orchidiflorumgydF4y2Ba，和试样识别为gydF4y2BaE. Incisum.gydF4y2Ba之后是gydF4y2Ba大肠macrocarpumgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

系统发育和时间校准gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba散度gydF4y2Ba

采用在BEAST 1.8.1软件中实现的Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC)估计拓扑和发散次数的联合后验分布[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]在具有不同校准方案两步分析。首先，我们估计主要兰科分支具有以下节点校准的分歧时间：对于亚族Goodyerinae，15-20马基于兰花花粉化石记录[年龄gydF4y2Ba49gydF4y2Ba];和发散时间估计[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]亚科的平均为49 Ma，非正式组“高级的Epidendroids”平均为39 Ma。该数据集包括Gustafsson等人从比对序列矩阵中获得的39种兰花的质体DNA序列，核酮糖二磷酸羧化酶(rbcL)和成熟酶K (matK) [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，加十gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba种，导致49个兰花分类群。gydF4y2Ba

第二步分析为gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba使用第一次分析的年龄估计作为二次校准:1)Laellinae亚部落的年龄，平均20.1 Ma和标准偏差3.8 (95% CI, 13.85-26.35 Ma)的正态先验分布;2)枝的年龄gydF4y2BaMeiracylliumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba洋兰gydF4y2Ba和gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba:正态先验分布，均值12.62 Ma，标准差4.2 (95% CI, 5.72-19.53 Ma)。共15种(19种)gydF4y2BaAmphyglottiumgydF4y2Ba进行了分析，32gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba种作为外群，另外还有7种，隶属于4个不同的莱利亚科属(gydF4y2Baarpophylum.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba洋兰gydF4y2Ba，gydF4y2BaEncycliagydF4y2Ba， 和gydF4y2BaMeiracylliumgydF4y2Ba)．该数据集由5个质体区(matK, rbcL, trn-trnF, trnT-trnL, rpl32-trnL)和1个核区ITS区(包括5.8S基因)组成。我们还包括了用于外群的相同的rbcL和matK序列gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba用于第一步校准分析的物种。核标记ITS和质体标记rpl32-trnL、trnL-trnF、trnT-trnL选用GTR模型。质粒标记matK和rbcL选用GTR + Γ + I模型。所有分区的分析都与不相关的对数正态放松时钟先验和圣诞树先验相关联。在BEAST中进行了三次分离运行，分别有5000万代和每1000代的抽样频率。使用Tracer v. 1.6分析日志文件[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]以评估收敛性，并确定所有参数的有效样本量是否大于200。然后将生成的树与LogCombiner v. 1.8.1结合，消耗10%。使用TreeAnnotator v. 1.8.1生成最大可信度树[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们的数据的初步分析显示，协方差的均值为0.12,95%置信区间为0.0551-0.3055(值接近零表示协方差低)。在我们的数据中发现低协方差有利于使用BEAST而不是R8S [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．如文献所述[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，使用不相关数据的惩罚可能性将无法获得稳健的年龄估计。因此，很难比较R8S和Beast获得的年龄估计值，排除了确定哪一种方法产生最正确的分歧估计值[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

根据Xiang等人的方法，通过比较两个主要数据分区、核ITS和所有质体区域的严格共识树的拓扑结构和后验概率来评估核和质体数据集的一致性。[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．通过视觉比较具有较高后验概率(PP) > 90[的单独分析中每个分支的支持度和分辨率来进行测试。gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．Because most incongruences were restricted to clades showing low support values (Bayesian posterior probability [BPP] < 0.90 – data not shown), only the Bayesian inference based on the combined nuclear and plastid data sets was used for phylogenetic inference, divergence time estimations, and analysis of character evolution.

花蜜的得失演变gydF4y2Ba

通过解剖观察和组织化学试验可以直接推断出花蜜的存在和缺失。此外，我们认为有花蜜的珠孔的存在是花蜜缺乏的标志。相反，根据我们的研究结果，未装饰的cunulus的存在表明有花蜜的存在(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S1)。利用祖先特征状态重建分析绘制了花蜜缺失(NA)和花蜜存在(NP)之间的变化gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba物种。NA和NP状态编码为二进制数据(分别为0和1)，并在最大似然准则下使用Mesquite v. 3.31包优化到组合(总证据=核+质体数据集)贝叶斯推断树[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．利用牧豆树状态变化概述函数量化NA和NP状态转换的数量和方向。状态转变的数量总结了超过10,000个计时器。gydF4y2Ba

Pinheiro等人测试了NA和NP之间转换速率的差异[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，使用万个chronograms。使用似然比检验比较三种模型：（1）不受约束模型，其中，所述两种类型的转变的概率，从NA到NP（QgydF4y2Ba_01gydF4y2Ba)和反过来(qgydF4y2Ba_10gydF4y2Ba），计算出;（2）仅允许NA对NP转换的限制模型（即，QgydF4y2Ba_10gydF4y2Ba= 0);(3)一个可选的限制性模型，其中只允许NP到NA的转换(即qgydF4y2Ba_01gydF4y2Ba = 0). The likelihood ratio test was used to compare the two likelihoods derived from the unrestricted and each of the restricted models. In the restricted models, ancestral states were fixed to NA or NP. MCMC analyses were performed using the BayesMultistates program [60gydF4y2Ba在BayesTraits v. 3.0.1 (gydF4y2Bahttp://www.evolution.rdg.ac.uk/BayesTraits.htmlgydF4y2Ba)．MCMC分析在5050,000代中进行，具有均匀的先验分布和50,000代的老化。gydF4y2Ba

在解剖观察的基础上，直接推断出27个被详细调查的物种是否有花蜜。我们还使用了一种间接的方法来推断没有新鲜材料的物种的花蜜存在/缺乏，利用表皮特征和花蜜的存在/缺乏之间的关联。我们发现有纹饰的cunyuus(存在表皮单细胞毛状体)和缺乏花蜜之间有很强的联系。与此相反，无装饰的cunculus(表皮均匀，无毛)总是与花蜜的存在相联系(见结果描述)。因此，要估计无花蜜的比例gydF4y2BaEpidendrumgydF4y2Ba种，我们使用Hágsater等在gydF4y2BaIcones OrchidacearumgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表S2)作为整个属的代理。我们将我们的分析限制在gydF4y2BaIcones OrchidacearumgydF4y2Ba由于其花的详细和标准化的性质，提供了几乎整个属(约1100种)的信息。本文分析的所有物种的详细分布图也由gydF4y2BaIcones OrchidacearumgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

妊娠:gydF4y2Ba

扩增片段长度多态性gydF4y2Ba

BPP:gydF4y2Ba

贝叶斯后验概率gydF4y2Ba

GTR：gydF4y2Ba

一般时间可逆模型gydF4y2Ba

HMDS:gydF4y2Ba

HexamethyldisilazanegydF4y2Ba

它的：gydF4y2Ba

内部转录间隔区gydF4y2Ba

马:gydF4y2Ba

多年亿gydF4y2Ba

MCMC：gydF4y2Ba

马尔可夫链蒙特卡罗gydF4y2Ba

拿拿淋:gydF4y2Ba

没有花蜜gydF4y2Ba

NP:gydF4y2Ba

花蜜的存在gydF4y2Ba

页:gydF4y2Ba

后验概率gydF4y2Ba

扫描电镜:gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

透射电镜:gydF4y2Ba

透射电子显微镜法gydF4y2Ba

挥发性有机化合物:gydF4y2Ba

挥发性有机化合物gydF4y2Ba

我们感谢Alexandre Antonelli, Maria Fernanda Calió， Thiago André和Thaís Vasconcelos对这份手稿早期想法的讨论和评论。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由CNPq Universal基金资助(No. 440367/2014-0)， PNPD/CAPES基金资助FP(300927/2016-9)和PCG (0469-13-0)， CNPq基金资助PCG(0588/12-1)资助。FP和CPS也获得了CNPq的产能资助(分别为300927/2016 - 9,300819 /2016 - 1)。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究生成的所有系统发育序列数据均保存在GenBank(美国国家生物技术信息中心)中，登录号为ITS, MH218741 - MH218763;matK, MH218764 - MH218779;trnT-L, MH218803 - MH218807;rpl32-trnL: MH218793 - MH218798;rbcL, MH218780 - MH218792;trnL-F, MH218799 - MH218802;(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S1)。所有支持文章结果的附加材料都作为附加文件包含在内。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. Instituto de Botânica, Núcleo de Pesquisa do Orquidário do Estado, São Paulo, SP, 04301-902，巴西gydF4y2Ba

   Poliana Cardoso-GustavsongydF4y2Ba

2. Departamento deBotânica，InstitutoBiociências，大学埃斯塔育Paulista，Rio Claro，SP，13506-900，巴西gydF4y2Ba

   Mariana Naomi SakagydF4y2Ba

3. Centro deCiênciasbiológicas，Dealtamento deBotânica，埃斯南德·佩南·佩卡科，累积，PE，巴西50670-420gydF4y2Ba

   Edlley马克斯·佩索阿gydF4y2Ba

4. 巴西坎皮纳斯州立大学生物研究所植物生物学系，坎皮纳斯，SP, 13083-862，巴西gydF4y2Ba

   Clarisse Palma-Silva和Fabio PinheirogydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

PCG收集并分析解剖资料。MNS进行了分子系统发育分析和分化时间估计。EMP回顾了关于表皮下楔骨形态的文献。CPS参与了设计，并帮助起草了手稿。FP参与了研究的设计，进行了分子遗传学研究并起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Baibsen Pinheiro法比奥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

本研究中使用的植物材料在现场收集，森林部门当局的必要许可。所有优惠券标本都已存放在公开可用的植物豆草（附加档案gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S1)。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba