属叶片背面表皮蜡晶适应性进化的分子遗传和生化证据gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba（壳斗科）gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

叶表皮蜡质是生理调节和防御病原体的重要功能特点。本研究中测试如何选择压力可以迫使叶背面表皮蜡质晶体（LAEWC）的性状，以及是否存在/不存在的LAEWC与其它生理生态学特征相关联。用扫描电镜进行了不同的检查LAEWCgydF4y2Ba分布gydF4y2Ba物种。4个蜡生物合成相关基因，包括2个蜡骨干基因gydF4y2BaEceriferum 1.gydF4y2Ba（gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba),gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba，一个调节基因gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba一个转运基因gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba，被克隆并测序。同时测定了次生代谢产物、光合作用、水分利用效率和营养指标等生理生态指标。采用最大似然法验证了叶蜡质性状转变与这些生理生态性状演化及物种演化相关的进化假说。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

14人中有8人被研究gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba种有明显的LAEWC，出现各种类型的毛状体。对生态生理性状的测量表明，LAEWC的存在与不存在没有直接的相关性。而酚酸的含量与蜡生物合成骨干基因的进化有显著的相关性gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba在中新世晚期至上新世获得LAEWC时被检测为阳性选择。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

晚中新世期间，陆地和植被类型的变化加速了热带和亚热带森林乔木和某些食草动物的多样性。由于酚酸长期以来被认为与对草食动物的防御有关，LAEWC和酚酸的共存可能表明LAEWC可能是一种适应性防御机制gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

防水表皮的发展被认为是重要的植物的土地的殖民化[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．防水表皮特征，如叶片外形蜡，是一种Xeromorphic特征[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，有助于降低蒸发蒸腾速率，使植物适应干旱环境[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．在叶表皮蜡质的情况下，它变稠边界层减少蒸散，但其外观也可以降低CO的吸收gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba降低光合作用效率。CO的分压gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的分子量较小(0.01~ 0.036%)，COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba比HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO导致较慢的COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba因此，叶表皮蜡的出现被认为是适应干旱环境的一个有利特征[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．叶表皮蜡质的积累被认为是由光强度和相对湿度进行调节，这表明表皮蜡质的水分调节可以归因于环境信号[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．此外，表皮蜡的疏水性可以减小水的接触面积，使水流失得更快[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，从而帮助清除灰尘、细菌和附生植物(即自我清洁，莲花效应)。表皮蜡也可以帮助保持植物叶片的物理完整性，减少病原菌造成的损害[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．因此，建议的植物[物理防御的自适应指示器gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

表皮蜡质的生物合成发生在表皮细胞，其中，所述极长链脂肪酸的酸（VLCFAs）在面内质网合成的。在此之后的修改和调整，其合成蜡的前体。这然后经由ATP结合盒（ABC）转运蛋白转运到外膜[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．蜡生物合成基因上调gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba是植物在面临洪水或干旱胁迫时对水分含量的反应[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．驯化番茄(gydF4y2Ba番茄gydF4y2Ba)和适应沙漠的加入(gydF4y2Ba潘那利番茄茄gydF4y2Ba)显示了蜡质生物合成相关基因的差异表达，包括gydF4y2BaECERIFERUM1gydF4y2Ba（gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba），gydF4y2BaCER2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER4gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba样，gydF4y2BaCER6gydF4y2Ba，gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER8gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba脂质转移PROTEIN1gydF4y2Ba（gydF4y2BaLTP1gydF4y2Ba），gydF4y2BaLTP2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba蜡INDUCER1gydF4y2Ba（gydF4y2BaWIN1gydF4y2Ba）等。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．这些蜡类生物合成基因可分为三类:主链基因、调控基因和转运基因。例如，主基因gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba与gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba与两个共同负责VLC烷烃的合成和修饰[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba催化vlc -酰基辅酶as生成vlc -酰基gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba转化成vlc烷烃[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．此外，这两个基因也是多效性的，参与花粉蜡质外壁和近轴表皮细胞壁的形态发生[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．此外,gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba抑制的RNA阻抑gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba对vlc -烷烃的生物合成产生积极影响[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．形成的gydF4y2BaCER5gydF4y2BaABC transporter G family member 11 (ABCG11，又称white-brown complex homolog protein 11, the WBC11)参与蜡质组分向质外体的输出[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．的gydF4y2BaCer5.gydF4y2Ba突变体的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba表皮蜡的含量比野生型低[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，证据表明，表达gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba影响叶表皮蜡的表型。gydF4y2Ba

表皮蜡成分的地理分异，例如蜡的烷烃主干碳数，被认为是当地对环境差异(如降水和温度)的适应的结果[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．这意味着叶表皮蜡质是一种功能性状，被定义为有助于环境适应的形态生理物候特征[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．功能特征通常是相互依赖的[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]和功能性状之间的共变可能反映了功能性状之间的因果关系或协调[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，用于在给定环境中实现性能最大化[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．例如，乳草的毛状体密度与乳胶产量、C:N比与叶片韧性之间存在正相关关系(gydF4y2BaAsclepiasgydF4y2Baspp。)gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．防御性状(如表皮蜡质)与生长相关性状(如碳、氮、光合参数等)之间的权衡被认为是功能性状之间的另一种相互依存关系[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．物理防御和化学防御的资源分配被假设为减少不必要的资源浪费，作为适应的另一种权衡策略[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，或作为一种综合防御策略来对付各种食草动物[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这项研究的目的是测试叶表皮蜡质的自适应假说gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba和确定远轴表皮蜡质晶体（LAEWC）和其它功能特性叶之间的关系。种gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba是一种热带和亚热带的亚洲树种，通常被称为石橡树[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]分组gydF4y2Ba摘要gydF4y2Ba，gydF4y2Ba齿栗叶gydF4y2Ba，gydF4y2BaQuercusgydF4y2Ba， 和gydF4y2BaChrysolepisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．所有的gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba据报道，染色体数目已被检查过的物种为2n = 24，不太可能是多倍体([gydF4y2Ba38gydF4y2Ba];植物染色体数目指数gydF4y2Bahttp://www.tropicos.org/Project/IPCNgydF4y2Ba)．大约一半的已知物种是中国大陆、邻近岛屿和婆罗洲的本地特有物种[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，表明该属植物对环境变化的适应能力很强。适应性特征表现在表型上，如叶表面蜡样晶体和毛状体的差异[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，并反映环境的变化。中新世中后期至第四纪(上新世和更新世)的剧烈气候变化，是影响黄壤现今分布和分化速率的主要因素gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba［gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．过去由冰川振荡造成的气候变化对温度和降水有重要影响，由于水资源利用和光合作用效率的限制，可能直接或间接地影响植物生长[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．这里我们使用gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba作为回答的叶表皮蜡质的性状变化是否适应反映的其他共同变化的生理生态学特征的环境变化问题的一种方式。gydF4y2Ba

在通过显微镜观察确定叶片表皮蜡的存在/不存在后，本研究探讨了三个问题:(1)LAEWC相关基因是适应性进化的吗?(2) LAEWC的存在/缺失是否与生态生理功能相关性状(如化学防御和光合特性)共变?(3) LAEWC是否与环境变化有关?计算性状发生正向选择的时间，并随物种进化和基因进化检测生理生态性状和环境因子的系统发育信号(PS)，以了解这些功能性状的协同进化趋势。本研究将生态、生理和气候数据与进化遗传学分析相结合，阐述了黄连的适应性进化gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

14gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba本研究收集了台湾北部亚热带森林长期生态研究(LTER)地点福山植物园(Fushan Botanical Garden)生长的物种，进行形态学、遗传学和生理生态调查。gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

扫描电子显微镜（SEM）中的溶液进行，以检查存在/不存在在叶表皮蜡质晶体的使用桌面型SEM TM3000（日立，东京，日本）的表面。Small pieces of fresh blades (5 mm × 5 mm) between the leaf margin and midrib were cut for microscopic observation and at least two individuals were adopted for checking the presence/absence of the epicuticular wax crystals at an accelerating voltage of 15 kV in order to obtain high image resolution signals.

分子技术gydF4y2Ba

我们从每个物种的一个个体中取样新鲜叶子，新鲜叶子储存在RNAguardian溶液中(MBGEN Bioscience，台北，台湾)，温度为- 80°C。RNA提取遵循Gambino等人的[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]的方法，并使用CTAB裂解缓冲液和TRIzol (Life Technologies Corp. California, USA)的基因组DNA去除糖和多酚。为了了解遗传变异，并通过比较基因的进化速率来测试选择压力，4个参与蜡主链合成的候选基因(gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba和gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba）， 规定 （gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba），和运输（gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba)进行cDNA测序。其他基因，如gydF4y2BaWIN1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba蜡状gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaECRgydF4y2Ba也参与蜡的合成，未能放大，不能用于本研究。因此，只有四个gydF4y2BaCERgydF4y2Ba本研究确定候选基因为LAEWC相关基因。六个与蜡无关的基因(gydF4y2Ba帽gydF4y2Ba，gydF4y2BaDGDgydF4y2Ba，gydF4y2BaESRKgydF4y2Ba，gydF4y2Ba时尚gydF4y2Ba，gydF4y2BaSAHHgydF4y2Ba， 和gydF4y2Ba山姆gydF4y2Ba)也作为基因组DNA的参照基因进行了测序。通过对克隆扩增产物进行测序，经过特异性引物筛选和多重检查，所选基因均为同源基因，包括4个LAEWC相关基因和6个蜡类无关基因。引物序列、序列信息(包括序列长度、编码区域百分比和GenBank登录号)列于附加文件(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。这些基因在其他组织中也有功能，包括花粉和其他植物的近轴表皮[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba因此，我们将重点研究LAEWCs存在与不存在LAEWCs的物种叶片组织中表达的基因。利用yT&A克隆试剂盒(yestaybiotech，台北，台湾)克隆扩增的cDNA片段。每个物种选取3个克隆进行测序，M13F/M13R作为引物进行测序。双向DNA测序使用ExoSAP-IT (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA)和ABI BigDye 3.1终止周期测序试剂盒(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)，使用ABI PRISMH®3730XL DNA测序仪(Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA)。由于染色体数目的微小变异gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba物种(几乎所有报告的物种都是2n = 24， [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba];植物染色体数目指数gydF4y2Bahttp://www.tropicos.org/Project/IPCNgydF4y2Ba)和多倍体的不可能性，本研究未考虑不同克隆同源的可能性。本研究提供的所有序列均保存在NCBI GenBank的Accessions KY458808-KY458955中。gydF4y2Ba

遗传分析gydF4y2Ba

在BioEdit的帮助下对DNA序列进行了比对和检查[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．每个基因的比对的序列被用于使用MEGA 6.0 [由邻接（NJ）方法，最大似然（ML）方法的系统发育重建，以及贝叶斯推理（BI）gydF4y2Ba48gydF4y2Ba， PhyML 3.0 [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]和MrBayes 3.2 [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba),分别。NJ树重建采用最大复合似然模型作为核苷酸替换模型，设置两两缺失进行间隙处理。对于PhyML，使用最近邻交换(NNI)进行树搜索，使用近似似然比检验(aLRT)估计分支支持度。对于BI树，通过对1000万代的MCMC (Markov chain Monte Carlo)并行模拟得到了共识树。6个内参基因也被用来重建物种树。由于无法获得最接近外群的序列gydF4y2BaChrysolepisgydF4y2Ba,我们选择gydF4y2BaQuercus栎树gydF4y2Ba，gydF4y2Ba齿栗叶mollissimagydF4y2Ba， 和gydF4y2BaFagus sylvaticagydF4y2Ba在BEAST 1.8.2中为外群[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．一亿年前（妙）为壳斗科[起源时间gydF4y2Ba52gydF4y2Ba60岁时gydF4y2Ba水青冈属gydF4y2Ba和gydF4y2Ba齿栗叶gydF4y2Ba分歧[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]作为对数正态松弛分子模型下分子定年的校准点。在物种树重建中，选择了Yule的纯种形成模型作为物种形成模型。在汇总统计中使用了每10,000代抽样的10亿个MCMC代。然后将LAEWC的特征状态映射到物种树中进行特征转移事件的假设。值得注意的是，虽然外群gydF4y2Ba问:栎树gydF4y2Ba被编码为“缺席”的LAEWC，大多数gydF4y2BaQuercusgydF4y2Ba种显示“存在” [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．最近的事gydF4y2BaChrysolepisgydF4y2Ba披露“缺乏”LAEWC [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，但本研究无法获得该外群的序列和资料，故采用gydF4y2Ba问:栎树gydF4y2Ba为了生根，但在小组之后的“缺席”状态。gydF4y2Ba

为了测试四个LAEWC相关基因的选择信号，一个基因所有核苷酸的替换率(gydF4y2BaKgydF4y2Ba)，非同义核苷酸取代率(gydF4y2BaK agydF4y2Ba）和同义置换率（gydF4y2Baks.gydF4y2Ba)与内参基因进行比较。采用依赖两组Wilcoxon Signed Rank Test (WSRT)和简单线性回归(SLR)检验LAEWC相关基因与内参基因的组间差异。由于LAEWC祖先状态的不确定性gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba，我们开发了三个场景，考虑是否存在LAEWCgydF4y2Ba．gydF4y2Ba(2) LAEWC的独立损失事件正向选择;(3)LAEWC的一个早期增益事件和随后的损失事件正向选择。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)．PAML v.4 codeml分析下的分支模型[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]用于假设检验和gydF4y2BaK agydF4y2Ba/gydF4y2Baks.gydF4y2Ba（gydF4y2BaωgydF4y2Ba)以> 1为阳性选择标记。模型的恒演化速率约束gydF4y2BaωgydF4y2Ba < 1 around all branches of the tree was used as the null hypothesis (Fig.1gydF4y2Ba)．似然比测试（LRT），其计算对数似然的零和备择假设之间的2×差异（2ΔL），用于通过评估最佳拟合选择性假说gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

生态生理测量与分析gydF4y2Ba

LAEWC的存在与光合效率和水分利用效率(WUE =净光合速率/蒸腾速率)有关[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，碳储存效率[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，昆虫和致病应激防御[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba因此，等等，测量了几种环境和生态学参数与Laewc特征相关。然而，由于实验全部限制在佛山植物园中生长的植物，而不是在原来的栖息地，并非所有环境因素都可以直接衡量或考虑。此外，在以前的研究中报告了这种属的WUE相关性状，例如本属的气孔形态，在物种之间没有显着变化[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．首先，我们测量了光系统II (YII)的植物化学产量，它是光系统II在稳态光合光照条件下用于光化学的能量的指示，即作为光合效率的指标。每个物种超过20个样本(gydF4y2BangydF4y2Ba= 20~ 52)，并将每个叶片样品的三个测量值取平均值。YII用MINI-PAM-II光合作用产量分析仪(Heinz Walz GmbH, Germany)测定。gydF4y2Ba

酚酸(PA)是一组与色素沉着、生长、繁殖、抗病原体和食草动物等有关的次生代谢物，代表了受自然选择影响的适应性特征[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．PA也被认为在植物抵抗真菌病原体和植食性昆虫方面起着化学生态作用[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．干叶（0.1克）放置在60％的甲醇溶液（含3％的HCl），然后在4℃下（3000转）进行离心10分钟。总酚含量用福林 - 乔卡梯奥测定试剂根据由单件和罗西[描述的方法gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．简单地说，将100 μL样品与2 mL 2% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）碳酸钠溶液2分钟，然后向反应混合物中加入2mL 50％的50％Folin-Ciocalteu试剂。在室温下温育30分钟后，在750nm下拍摄吸光度读数。用力用作参考标准，结果表示为毫克小酸当量（Mg Gae）/ g干燥的草药材料。所有物种都被测量了四到五次，并且丢弃了数据中的任何异常值。gydF4y2Ba

碳含量(C)归因于木质素、纤维素和碳水化合物[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]，与环境光条件正相关，与昆虫植食性丰度负相关[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．叶片氮含量(N)是蛋白质RuBisCO的组成部分，与最大光合速率相关[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，并与经济增长率和能源供应正相关[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．叶片碳氮比是营养限制的代理(cf. [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba])，通常与潜在增长率相关(cf. [gydF4y2Ba69gydF4y2Ba])。除测定叶片C、N含量外，利用稳定同位素比值(R)测定了叶片物质的同位素特征gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC /gydF4y2Ba^12gydF4y2BaC和gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba不/gydF4y2Ba^14gydF4y2BaN and calculated the delta (δ) notation by the equation δ = [(RgydF4y2Ba_{桑普gydF4y2Ba}/gydF4y2BaRgydF4y2Ba_{性病gydF4y2Ba}）-1] × 1000‰, where theRgydF4y2Ba_{桑普gydF4y2Ba}和gydF4y2BaRgydF4y2Ba_{性病gydF4y2Ba}是样品和国际标准的同位素比率（维也纳小便德福BanemniteδgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC和空气NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba为δgydF4y2Ba^15gydF4y2BaN），分别。因为在光合作用的碳固定的过程中，的RuBisCO可以更容易地利用gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba这可能会降低gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC比大气gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC，该δgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC能准确地反映固碳(COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba摄取）光合作用的效率;同样，δgydF4y2Ba^15gydF4y2BaN也比叶片N含量更能准确反映RuBisCO的反应效率[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．的δgydF4y2Ba^15gydF4y2Ba氮也被认为是植物对环境响应(如光合作用和水分蒸腾)的综合参数。用于测量C N δgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,δgydF4y2Ba^15gydF4y2BaN，叶片样本(gydF4y2BangydF4y2Ba> 5每一种)完全干燥(在50°C烘箱干燥> 7天)并研磨成粉末并完全混合。干粉样品送台湾SGS有限公司测量C, N， δgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,δgydF4y2Ba^15gydF4y2BaN仿照Carter和巴威克[的协议gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

采用广义线性模型进行Logistic回归，检验LAEWC存在与否与生态生理性状的相关性。LRT用于比较空模型。系统发育主成分分析(pPCA) [gydF4y2Ba72gydF4y2Ba利用所有的生态生理测量和海拔因子(最低(min Alt)、最高(max Alt)、中海拔分布(mid Alt)和海拔分布范围(ΔAlt))，并采用R packages phytools [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．我们进一步通过PS试验检测这些性状是否与LAEWC相关基因同步共适应。由此的gydF4y2BaλgydF4y2Ba［gydF4y2Ba74gydF4y2Ba),显得过于gydF4y2BaKgydF4y2Ba［gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，在特征进化的布朗运动假设下运行[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]用于测试系统发育与特征的重要性。这些分析基于物种树和青少年相关基因的四种基因树。如果生态学特性揭示了物种树的显着ps，则建议特征符合系统发育的利基保守主义假设（PNC，如果gydF4y2BaKgydF4y2Ba> 1 (gydF4y2Ba77gydF4y2Ba)，或者角色进化符合随机化过程，与物种进化无关[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．如果在基因树中检测到显著的PS，则表明该性状与该基因共适应。gydF4y2Ba

的物种之间的SEM观察和差动LAEWC性状gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba

在所有检查gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba种的气孔只出现在轴的背面，没有下种的变化(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．根据SEM观察，八种具有LAEWC，包括gydF4y2Bal . amygdalifoliusgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . dodonaeifoliusgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . formosanusgydF4y2Ba，gydF4y2BaL.Baber.gydF4y2Ba，gydF4y2Bal . lepidocarpusgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . nantoensisgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . shinsuiensisgydF4y2Ba， 和gydF4y2Bal . taitoensisgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．LAEWC主要是薄膜和片状的(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．伴随Laewc的存在观察到叶子胎儿（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．相比之下，其他六种(gydF4y2BaL.短尾gydF4y2Ba，gydF4y2Bal .角膜gydF4y2Ba，gydF4y2Bal . hanceiigydF4y2Ba，gydF4y2BaL. HarlandiigydF4y2Ba，gydF4y2Bal . kawakamiigydF4y2Ba， 和gydF4y2Bal . konishii称来自gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)缺乏LAEWC，毛状体稀少，表面无毛，气孔裸露。所有6例患者的近轴面均无毛，缺乏表皮蜡样晶体(附文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。为了确保LAEWC的存在不具有可塑性和环境影响，我们还检查了我们的结果与之前研究的样本之间的一致性[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．本研究和之前的研究中采用的所有物种在LAEWC中存在/缺席表现出一致性，在LAEWC中存在/缺席表现出较强的稳定性。gydF4y2Ba

一般来说，叶背面可分为五种类型:(1)通过蜡生长的单细胞毛状体和膜状蜡状晶体裂缝中的星状毛状体。gydF4y2Ba2a d m ngydF4y2Ba）;（ⅱ）在叶背面（图膜状蜡晶体的几乎完全覆盖。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba）;(iii)浓密的单细胞毛状体通过蜡晶体生长(图)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba）;(iv)单细胞毛状体通过蜡膜生长，蜡膜上有未覆盖的星状毛状体(图)。gydF4y2Ba2 k, lgydF4y2Ba）;(v)叶背面气孔裸露，无蜡晶覆盖(图;gydF4y2Ba2b, c, g, h, i, jgydF4y2Ba)．此外，与LAEWC共存的叶背面毛状体在不同物种间也存在差异:平行的簇状毛状体(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba），星状毛乳头与（图gydF4y2Ba图2a，d，E，K，NgydF4y2Ba)，单细胞毛状体(图gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)和宽基部毛状体(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba)．有LAEWC的8种植物也有贴附的平行簇(图。gydF4y2Ba2a d e f k ngydF4y2Ba)．有些种在叶背面无毛(图。gydF4y2Ba2b, c, g, h, i, jgydF4y2Ba)．近轴表皮的主要特征是垂周壁的形态和表皮细胞的形态。背斜壁是弯曲的、直的或波状的。表皮细胞不规则圆形、规则或多边形。近轴面未见气孔gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。在各种物种之间的皮毛都没有这项研究的话题，但值得进一步调查。gydF4y2Ba

LAEWC的人物状态是不相关的空间分布gydF4y2Ba

根据Maxent进行的物种分布建模[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]，并实现了R包dismo [gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，数种具有重叠分布和这些分布不与LAEWC和不LAEWC物种之间明显不同（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。这一结果表明，LAEWC的存在/缺失与目前物种的分布无关，也可能不能反映一个小岛内细微的环境差异。gydF4y2Ba

系统发育分析不支持LAEWC单个性状转移事件gydF4y2Ba

树种树显示，具有LAEWC的树种不构成单一枝;没有LAEWC的物种也是如此(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．用6个内参基因重建的物种树显示了被研究物种的祖先gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba种的年代可追溯到24.19年(图。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．具有LAEWC物种的3个独立谱系(分支)从11.16 Mya、10.74 Mya和1.55 Mya开始合并，而非LAEWC物种的分支可以合并到6.47 Mya和4.01 Mya(图1)。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．这些年代大致与中新世晚期和上新世相吻合，比研究物种分布的台湾岛(不到4mya)的形成时间还要早[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．这样的年代测定表明，这些物种在台湾的出现不是殖民台湾岛后辐射的结果，而是多重殖民事件的结果。这一推论也得到了叶绿体DNA树的支持(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。这一结果表明，LAEWC的存在/缺失并不是适应岛屿环境的衍生特征，而是一种适应特征的残余。LAEWC的祖先状态(存在或不存在)gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba仍是未知的，因为系统进化上封闭的属(外群，gydF4y2BaQuercusgydF4y2Ba和gydF4y2Ba齿栗叶gydF4y2Ba)在LAEWC中具有不同的特征状态，而根据叶绿体DNA树，在等速率(ER)模型下MCMC模拟得出的模糊祖先状态(Additional file)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。然而，系统发育分析仍然提供了证据，LAEWC的存在或不存在不是一个单一的事件gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba进化（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。因此，至少可以假设获得或失去LAEWC的三种演化情景:(a)获得LAEWC是独立事件，(b)失去LAEWC是独立事件，(c)失去LAEWC是一个逆转事件(图1)。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基因树和物种树之间不一致的树形拓扑结构，从参照基因推断gydF4y2Ba

一般来说，与老年商的物种的分组模式和没有Laewc的基因树gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba与6个参照基因重建的物种树相似，但gydF4y2Bal . harilandiigydF4y2Ba(不含LAEWC的种)归为一类gydF4y2Bal . dodonaeifoliusgydF4y2Ba(LAEWC)(图gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)．某些物种拥有蜡质相关基因的两个单倍型，而两个单倍型并不构成一个分支，这可能是由于基因复制或祖先多态性的保留[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．根据之前的报道，在所有的模式物种中，只能找到一个副本gydF4y2BaCERgydF4y2Ba所有车型品种候选基因[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba］．此外，大多数物种不具备一个以上的单倍型。因此，种内不同的单倍型被认为是种内多态性，而不是一个小的基因家族所造成的重复的不同成员。此外，LAEWC基团，其不形成在任何基因树或树物种一个单系内，则gydF4y2Bal . taitoensisgydF4y2Ba分组与gydF4y2Bal . dodonaeifoliusgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . formosanusgydF4y2Ba， 和gydF4y2BaL.Baber.gydF4y2Ba在基因树木gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)，但与gydF4y2Bal . lepidocarpusgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . nantoensisgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . shinsuiensisgydF4y2Ba， 和gydF4y2Bal . amygdalifoliusgydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．基因树gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba是从其它基因树和物种树，其显示LAEWC物种与非LAEWC物种的马赛克拓扑分布（图不同。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．此外，所有的克隆gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba在物种内是单形的(每个物种有一个单倍型)，表明物种有很强的遗传约束。gydF4y2Ba

LAEWC相关与不相关基因的进化率比较gydF4y2Ba

WSRT的原假设是两组观测值之间的中位数没有差异，而SLR的原假设是两组观测值之间的独立分布(没有关系)。因此，我们使用WSRT检测LAEWC相关基因与非相关基因的进化速率差异，以及LAEWC相关基因的功能与非功能变化率。我们还进行了SLR，以检验LAEWC相关基因是否独立于物种分化而进化。Wilcoxon检验显示gydF4y2BaKgydF4y2BaLAEWC不相关(参考)基因与gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 2.2 × 10gydF4y2Ba^{−16gydF4y2Ba}），gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 1.13 × 10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}）， 和gydF4y2BaCer7.gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0005)，但内参基因与gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba（gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 0.734) (Additional file1gydF4y2Ba：图S4A-D），表示进化率gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba和参照基因没有区别。由于内参基因的大部分区域是非编码区域(内含子)，这被认为是自由选择的，我们比较了gydF4y2BaKgydF4y2Ba非同义替代率的参照基因(gydF4y2Baks.gydF4y2Ba)的相关基因。WSRT的显著结果(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)表明LAEWC相关基因与内参基因的变异率不同，但SLR的正性表明这些LAEWC相关基因的沉默突变仍然遵循物种分化的顺序(Additional file)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4E-H)。当比较gydF4y2Baks.gydF4y2Ba与LAEWC相关基因的非同义替换率(gydF4y2BaK agydF4y2Ba)，非常显著较低gydF4y2BaK agydF4y2Ba对于这些LAEWC相关基因gydF4y2Baks.gydF4y2Ba被发现WSRT（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4I-L)。结合比较gydF4y2Baks.gydF4y2BaLAEWC相关基因的gydF4y2BaKgydF4y2Ba内参基因和gydF4y2BaK agydF4y2Bavs。gydF4y2Baks.gydF4y2Ba通过对LAEWC相关基因的研究，我们发现LAEWC相关基因比其他蜡类不相关基因进化得更快，并经历了强大的选择压力来抑制氨基酸的变化。gydF4y2Ba

假设检验表明正向选择gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba关于LAEWC的增益事件gydF4y2Ba

结果表明，除了gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba获得LAEWC的场景(假设1，图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；2ΔL = 6.754,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.009,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，在所有性状转移事件的进化情景下，其他laewc相关基因均不能拒绝常量速率模型(M0)。虽然推断获得LAEWC的三个分支有ω > 1 in的估计gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba在假设1下，并不是所有的分支都被检测到具有相同的氨基酸替代:只有一个和两个氨基酸替代在gydF4y2BaL.Baber.gydF4y2Ba并在共同祖先的分支gydF4y2Bal . dodonaeifoliusgydF4y2Ba和gydF4y2Bal . formosanusgydF4y2Ba,分别。在其他LAEWC物种的共同祖先中没有发现替代，提示假阳性。LAEWC的增益在发展的早期阶段gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba建议采取在多个时间和地点独立地选自不存在LAEWC中的可能的祖先状态（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。然而，LAEWC损失一定的谱系进行推断（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)，但是这些“损失”事件都不是在选择压力下发生的(表S3)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们还测试了阳性选择是否在获得或失去LAEWC性状后，允许ω > 1在所有衍生谱系中发挥保留LAEWC的作用。结果表明，常数率模型的零假设在所有情况下都不能被拒绝(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。这意味着LAEWC的间歇性增益可能是适应性辐射的原因，而不是持久的发散。gydF4y2Ba

PA与laewc相关基因进化的关系gydF4y2Ba

要了解LAEWC的增益是否有利于树木的适应，有关光合作用或应激防御等某些生理生态学特征进行测量（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)，作为自变量与LAEWC特征相关。除C和C/N比值(2ΔL = 5.791和3.845，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.016, 0.050gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，空模型不能被有其他独立变量的模型所拒绝(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．即便如此，C和C/N的影响仍不能显著预测LAEWC的特征状态(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.111, 0.090gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这些结果表明，存在/不存在的LAEWC不共变与当前生理生态学特征，即是无关的当前环境的压力。这一结果与缺乏与系统发育主成分分析等生理生态字符LAEWC的协方差（图是一致的。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

PS分析表明，没有生态生理变量能够反映物种的进化，但PA可以反映物种的基因进化gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba（gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 0.483,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.014)和gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba（λ = 0.870,PgydF4y2Ba= 0.011;gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 0.549,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.007,表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．PA的显著PSgydF4y2BaCER1gydF4y2Ba和gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba基因树表明PA和LAEWC骨干基因共同进化。然而，化学(PA)和物理(LAEWC)胁迫防御的系统发育保守性假说均被否定gydF4y2BaKgydF4y2Ba< 1。除PA外，代表潜在生长率和营养限制的C/N比值也可以反映植物的进化gydF4y2BaCER5gydF4y2Ba基因（布隆贝格的gydF4y2BaKgydF4y2Ba= 0.290,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.034,表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．而C、N、δ无明显PSgydF4y2Ba^13gydF4y2BaC,δgydF4y2Ba^15gydF4y2BaN和YIIgydF4y2BaCER5gydF4y2Ba基因树及其他基因树gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)表明LAEWC的适应性进化与光合效率、水分利用效率和/或养分分配没有关系。gydF4y2Ba

在LAEWC和皮毛同步字符状态gydF4y2Ba

本研究采用14gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba采用遗传和生理生态评价方法，研究了LAEWC的适应特性。首先，扫描电镜显示，14种植物中有8种在叶片表面背面有明显的膜状蜡晶结构(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，但在叶片正面层只发现非常稀疏或有时没有蜡膜(另附文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。缺乏叶形蜡晶体表明在叶片震动蜡的进化形成上没有选择性压力或光强度的光度gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba(cf。gydF4y2Ba87gydF4y2Ba])。与此相反，背面层，其中，所述气孔主要分布，在膜状蜡晶体的差异表明LAEWC的光合作用的效率和/或节约用水的生理生态相关性。草的研究（gydF4y2BaAgrosti多茎目gydF4y2Ba，禾本科）进一步指出，在上叶表面上的细胞外蜡的分布的差异也可以与盐的在不同地点的保留[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．有趣的是，在我们的研究材料中，毛状体的存在与LAEWC的存在有关(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）和毛状体的形式多样的也有报道在以前的研究讨论[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，但值得注意的是，在本研究未采用的物种中，很少有例外的报道(例如，gydF4y2BaL. calophyllusgydF4y2Ba和gydF4y2BaL. Oleifolius.gydF4y2Ba在[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba])。这些特征的同时出现可能表明，例如，适应的协同功能在防御昆虫叮咬中发挥物理屏障的作用[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]或拒水[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．然而，毛状体类型多在蜡膜复杂gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，毛状体生理生态的功能，其用蜡膜电位联动，毛状体的交链形态发生相关的基因，例如gydF4y2Bamixta.gydF4y2Ba式(gydF4y2Ba90gydF4y2Ba，适应性特征不在此讨论。gydF4y2Ba

LAEWC对所有生理生态性状的功能独立性gydF4y2Ba

我们测量的大多数因素都没有揭示物种树的重要PS，包括光合效率，水使用效率和/或营养分配依赖性特征。这与其他叶子和表皮毛发和表皮毛发的形态/分布没有可区分差异[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba尽管我们不能排除其他推动适应的因素gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．其中，在蜡质生物合成途径(即蜡质合成途径)的主干基因树中，PA含量显示出显著的PS。gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba和gydF4y2BaCER3gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．防御性化学物质的组成通常直接反映了植物的食草性胁迫，并揭示了积极选择的强烈迹象[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．建议在物理防线中发挥作用[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．两种假说可以解释化学防御策略和物理防御策略之间的共同进化关系:(1)化学防御和物理防御投资之间的权衡导致负相关结果[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，(2)协同防御假说表明化学性状值与物理性状值正相关[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．同样，植物的防御和生长投资之间的权衡可能导致防御和光合作用(或营养)性状之间的负相关。然而，我们的研究表明，化学防御性状与物理防御性状之间既不存在正相关也不存在负相关，LAEWC与光合作用和养分吸收/储存指数之间也不存在相关(见表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这意味着化学防御策略和物理防御策略资源投资的权衡假设不成立。我们的结果与在嗜myrmecophilic植物中发现的相似gydF4y2BaMacaranga Tanarius.gydF4y2Ba结果表明，叶片的化学成分与叶片表面蜡质含量无相关性[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．然而，在这种情况下，毛状体的密度有很强的正相关，表明植物具有复杂的协同防御策略[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．这项研究呼应未来值得探索的上方，并认为毛。与此同时，系统发育PCA透露了关于化学防御性状（PA）和其他营养物和光合作用索引（图2中的相反说明的尺寸。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，支持防御性投资与增长性投资之间的权衡假设gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．支持另一个假设的证据，即分散资源投资的风险导致防御特征之间较少或没有关联的普遍现象，即独立进化，没有发现[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

LAEWC的演化变化与PA共同适应gydF4y2Ba

虽然我们没有发现任何生理生态性状与LAEWC之间的相关性(见表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，我们的研究已经发现PA含量与蜡生物合成途径的骨干基因的进化有很强的关系。其中一个主基因，gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba，也被发现与LAEWC的获得呈正相关(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明化学防御特征和物理防御特征的进化是同步的。虽然其他潜在的功能解释可以考虑gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba- 例如，花粉形态[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]和Adaxial Wax角质层[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在花粉或近轴蜡质角质层中进行适应性解释的可能性似乎不太可能，因为花粉的变异非常小[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba]和近轴表皮形态[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．因此，我们注重与LAEWC和防御性特质我们的讨论gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba．Contrasting hypotheses of parallel evolution and coadaptation explain how the chemical (e.g. PA) and physical (e.g. LAEWC) defensive characters covary: the former describes synergistic evolution of both traits following species divergence, while the latter suggests synchronous changes of characters in response to the same stress but independent from the evolution sequence of the species. In this case, nonsignificant PS of the PA with the species tree has excluded the possibility of parallel evolution of these two traits. Several studies have shown independent or unlinked relationships between the chemical and physical defensive traits and do not support the parallel evolution hypothesis of two defensive strategies [42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

相反，在两个PA和LAEWC一个coadaptive进化关系建议由于对蜡生物合成的基因骨干PA的显著PS（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．此外，积极的选择上gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba表明PA与蜡主链基因进化的关联反映了性状创新的适应性结果。除了gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba，在任何可能的进化情况下，所有被检测的基因都没有正向选择的迹象(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．主基因的正向选择gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba表明LAEWC的性状变化是最主要的适应功能变化。过度表达gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba渗透胁迫会增加角质层蜡质原料的产量和积累，增加植物对细菌和真菌病原菌的敏感性，降低角质层的渗透性和土壤水分亏缺敏感性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

虽然LAEWC在现存的共同祖先的状态gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba是模棱两可的，LAEWC的获得可能发生在物种分化的早期阶段(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。LAEWC在姐妹组的缺席支持了这一想法，gydF4y2BaChrysolepisgydF4y2Ba，经扫描电镜观察后[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．在所述LAEWC的获得的检测到的阳性选择指示LAEWC的自适应优点gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．此外，选择压力gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba没有保留用于维护字符(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。叶片的功能性状如比叶面积和水分性状与物种生态位相关，强烈反映物种分布[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba，gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．然而，基于当前气候变量的物种分布建模表明，有LAEWC和没有LAEWC的物种之间没有明显的差异(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。这可能表明LAEWC的特点可以反映这导致特质的变化，而不是目前的环境现实过去的环境变化。gydF4y2Ba

晚中新世到上新世的气候变化解释了LAEWC的特征转移gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba

LAEWC的性状转变的定时被建议作为晚中新世和上新世（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．晚中新世至第四纪的气候变化可能与LAEWC的特征转移事件相吻合gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．中新世的气候稍微温暖和潮湿，并产生了季风系统，影响了亚洲的植被[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba，gydF4y2Ba98gydF4y2Ba，gydF4y2Ba99gydF4y2Ba］．晚中新世以后，气候逐渐变冷，变得干旱[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101gydF4y2Ba］．晚中新世至上新世的气候变化加速了岛屿物种的多样化[gydF4y2Ba102gydF4y2Ba，gydF4y2Ba103gydF4y2Ba，gydF4y2Ba104gydF4y2Ba，gydF4y2Ba105gydF4y2Ba]，其部分原因可能是由于伴随着大陆与岛屿分离和连接的海平面波动[gydF4y2Ba106gydF4y2Ba］．遗传隔离和对崎岖地形的适应的协同作用可能加速了东南亚岛屿的物种形成过程。gydF4y2Ba

自晚中新世至上新世边界以来，性状的创新已经被发现增强了几种植物的多样性。例如，在gydF4y2BaParryagydF4y2Ba和gydF4y2BaDiptychocarpusgydF4y2Ba十字花科的可能有助于植物定植[gydF4y2Ba107gydF4y2Ba］．和人一样gydF4y2BaParryagydF4y2Ba和gydF4y2BaDiptychocarpusgydF4y2Ba由防御昆虫获取LAEWC以增加生存可能在同一时间昆虫物种多样化加速了物种多样性在这些热带和亚热带石奥克斯在晚中新世到上新世时期，包括热带森林甲虫[gydF4y2Ba108gydF4y2Ba]，大多数Nymphalid [gydF4y2Ba109gydF4y2Ba]和果蝇(gydF4y2BaRhagoletisgydF4y2Ba，[gydF4y2Ba110gydF4y2Ba])。此外，一些植物物种发展出了更高的干旱适应性，通常以节水特性(即高水力安全边际)为特征gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba，表现出较强的抵御气候变化的潜力[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba］．然而，尽管这些特性能反映环境和气候变化，它们可能会有所彼此独立[行事gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，因此这些性状之间的相关性较差(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)在我们的研究。这可能是因为特定的性状组合可能只在特定的环境中使物种的表现最大化[gydF4y2Ba111gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

晚中新世-上新世骨干基因的阳性选择gydF4y2BaCER1gydF4y2Ba伴随PA的化学防御性特征的内容叶表皮蜡质的建议与许多植食性昆虫的多样化和PA，蜡和防御适应之间潜在联系的适应性变化和多样化率一致gydF4y2Ba分布gydF4y2Ba．它生产这种联系没有持续随时间的选择压力;然而，性状过渡一直保持。蜡的性状与其他生理生态字符的无相关性表明功能独立性。在化学和物理防御策略进化关联有人建议作为coadaptive现象抵抗代替反射性状的平行进化多个或复杂植食性应力。我们的研究开始用形态学观察并得出结论已经发现在过去的选择性压力的防御特性的同步自适应变化，通过遗传和生理生态分析发现的证据。我们贡献的机制热带和亚热带森林物种在气候变化面前多元化的一个可能的解释。gydF4y2Ba

2ΔL:gydF4y2Ba

2×两个模型的对数似然差值gydF4y2Ba

美国广播公司(ABC):gydF4y2Ba

磷酸腺苷磁带gydF4y2Ba

ABCG:gydF4y2Ba

ABC运输机G家族gydF4y2Ba

aLRT:gydF4y2Ba

近似的似然比检验gydF4y2Ba

Alt:gydF4y2Ba

高度gydF4y2Ba

BI:gydF4y2Ba

贝叶斯推理gydF4y2Ba

C:gydF4y2Ba

碳含量gydF4y2Ba

CER：gydF4y2Ba

ECERIFERUMgydF4y2Ba

ER：gydF4y2Ba

Eequal率gydF4y2Ba

GAE:gydF4y2Ba

没食子酸当量gydF4y2Ba

KgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

所有核苷酸的取代率gydF4y2Ba

K agydF4y2Ba：gydF4y2Ba

产生的替代率gydF4y2Ba

ks.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

同义替换率gydF4y2Ba

LAEWC:gydF4y2Ba

叶背面表皮蜡状晶体gydF4y2Ba

lt:gydF4y2Ba

长期生态研究gydF4y2Ba

LTP：gydF4y2Ba

脂质转运蛋白gydF4y2Ba

M0:gydF4y2Ba

恒定速率模型gydF4y2Ba

密度:gydF4y2Ba

马尔可夫链蒙特卡洛gydF4y2Ba

ML:gydF4y2Ba

最大似然gydF4y2Ba

米娅:gydF4y2Ba

几百万年前gydF4y2Ba

n：gydF4y2Ba

叶片含氮量gydF4y2Ba

NJ:gydF4y2Ba

Neighbor-joininggydF4y2Ba

NNI:gydF4y2Ba

最近的邻居交换gydF4y2Ba

PA:gydF4y2Ba

酚酸gydF4y2Ba

PNC:gydF4y2Ba

系统生态位保守主义gydF4y2Ba

车牌提取:gydF4y2Ba

系统发育主成分分析gydF4y2Ba

PS:gydF4y2Ba

系统发育信号gydF4y2Ba

接待员:gydF4y2Ba

稳定同位素比率gydF4y2Ba

扫描电镜:gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

单反:gydF4y2Ba

简单线性回归gydF4y2Ba

VLCFAs:gydF4y2Ba

Very-long-chain-fatty-acidsgydF4y2Ba

白细胞:gydF4y2Ba

白棕色复合同源蛋白gydF4y2Ba

Win1：gydF4y2Ba

蜡INDUCER1gydF4y2Ba

WSRT：gydF4y2Ba

威尔考克森符号秩检验gydF4y2Ba

WUE:gydF4y2Ba

水分利用效率gydF4y2Ba

YII:gydF4y2Ba

光系统II的植物化学产量gydF4y2Ba

ΔAlt:gydF4y2Ba

分布的海拔范围gydF4y2Ba

ωgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

K agydF4y2Ba/gydF4y2Baks.gydF4y2Ba

作者感谢黄世英、蒋宇忠和王春能对改进本研究提出的建议，并感谢Dawn Schmidt和Rosemary Pennington博士的英文编辑。我们感谢科技部国家生物技术核心设施计划国家基因组医学中心提供的技术/生物信息学支持。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由台湾科技部(MOST 105-2628-B-003 -002 -MY3)和台湾国立台湾师范大学(NTNU)资助。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究提供的所有序列均保存在NCBI GenBank的Accessions KY458808-KY458955中。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 杨志凯、黄炳宏对这部著作贡献相当。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 国立台湾师范大学生命科学学院，通讯地址:台北市汀州路四段88号，11677gydF4y2Ba

   杨志凯，黄炳宏，何绍伟，王真车，廖培春gydF4y2Ba

2. 国立台湾大学生物资源与农业学院实验森林，台北市，南投55750gydF4y2Ba

   Chih-Kai杨gydF4y2Ba

3. 中华文化大学园艺与生物科技系，台北，11119gydF4y2Ba

   梦圆黄gydF4y2Ba

4. 2 .内蒙古科技大学包头师范学院资源与环境学院，内蒙古014010gydF4y2Ba

   剑高gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

PL和JW构思了这项研究。CY和SH收集材料。CY、BH、MH、SH进行了实验。BH, JG和SH分析了数据。PL写了论文。JW, CY和BH对手稿进行了严格的审查。所有的作者都参与了讨论，阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba培俊廖gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明不存在利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba