蔗糖非发酵1相关蛋白激酶SAPK1和SAPK2在水稻耐盐胁迫中协同发挥正向调节作用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2家族(snrk2)统一了植物中不同的非生物胁迫信号。迄今为止，渗透胁迫/ aba活化蛋白激酶1 (SAPK1)和SAPK2这两个水稻snrk2的功能尚不清楚。我们通过使用CRISPR/Cas9系统生成功能丧失系，并在转基因水稻植株中过度表达这些蛋白质，研究了它们在盐胁迫响应中的作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

表达式分析显示gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba干旱、NaCl和PEG处理对表达有较强的诱导作用，而ABA处理对表达无诱导作用。gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba在叶片中表达量最高，其次是根gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba根中表达量最高，叶次之。两种蛋白都定位于细胞核和细胞质。在盐胁迫下，gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba特别是，gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba与野生型植物相比，突变体的发芽率降低，生长抑制更严重，褪绿现象更明显，叶绿素含量降低，存活率降低。相反，SAPK1-和sapk2 -过表达系的发芽率提高，对盐的敏感性降低;与野生型植物相比，包括轻微减少生长抑制，减少褪绿症，增加叶绿素含量和提高存活率。这些结果表明，SAPK1和SAPK2可能在种子萌发期和幼苗期协同发挥盐胁迫耐受性的正向调节作用。我们还发现，SAPK1和SAPK2通过促进脯氨酸等渗透活性代谢产物的生成来影响盐胁迫后的渗透势。SAPK1和SAPK2还通过促进ROS清除物(如抗坏血酸)的生成，以及通过增加超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等蛋白质的表达水平，改善了盐胁迫后活性氧(ROS)的解毒作用。SAPK1和SAPK2可能在还原Na方面协同作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通过影响钠而产生毒性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba根与芽间的分布，NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从细胞质中排出的钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba封存到液泡中。这些作用可能通过Na的表达而促进gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba——KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-homeostasis-related基因。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在水稻萌发期和苗期，SAPK1和SAPK2可能协同发挥耐盐调节作用。SAPK1和SAPK2可能有助于提高作物的耐盐性。gydF4y2Ba

大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba)，是最重要的谷类作物之一，也是所有谷类作物中对盐胁迫最敏感的，特别是在苗期和繁殖期[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在最常见的环境胁迫中，盐度是植物生长的主要制约因素，即使是温和的盐胁迫也会导致生产力的显著损失。遭受高盐胁迫的植物通常具有快速发生的渗透胁迫和较缓慢形成的离子不平衡[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，分子损伤和生长停滞发生，最终降低作物产量。gydF4y2Ba

盐胁迫是复杂的，因为它同时包含离子毒性和渗透成分[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．高盐胁迫通过渗透胁迫和离子胁迫抑制植物生长[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．渗透胁迫会抑制水分吸收、细胞伸长和叶片发育。离子胁迫导致钠含量高gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在枝条上积累;这会降低蛋白质合成、酶促反应和光合作用过程[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．结果，活性氧(ROS)的产生增加，最终导致植物生长和生物量减少[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．暴露在盐下，植物经常表现出钠的症状gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba钠毒性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba积累。主要遗址为纳gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba许多植物的毒性来自叶片，叶片是光合作用和其他代谢过程发生的地方[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．因此，还原NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在嫩枝中的积累——尤其是在叶子中的积累——对于保护植物免受离子钠的侵害是很重要的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba压力(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

减少钠的毒性作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba积累过程中，植物主要进化出两种类型的耐受机制。这些方法是基于限制盐进入根部，或控制盐的浓度和分布[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．细胞内钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通过质膜NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba反转运蛋白盐过度敏感通路[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，或者被液泡体定位的Na隔离到液泡中gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或者KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba交换器[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．在组织水平，钠的调节gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba装载到根木质部是限制钠的必要条件gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在枝条中的积累[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．许多组分与Na的调控有关gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba植物内稳态已经被描述;包括SOSs, NHXs和高亲和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运输商(香港)[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

磷酸化是最重要的翻译后修饰之一;影响靶蛋白的活性、定位和稳定性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在盐胁迫下，蛋白质磷酸化级联被激活并在水稻耐盐性中发挥关键作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2家族(SnRK2s)由10个成员组成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(SnRK2.1-10)和水稻(被称为渗透胁迫/ aba活化蛋白激酶，SAPK1-10)基因组。根据其畴结构，可分为I-III类(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．前期研究证实snrk2参与ABA和应激信号通路[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．大部分的大米和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba除AtSnRK2.9外，SnRK2激酶可被盐处理激活[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba];这表明它们可能在植物对盐的反应中起重要作用。此外，还有几个gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(2.2, 2.3, 2.6, 2.7和2.8)和水稻(SAPK8, SAPK9和SAPK10) SnRK2成员被ABA激活[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．这些蛋白质是ABA信号通路的关键调节因子;控制种子发育、休眠和萌发、幼苗生长和气孔调节对干旱的响应[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba亚类成员SRK2C/SnRK2.8正向调控根系耐旱性[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，并积极调节与植物生长相关的代谢过程[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．的过度表达gydF4y2BaSRK2C / SnRK2.8gydF4y2Ba增强抗旱性[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]和植物生长[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．然而，沟口等人。[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba报告说gydF4y2Ba拟南芥snrk2.7gydF4y2Ba，gydF4y2Basnrk2.8gydF4y2Ba,gydF4y2Basnrk2.7/2.8gydF4y2Ba突变体在干旱胁迫下与野生型植物相比，在生存或损伤方面没有任何明显差异。在大米中，过度表达gydF4y2BaSAPK4gydF4y2Ba通过改变离子稳态基因的表达水平提高耐盐性[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．异位表达gydF4y2BaSAPK6gydF4y2Ba（gydF4y2BaOSRK1gydF4y2Ba)可降低烟草种子萌发和根系伸长时对ABA的敏感性[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2BaSAPK6gydF4y2Ba（gydF4y2BaOSRK1gydF4y2Ba)通过磷酸化水稻的ABF家族，促进盐胁迫下的根系生长[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．此外，SAPK9正向调控aba介导的水稻干旱胁迫信号通路[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

尽管最近在研究SnRK2亚类I和III的上述成员的作用方面取得了进展;在水稻中，我们对亚类II成员的知识仍然有限。此前，我们报道了水稻中的一个亚类成员SAPK2在干旱和盐处理下被强烈激活[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．我们还发现gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba突变体对干旱胁迫比野生型植物更敏感，这是由于许多胁迫诱导基因的上调[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．亚类II的另一个成员SAPK1被高渗透压强烈激活，其方式与SAPK2相似[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．SAPK1和SAPK2的激酶结构域高度保守(92%的氨基酸相同)。因此，这两个亚类II成员可能调控一些重叠的信号转导通路。迄今为止，SAPK1和SAPK2在水稻耐盐性中的作用尚未被阐明。在本研究中，我们确定了这些蛋白在盐胁迫下的响应功能gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba功能丧失突变体(使用CRISPR/Cas9系统产生)和过表达这些蛋白质的植物(gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba)．我们分析了SAPK1和SAPK2的表达谱，发现干旱、NaCl和PEG处理对它们的表达水平有很强的诱导作用，而ABA则没有。此外,gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba叶片表达量最高，根部次之;而gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba根中表达量最高，叶次之。的本地化模式gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba细胞质和细胞核相似。在盐胁迫下，gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体(特别是gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba与野生型相比，突变体)表现出发芽率降低，生长严重抑制，更高级的褪绿，叶绿素含量降低，存活率降低。相比之下,gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型相比，品系的发芽率提高，盐敏感性降低(包括轻微的生长抑制)，叶绿素含量增加，存活率提高。最后，分析了SAPK1和SAPK2对渗透胁迫、ROS解毒和Na的影响gydF4y2Ba^+gydF4y2BaKgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba积累。综上所述，我们的研究结果表明，SAPK1和SAPK2可能在水稻萌发期和苗期协同发挥盐胁迫耐受性的正向调节作用。gydF4y2Ba

表达谱和亚细胞定位分析gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba在水稻gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2是水稻SnRK2 II亚家族成员。SAPK1的开放阅读框长1029 bp，编码342个氨基酸的多肽(LOC_Os03g27280)。SAPK2的开放阅读框长1020 bp，编码一个339个氨基酸的多肽(LOC_Os07g42940)。在我们之前的研究中，我们证明了这一点gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba干旱、NaCl和PEG的诱导作用[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．进一步阐明的作用gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba在水稻中，我们更精确地检测了它们的表达谱。gydF4y2Ba

首先，我们测量了诱导表达gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba利用定量逆转录pcr (qRT-PCR)对某些非生物胁迫作出反应。gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba干旱、NaCl和PEG处理均显著上调其表达;而非ABA处理(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这些结果表明gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba两者都对盐处理有反应，并可能参与对盐胁迫的反应。gydF4y2Ba

接下来，我们比较gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba不同组织的表达模式。为此，我们使用qRT-PCR和组织化学分析了由自身启动子驱动的表达β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的转基因植物。gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba叶片表达量最高，根部次之;这与之前的研究是一致的[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．相比之下,gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba在根中表达量最高，其次是叶(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．组织化学分析显示最强gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba表现在叶子上的，却是最强的gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba表达在根部(图;gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2Ba)．我们还在烟草叶肉原生质体中使用绿色荧光蛋白(GFP)融合检测了SAPK1和SAPK2的亚细胞定位。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)．其定位模式在细胞质和细胞核中相似，与细胞的定位模式相似gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba亚类II SnRK2s SRK2C及SRK2F [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．总之，这些结果表明gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba有不同的组织特异性，但它们可能在细胞水平上有功能上的协作。gydF4y2Ba

进一步研究的功能gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，我们建立了gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba单突变体gydF4y2Ba(sapk1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1-4)gydF4y2Ba；gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单突变体gydF4y2Ba(sapk2-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2-7)gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba双突变体(gydF4y2Basapk1/2-9gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk 1/2-13)gydF4y2Ba使用CRISPR/Cas9系统。Kobayashi等人[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]先前报道了Ser-158, Thr-159和Thr-162对于SAPK1的活性或激活至关重要。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．由于SAPK1和SAPK2的激酶结构域高度保守(92%的氨基酸相同)，我们预测Ser-158, Thr-159和Thr-162也是SAPK2活性或激活所必需的(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．的第三个编码外显子gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba用于引导RNA设计。我们决定gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba编码核苷酸序列有帧移突变gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单突变体和在gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba双突变体。这些突变导致Ser-158之前SAPK1和SAPK2氨基酸序列的过早终止(图5)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．这些结果证实了gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单个突变体和gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba双突变体无功能。gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2在萌发期和萌发后对盐胁迫的响应作用gydF4y2Ba

种子萌发是幼苗建立过程中最重要的阶段。然而，盐胁迫是限制种子萌发的重要因素之一。为了阐明SAPK1和SAPK2在盐度胁迫响应中的作用，我们首先比较了两种植物的发芽率gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体和野生型在含nacl的培养基上。在正常条件下，突变体与野生型的发芽率无显著差异(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．然后我们开始发芽gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba野生型种子在添加不同浓度NaCl的半强度Murashige和Skoog (MS)琼脂培养基上。以胚根出芽率计算发芽率。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在高盐介质(150、175或200 mM NaCl)上，种子萌发gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba与野生型种子相比，种子受到显著抑制。175 mM NaCl，约34%，39%和48%的gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba种子分别未能发芽。这些比例显著高于野生型种子(约15%;无花果。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．这些观察结果表明gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体在萌发过程中比野生型对盐胁迫更敏感。此外，他们认为SAPK1和SAPK2是盐胁迫下萌发所必需的，并且可能协同作用。gydF4y2Ba

接下来，我们对种子萌发后的发育进行了评价gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体和野生型幼苗。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(c、d和e)，未加盐处理的突变体与野生型的茎长和根长差异不显著。而在175 mM NaCl处理下，幼苗茎长显著降低gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba突变体(1.60 ~ 1.70 cm和1.70 ~ 1.90 cm)略短于野生型(2.43 cm)。此外，还确定了叶片的梢长gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个双突变体(0.98 cm)较矮gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单突变体(图;gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)．在根生长试验中gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba与野生型植物相比，2个突变体都对盐处理更敏感。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba)．的根长度gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个双突变体(0.62 cm)占对照组的50%gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba突变体(分别为1.16 cm和1.18 cm)和野生型(2.59 cm)的24%。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba)．综上所述，表明SAPK1和SAPK2在盐胁迫响应中具有积极的调节作用，且在萌发后发育阶段两者的功能是协同的。gydF4y2Ba

SAPK1-和sapk2 -过表达系在萌发期和萌发后对盐胁迫的敏感性较低gydF4y2Ba

为了进一步评估SAPK1和SAPK2在萌发期和萌发后盐胁迫响应中的作用，我们在35S启动子的控制下生成了表达SAPK1和SAPK2的转基因水稻(gydF4y2BaOE-SAPK1-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOE-SAPK1-2gydF4y2Ba，gydF4y2BaOE-SAPK2-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOE-SAPK2-2gydF4y2Ba)．我们分析了基因的表达水平gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba利用qRT-PCR在转基因水稻系中进行研究。我们发现的表达水平gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba在gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba分别显著高于野生型植物(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．接下来，我们分析了gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba盐胁迫下的线。无NaCl处理时，不同处理间的发芽率、茎长和根长均无显著差异gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba行和野生型。gydF4y2Ba

在175 mM NaCl处理下，种子发芽率显著高于对照组gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba显著高于野生型(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．加入200mm NaCl, 20%和18%的gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba它们分别未能发芽。这些比率显著低于野生型(44%;无花果。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．在发芽后的生长试验中gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba品系对盐胁迫的敏感性低于野生型。茎和根的长度之和gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba株系(分别为5.14 cm和5.42 cm)比野生型株系(2.58 cm)长得多。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba-gydF4y2BaegydF4y2Ba)．这些结果进一步支持了SAPK1和SAPK2在萌发期和萌发后发育阶段对盐胁迫反应具有正向调节作用的假设。gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2在苗期正向调节耐盐性gydF4y2Ba

盐胁迫通常在幼苗期抑制植物生长。评估…的生理反应gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体在盐胁迫后，将4周龄的植株暴露在添加175 mM NaCl的半强MS液体培养基中5 d，在新鲜的半强MS液体培养基中恢复7 d后，计算植株的存活率gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2倍突变体(10%)仅占突变体的30%gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba(分别为30%和40%)，仅为野生型植物的14% (70%;无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

NaCl处理5 d后，盐胁迫对植物的损伤更为明显gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba尽管两种植物在没有盐胁迫的情况下生长相似(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．随后比较了突变体和野生型植物的鲜重和嫩枝和根的长度，结果表明NaCl处理极大地抑制了所有测试组织的生长(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba)．在gydF4y2BasapkgydF4y2Ba1,gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba突变体的茎鲜重和茎长分别只有野生型的70%和80%(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)．然而，根部受损最严重，其根鲜重和根长分别约为野生型植物的60%和40%(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba)．在gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体、茎和根的生长受到严重影响。例如，茎部和根的鲜重分别仅为野生型植物的48%和42%(图2)。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba）;芽和根的长度分别为野生型的33%和21%(图2)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba而且gydF4y2BaegydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

盐胁迫使植物光合色素的丰度显著降低。对盐胁迫下10株幼苗叶绿素含量进行了分析。盐处理后，所有植株的叶绿素含量均显著降低;然而，叶绿素含量在土壤中显著降低gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba与野生型植物的突变体相比(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这一结果与存活率的模式相似。这些结果表明gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba明显影响苗期生长和耐盐性。gydF4y2Ba

为了进一步证实SAPK1和SAPK2在盐胁迫响应中的作用，我们对其进行了处理gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba175 mM NaCl胁迫下的转基因植株。见面gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba或gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba将植株暴露在添加175 mM NaCl的半强液态MS培养基中7 dgydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba植物对盐胁迫的敏感性降低，生长抑制和黄化程度较野生型植物轻。转基因植株的鲜重增加，茎长和根长增加，叶绿素含量增加(图2)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．存活率gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba(约36%)及gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba(约46%)明显高于野生型植物(11%;无花果。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．总的来说，这些观察结果进一步支持了SAPK1和SAPK2在水稻苗期协同发挥盐胁迫耐受性正向调节作用的假设。gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2在苗期通过渗透调节参与盐胁迫响应gydF4y2Ba

积累的游离脯氨酸可以稳定亚细胞结构，促进细胞从非生物应激引起的损伤中恢复[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．我们比较了脯氨酸含量gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba株系和野生型植物。在正常条件下，各株系间脯氨酸含量无显著差异。然而，在盐胁迫下，脯氨酸含量降低gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba变种人(尤其是在gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体)，在gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物相比(图;gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

脯氨酸生物合成由OsP5CS催化。根据我们的qRT-PCR数据gydF4y2BaOsP5CSgydF4y2Ba表达水平明显降低gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba变种人(尤其是在gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体)，在gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba在盐胁迫条件下，野生型植物的株系比野生型植物的株系要好(图2)。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

综上所述，这些结果表明，SAPK1和SAPK2通过影响脯氨酸等相容溶质的积累来调节盐胁迫反应。gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2在苗期通过ROS解毒参与盐胁迫响应gydF4y2Ba

为了研究膜过氧化的程度，我们测量了正常和175 mM NaCl条件下的相对电解质泄漏和丙二醛(MDA)含量。未加NaCl处理时，不同处理间相对电解质渗漏量和丙二醛含量无明显差异gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体,gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba株系和野生型植物(图;gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)．当NaCl浓度为175 mM时，溶液中电解质的相对渗漏量和MDA含量gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体显著高于野生型。此外，从测量gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2双突变体明显高于非突变体gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单突变体(图;gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)．相比之下，相对电解质渗漏量和丙二醛含量显著降低gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物相比(图;gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因为丙二醛是ROS活性引起脂质过氧化的产物[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，我们推测SAPK1和SAPK2通过ROS解毒影响耐盐性。为了验证这一假设，我们比较了抗坏血酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的表达水平gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体,gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba株系和野生型植物。如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(e-g)，在无盐处理的情况下，各品系抗坏血酸含量及SOD和CAT表达水平均无显著差异。盐处理后，抗坏血酸含量及SOD和CAT表达水平均显著降低gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba变种人(尤其是在gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体)与野生型植物比较。相比之下，这些参数在gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba行。gydF4y2Ba

这些结果表明，在水稻苗期盐胁迫下，SAPK1和SAPK2协同清除ROS活性。gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2影响NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba盐胁迫下的稳态gydF4y2Ba

A低NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba低钠含量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在正常和盐胁迫条件下，细胞质中的比例对维持离子稳态至关重要。为了确定SAPK1和SAPK2是否参与调节盐胁迫下的离子稳态，我们测定了NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba本网页内容gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba株系和野生型植物。水稻植株生长到4周后，用175 mM NaCl处理5 dgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内容、KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含量和钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba两者之间的比例相似gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2 sapk1 /gydF4y2Ba2，gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba，gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba野生型植物(图;gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)．在盐胁迫下，KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba本网页内容gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba突变体显著低于野生型。KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba本网页内容gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2双突变体明显低于非突变体gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba或gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单突变体(图;gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)．相比之下，NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含量和钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba的比率gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba突变体显著高于野生型，NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含量和钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba的比率gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体显著高于非突变体gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba或gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba单突变体(图;gydF4y2Ba9gydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba)．相比之下，gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2BaNa积累较少的线gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba更多的KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，导致Na降低gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与野生型的比值(图;gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)．综上所述，这些观察结果提示了SAPK1和SAPK2在Na调控中的可能作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba盐胁迫下的稳态。同样，这些角色似乎是协作的。gydF4y2Ba

进一步研究SAPK1和SAPK2在Na中的分子作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内稳态，我们分析了表达gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba在突变系和过表达系的幼苗叶片中。如图所示。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，在盐处理下，的表达水平gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba显著减少了gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体。这些基因的表达水平显著提高gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物比较。这些结果表明，SAPK1和SAPK2参与了转录的调控gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

snrk2是统一植物不同非生物胁迫信号的关键分子[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．因此，研究snrk2的功能对全面了解植物非生物胁迫响应机制具有重要意义。到目前为止，还没有水稻SAPK基因敲除耐盐性的数据。为了充分了解SAPK1和SAPK2在耐盐机制中的作用，阐明它们的组织特异性和突变体分析至关重要。为了满足这些标准，我们生成了功能丧失突变体，例如gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba，和过表达线gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， SnRK2.7和SnRK2.8受盐胁迫强激活，受ABA弱激活，调控植物耐旱性和生长[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2BaSnRK2.8gydF4y2Ba在根中表达丰富，在叶中表达微弱，而gydF4y2BaSnRK2.7gydF4y2Ba在根、叶和花中表达[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．SnRK2.8和SnRK2.7定位于细胞质和细胞核[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．SAPK1和SAPK2是水稻SnRK2 II亚家族成员，是SnRK2.7和SnRK2.8的同源基因(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．盐处理可激活SAPK1和SAPK2，但ABA不能激活gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，表明它们可能在植物对盐的反应中起重要作用。我们的数据表明，干旱、NaCl和PEG处理对SAPK1和SAPK2的表达有很强的诱导作用，而ABA则没有。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．此外，最高gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba表达在叶子中，其次是根;而gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba在根中表达量最高，其次是叶(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．SAPK1和SAPK2分布在细胞核和细胞质中。总之，这些结果表明，SAPK1和SAPK2可能以不同于SnRK2.7和SnRK2.8的方式发挥作用。gydF4y2Ba

盐胁迫在种子萌发和幼苗生长过程中尤其有害。生长缓慢是植物在盐胁迫下生存的一种适应性特征，因为它允许植物依赖多种资源来对抗胁迫。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．盐胁迫与许多其他非生物胁迫一样，会抑制植物生长，导致叶、茎和根的鲜重显著降低[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．首先，我们分析了植物对盐胁迫的敏感性gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体在萌发期和萌发后阶段。所有变种人，尤其是gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体的发芽率低于野生型植物(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．相比之下，gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba植物的发芽率高于野生型(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．在种子萌发后期，所有的突变体(尤其是紫花苜蓿)都能得到良好的生长gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体)表现出比野生型植物更短的茎和根长度(图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．的gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba植物表现出比野生型植物更长的枝条和根长(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．接下来，我们研究了SAPK1和SAPK2对苗期生长的影响。我们的表型分析表明，在盐处理下gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba与野生型相比，2个突变体有更严重的生长抑制，发生褪绿症，存活率降低(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．相比之下，gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba植物对盐的敏感性降低，与野生型相比存活率更高(图2)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaegydF4y2Ba)．盐可通过减少光合作用而间接影响植物生长[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．叶绿素含量显著降低gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体中叶绿素含量较高gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物的比较支持这一假设(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba)．总之，这些结果表明，SAPK1和SAPK2通过减少生长抑制和叶片褪绿症来提高水稻的存活率。因此，这些蛋白可能在种子萌发、萌发后和苗期协同发挥盐胁迫耐受性的正向调节作用。gydF4y2Ba

高浓度的盐总是会引起渗透胁迫[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．盐诱导渗透胁迫后最直接的事件是细胞结构变化和膜渗漏导致的膨压损失[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在盐胁迫下，植物通过产生脯氨酸、糖和糖醇等渗透活性代谢物来降低渗透势[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．所有渗透剂都有一个共同的特点，即在相对高浓度的情况下降低胞质间室的渗透势，而不抑制代谢反应[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在脯氨酸含量分析中，我们发现干旱胁迫下的脯氨酸含量显著降低gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体，而且更高gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物相比(图;gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)．的gydF4y2BaOsP5CSgydF4y2Ba表达水平与这些结果一致。这些结果表明，SAPK1和SAPK2影响脯氨酸等渗透活性代谢产物的生成。预计苗期对盐胁迫的这种响应可以减少渗透胁迫和细胞结构和膜损伤。gydF4y2Ba

水稻的耐盐性似乎与清除活性氧的能力有关[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．盐胁迫也导致ROS生成增加。植物通过增加活性氧的酶和非酶清除活性来应对活性氧胁迫[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．抗坏血酸是活性氧的非酶清除剂之一，而酶清除剂包括SOD和CAT。盐处理后，抗坏血酸含量及SOD和CAT表达水平均显著降低gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba变种人，尤其是在gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体。这些清道夫在土壤中显著增加gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物比较(图;gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba)．MDA含量和相对电解质渗漏量在所有突变体中均显著升高，而在不同突变体中均显著降低gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba行(无花果。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba而且gydF4y2BadgydF4y2Ba)与野生型相比。MDA是ROS活性引起的脂质过氧化反应的产物，是一种应激特异性分子标记物，可指示细胞损伤程度[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．盐诱导渗透胁迫后最直接的事件是膨胀压力的损失，这是由于细胞结构的变化、细胞膜组成的不同和膜泄漏[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．我们的结果表明，SAPK1和SAPK2通过增加抗坏血酸含量和SOD和CAT的表达水平来保护植物免受盐胁迫的氧化损伤，从而增强ROS的解毒能力。gydF4y2Ba

在植物中，KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba是人体必需的营养素。KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba也是酶活性和离子稳态所必需的[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．因为钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba抑制许多酶，重要的是防止钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba积累到很高的水平。当快速施加高盐浓度时，NaCl冲击导致快速渗透挑战，随后更缓慢地积累NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba．我们分析了NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含量和钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba高盐浓度后的比例。如图所示。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体，尤其是gydF4y2Basapk1 /gydF4y2Ba2个突变体，积累较多NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小于KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，导致更高的NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与野生型的比值(图;gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba)．相比之下，gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba线和gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2BaNa积累较少的线gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba更多的KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，导致较低的NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与野生型的比值(图;gydF4y2Ba9 dgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)．这些结果表明，SAPK1和SAPK2可能参与了Na的调控gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba盐胁迫下的稳态，它们的功能是协同的。gydF4y2Ba

许多组分与钠的调节有关gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内稳态已被表征。我们的qRT-PCR结果显示gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba显著减少了gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体中，均显著增加gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba线和gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型植物相比(图;gydF4y2Ba10gydF4y2Ba-gydF4y2BadgydF4y2Ba)．的gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba基因编码水稻质膜钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba挤出钠的换热器gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从根-土壤界面的皮层细胞，从而减少钠的净吸收gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．维生素d水平的降低gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba和Na的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba堆积在叶子上的gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体表明，这些植物对盐的耐受性下降是由于钠的挤压造成的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba来自皮层细胞。gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba是钠所必需的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba钠解毒gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba封存在液泡中[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．减少gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba转录水平gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体表明，SAPK1和SAPK2影响Na的吸收gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在叶细胞中。亚科I HKT转运体的成员被认为介导NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba流入根细胞并调节钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba根与嫩枝间的分布[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba在水稻中，主要表达于叶片韧皮部，定位于质膜，对还原Na起重要作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba嫩枝的累积以应付盐胁迫[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba（gydF4y2BaOsSKC1 / HKT8gydF4y2Ba)参与Na的重吸收gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在木质部薄壁组织，从而限制了钠毒性浓度的积累gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在光合组织中[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．的表达水平降低gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba增加钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba堆积在叶子上的gydF4y2Basapk1gydF4y2Ba，gydF4y2Basapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体表明，这些植物对盐的耐受性下降是由钠的变化引起的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba根和嫩枝之间的分布。总之，这些结果表明，SAPK1和SAPK2可能在减少Na的过程中协同作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通过影响钠而产生毒性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba根与芽间的分布，NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从细胞质中排除的钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba封存到液泡中。这些过程可能通过SAPK1和SAPK2调控Na的表达水平而发生gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-稳态相关基因gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在本研究中，我们研究了两个水稻亚类snrk2 SAPK1和SAPK2对盐胁迫的生化和生理反应。为此，我们开发了功能丧失突变体(使用CRISPR/Cas9系统)和过表达SAPK1和SAPK2的转基因植物。表达式分析显示gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba干旱、NaCl和PEG处理对表达有较强的诱导作用，而ABA处理对表达无明显影响。此外，gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba叶片表达量最高，根部次之;而gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba根中表达量最高，叶中次之。两种蛋白均定位于细胞核和细胞质。在盐胁迫的表型抗性分析中gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba变种人(尤其是gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体)与野生型相比，发芽率降低，生长抑制增加，发生褪绿，存活率降低。相比之下，gydF4y2BaSAPK1-OEgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2-OEgydF4y2Ba与野生型相比，植物表现出较高的发芽率，较低的敏感性和较高的存活率。这些结果表明，SAPK1和SAPK2可能在种子萌发期和幼苗期协同发挥盐胁迫耐受性的正向调节作用。进一步研究表明，SAPK1和SAPK2在盐胁迫反应中影响渗透胁迫和ROS解毒。SAPK1和SAPK2促进渗透活性代谢物的生成，如脯氨酸，ROS清除物如抗坏血酸，以及增加SOD和CAT的表达。SAPK1和SAPK2可能在还原Na方面协同作用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通过影响钠而产生毒性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba根与芽间的分布，Na除外gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从细胞的细胞质中分离出钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba进入液泡。这些过程可能通过调节Na的表达而发生gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-稳态相关基因gydF4y2BaOsSOS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNHX1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsHKT1; 1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaOsHKT1; 5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

植物生长条件及胁迫处理gydF4y2Ba

突变系gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba，过表达行gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba并选择了宽型植物进行试验。所有实验均采用相同条件下的种子进行。不同基因型的绝育种子在半强度的Murashige和Skoog (MS)培养基上同时萌发，并在28℃的生长室中保存，光照周期为14 h /暗周期为10 h。发芽3天后，转入半浓度液体培养基。gydF4y2Ba

突变体和过表达植物的构建gydF4y2Ba

我们采用CRISPR/Cas9系统生成gydF4y2Basapk1, sapk2gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2gydF4y2Ba突变体。CRISPR/Cas9质粒是根据前面描述的方案设计的[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．简单地说，第三编码外显子gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba用于引导RNA设计。将单个靶位点插入pYLsgRNA-OsU3载体的OsU3和sgRNA之间，然后将OsU3-sgRNA盒克隆到pMH-SA载体[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．用于双重编辑gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba， OsU3-sgRNA串联组合(用于gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba)和OsU6a-sgRNA (forgydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba)被克隆到pMH-SA载体中。gydF4y2Ba

突变检测采用从突变苗(所有植物)中提取的基因组DNA进行PCR。PCR产物通过比较gRNA靶序列进行鉴定gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba(atggaatatgctgctggtgg)和gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba(tagttatggaatatgctgc)到水稻参考基因组[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．在TgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba代，我们为每个基因收集了20株抗湿霉素的植物。基于突变检测结果，我们鉴定了T基因中每个基因的两个独立纯合突变系gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba一代，我们给它命名gydF4y2BaSapk1-3, sapk1-4, sapk1 - 1, sapk1 - 7, sapk1/2-9gydF4y2Ba而且gydF4y2Basapk1/2-13gydF4y2Ba．用于CRISPR/Cas9的引物(U3-SAPK1-F, U3-SAPK1-R, U3-SAPK2-F和U3-SAPK2-R)和突变检测(SAPK1-u3-F, SAPK2-u3-R, SAPK2-u3-F和SAPK2-u3-R)在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

要生成gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba过表达的转基因植物，全长cDNAgydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba克隆到CaMV 35S启动子后面的p1301载体上。大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2BaL. japonica.)用于转化。gydF4y2Ba

RNA提取和qRT-PCR分析gydF4y2Ba

为了检测不同胁迫下靶基因的转录水平，宽型植物在相同条件下生长4周。RNA提取和qRT-PCR分析参照Lou等方法[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．用于qRT-PCR分析的基因特异性引物在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

SAPK1和SAPK2的GUS染色和亚细胞定位gydF4y2Ba

对于GUS报告子分析，假定的启动子gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba使用引物Promoter-SAPK1-F, Promoter-SAPK1-R和Promoter-SAPK2-F, Promoter-SAPK2-R从基因组DNA中扩增(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．融合ProgydF4y2Ba_{SAPK1gydF4y2Ba}-GUS和ProgydF4y2Ba_{SAPK2gydF4y2Ba}gus被克隆到p1300载体中。GUS染色检测如所述[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的长篇gydF4y2BaSAPK1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAPK2gydF4y2Ba将CDS序列插入P30，生成绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白。融合构建物用于本氏烟草的转染。使用共聚焦激光扫描显微镜(Olympus，gydF4y2Bahttp://www.olympus-global.comgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

发芽和早苗生长试验gydF4y2Ba

对不同基因型种子进行表面消毒，检测种子萌发情况。然后将灭菌后的种子种植在含有0、100、150、175、200 mM NaCl的半强度MS琼脂培养基上。在指定时间进行发芽率测定。为检测不同基因型种子在萌发后期的生长性能，在半强度MS琼脂培养基上同时萌发。3 d后，将幼苗转移到添加175 mM NaCl的半强MS琼脂培养基中继续生长。用20株幼苗测量茎长和根长。所有这些实验重复3次，每个样品30粒种子。gydF4y2Ba

耐盐试验gydF4y2Ba

不同基因型的绝育种子在半强度MS培养基上同时萌发3 d。幼苗移栽于半浓度MS液体培养基中4周。为了进行耐盐性试验，幼苗转入添加175 mM NaCl的半强MS液体培养基中5 d (SAPK1-OE组和SAPK2-OE组7 d)。处理后移栽于新鲜的半强MS液体培养基中，恢复7 d。gydF4y2Ba

相对电解质渗漏量及叶绿素、脯氨酸、丙二醛、抗坏血酸含量分析gydF4y2Ba

不同基因型4周龄苗在175 mM NaCl胁迫下处理5 d。分析了叶片相对离子渗漏量及叶绿素、脯氨酸、丙二醛、抗坏血酸含量。gydF4y2Ba

参照Lou等的方法检查相对电解质渗漏[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．H的电导gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO采用电导率仪(HORIBA TWIN COND B-173)测定。gydF4y2Ba

用80%丙酮从盐处理植物叶片中提取叶绿素。在663 nm和645 nm处采用Lichtenthaler [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

叶片中游离脯氨酸含量的估算方法如下[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．并用分光光度计测定了520nm处的吸光度。以L-Pro为标准，计算脯氨酸浓度。gydF4y2Ba

叶片中MDA含量的检测方法如下[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．用分光光度计测定532 nm处的吸光度。MDA含量以nmol g表示gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}弗兰克-威廉姆斯。gydF4y2Ba

抗坏血酸含量检测使用购买自南京建成生物工程研究所(南京，中国)的商业检测试剂盒。并测量了536 nm处的吸光度。gydF4y2Ba

离子含量测定gydF4y2Ba

水稻叶片中离子含量的测定方法如前所述[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba稍加修改。简单地说，4周大的植株用175 mM NaCl处理，并让其生长5天。树叶被收割了。然后使用电感耦合等离子体光学发射光谱仪(ICP-OES) (SPS3100, SII纳米技术公司，日本)测定离子含量。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

对于上述测定，至少从三个实验中获得了一致的结果，这里展示了一个实验的结果。计算三个重复的平均值来代表每个数据点。使用Excel 2010制作图表。采用SigmaPlot10.0进行方差分析，不同处理间差异显著。数据代表三个独立实验的均值±标准误差(SE)。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

格斯:gydF4y2Ba

β葡萄糖醛酸酶gydF4y2Ba

hkt:gydF4y2Ba

高亲和性KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转运蛋白gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige和SkooggydF4y2Ba

NHXs:gydF4y2Ba

tonoplast-localized NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或者KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba换热器gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量逆转录pcrgydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SAPK:gydF4y2Ba

渗透胁迫/ aba活化蛋白激酶gydF4y2Ba

SnRK2:gydF4y2Ba

蔗糖非发酵相关蛋白激酶2gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

索斯:gydF4y2Ba

质膜钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba反波特盐过度敏感gydF4y2Ba

我们感谢Edanz集团(中国)Liwen Bianji的Shelley Robison博士gydF4y2Bawww.liwenbianji.cn/acgydF4y2Ba)，以编辑本手稿草稿的英文文本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本工作得到云南省自然科学基金(nsfc)资助。gydF4y2Ba

中国科学院青年创新促进会(授王厚平)、中国植物学会青年创业基金(授王厚平)、中国科学院“华西之光”项目(授王厚平)gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在当前研究期间生成和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源与可持续利用重点实验室，云南昆明650223gydF4y2Ba

   楼登基，王厚平，于迪秋gydF4y2Ba

2. 中国科学院大学，北京100049gydF4y2Ba

   Dengji卢gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

LDJ、YDQ设计实验，LDJ执行实验并撰写稿件，LDJ、WHP分析数据并编辑文章。所有作者都阅读并批准了最终的文章。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaDiqiu余gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba