种间叶绿体基因组序列多样性与基因组资源Diospyros.

背景

柿子是中国、韩国和日本的传统健康食品。然而，由于缺乏形态学和DNA标记，柿子产业的发展受到了严重的抑制。

结果

叶绿体基因组Diospyros Cathayensis.，D.弗吉尼亚州，d . rhombifolia和D. Deyangensis.新测序。十个叶绿体基因组的比较分析，包括六个先前公布的叶绿体基因组Diospyros.提供了对该属基因组序列多样性和基因组资源的新认识。八hyper-variable地区,trnh-psba.，rps16-trnQ，rpoB-trnC，RPS4-TRNT-TRNL，ndhF，ndhF-rpl32-trnL，ycf1一个,ycf1b，可以作为叶绿体DNA标记在物种水平或以上。与不同的叶绿体DNA序列数据相比，完整的叶绿体基因组序列提供了最佳的种间分辨率。

结论

Diospyros鉴定，D. Deyangensis.，D.弗吉尼亚州，d . glaucifolia，D.莲花和D. Jinzaoshi.是与栽培柿子密切相关的重要野生物种D. Kaki。高变异区域可作为DNA标记用于全球遗传多样性检测Diospyros.．对这些分类群的更深入的研究将有助于阐明的起源D. Kaki。

Diospyros.是eBenaceae中最大的属，包括世界各地的400多种，从热带到温带地区的广泛分布和培养。他们的水果是中国，韩国和日本的传统健康食品来源。乌木树是他们坚硬，沉重和暗木的木材的价值。此外，几种物种的树皮，叶子，木材，水果和种子是药物的主要来源。Diospyros柿子是一个重要的经济树和广泛栽培的属植物[1，2]．

在中国，患有柿子植物的培养（Diospyros柿子）对于食用菌和中医通常是特色果树行业区域发展的最佳选择之一，具有不同的品种不同的地区。目前，中国大约有1000个柿子品种。大多数现存柿子品种是来自天然幼苗或芽突变的精英植物。在这些品种中，大多数是授粉 - 常数和涩（PCA）类型，授粉 - 常数和非涩（PCNA）类型的过早柿子和抗病品种是罕见的并且是非常理想的。一般而言，密切相关的野生物种具有精英遗传背景，具有柿子作物的定性改善和高产育种[1，2]．

伍迪的繁殖Diospyros.植物是耗时的，通常是评估杂交厂的性能所必需的十年。由于难以识别Diospyros.种质资源多样性、人工杂交定向育种受到严重抑制。因此，积累遗传信息有助于揭示遗传多样性Diospyros.这里急需植物。

种质资源Diospyros.植物已在使用和表型特征的方面进行了记载，如果子形态，果实颜色，水果质量和花卉特性。Diospyros.植物有4个倍性水平(2n = 2× = 30;2n = 4× = 60;2n = 6× 90;2n = 9× = 135)根据它们的染色体数目[1，2，3.，4，5，6，7]．然而，由于表型和DNA标记的不足和敏感性有限，对遗传分化检测技术的研究数量巨大Diospyros.世界各地的植物仍然是一个全球挑战[8，9，10，11，12]．

在Diospyros.，近年来，分子资源已经开发了物种鉴定。一些叶绿体基因组标记物（如:，mat，trnh-psba.）和核DNA标记物（例如，核糖体DNA的内部转录间隔物）用于区分植物Diospyros.．然而，这些标记的可变性低，或分辨率有限，不能达到目标[3.，13，14，15，16，17，18]．开发更有效的DNA条形码也很重要Diospyros.植物。

被子植物叶绿体基因组是单亲本遗传的，结构相对稳定[16，17]．因此，它被认为是家庭/属属/种类水平的植物系统发育分析的信息和有价值的资源[16，19，20.，21，22，23，24]．在过去的几十年中，已被证明在揭示植物的系统发育和解决以前模糊的分类和系统发育问题时更强大的叶绿体基因组在[16，17，18，19，20.，21，22，23，24，25，26，27，28]．

在这项研究中，我们报告了新测序的完全叶绿体基因组D. Cathayensis.，D. Deyangensis.，d . rhombifolia和D.弗吉尼亚州．我们研究的目的是:(1)评估在Diospyros.；(2)开发新的高效cpDNA标记用于物种鉴定Diospyros.．

取样和DNA提取

新鲜的叶子Diospyros.于2016年春季从中国科学院北京植物园和西北农林科技大学园艺学院国家柿田基因库采集柿子，立即用硅胶干燥，提取DNA。采用中国天根生物技术(北京)有限公司植物基因组DNA试剂盒(DP305)提取总基因组DNA。

叶绿体基因组测序，组装和注释

用超声波干扰器将DNA剪成400 ~ 600 bp的片段。根据制造商的协议，使用NEBNext®Ultra™DNA文库准备试剂盒构建Illumina配对端文库。在Illumina HiSeq 4000平台上进行配对测序(2 × 150 bp)。采用SPAdes 3.10.1对高通量测序数据进行定性评估和组装[29]．使用叶绿体基因组序列Diospyros柿子(加入基因库。以KT223565)为参考序列，利用BLAST方法筛选叶绿体基因组contigs。利用Sequencher (v5.4)和默认参数组装叶绿体基因组的contigs。利用特异性引物或通用引物进行PCR扩增和Sanger测序，进一步证实了叶绿体基因组序列中IRs与SSC/LSC之间存在的核苷酸或缝隙及4个连接区域[20.]．之后，使用毒性8.1 [筛选所有读数均映射到所述拼接叶绿体基因组序列[30.]以避免装配错误。利用Dual Organellar genome Annotator (DOGMA)进行叶绿体基因组注释[31]．利用genome Vx软件绘制叶绿体基因组图[32]．

叶绿体基因组中串联重复的分析和单序列重复

对剧中(微卫星;http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa.）用于检测叶绿体基因组内的简单序列重复（SSR）。最小数量的重复单元的阈值建立如下：> 10用于单核苷酸的单核苷酸，> 5用于三核苷酸的> 4，> 3用于四核苷酸，五核苷酸或六核苷酸或六核苷酸或六核苷酸或六核苷酸SSR。使用声明计划，在完整的叶绿体DNA序列中扫描重复序列，通过分类乘以分类。

叶绿体基因组中的序列分析分析

利用MAFFT对GenBank中4个新测序的叶绿体基因组和6个叶绿体基因组进行了比对[33]使用SE-Al 2.0手动调整[34]．利用mega6.0软件计算整个叶绿体基因组的可变和简约信息碱基位点和遗传距离[35]．进行滑动窗口分析以使用DNASP（DNA序列多态性5.10.01）软件产生叶绿体基因组的核苷酸多样性（PI）[36]．步长设置为200bp，具有600bp窗口长度。

叶绿体DNA条形码分析

基于距离和树木的方法用于评估检测到的超可变区和核心DNA条形码的歧视力:和mat．利用SPIDER的近邻函数进行距离法条形码分析[37]．基于K2P距离模型的每个超可变标记和使用Mega 6.0的每个超可变标记和不同的标记组合构建邻居加入（NJ）树[35]．通过1000引导复制评估对NJ树的图形的相对支持。

基于叶绿体基因组序列数据的系统发育分析

使用整个叶绿体基因组通过最大规则（MP），最大似然（M1）和贝叶斯推理（BAB）构建系统发育树。

使用PAUP V4B10进行MP分析[38Dong等人所描述的[24]．使用raxmL 8.0进行ML分析[39]．对于ML分析，使用伽玛分布（GTR + G）的最佳拟合模型，一般时间可逆，如图1000引导重复所示。BI方法用MRBAYES V3.2进行[40]．对2 × 500万代进行马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)分析，每1000代抽样一次树，前25%作为老化丢弃。其余的树用于构建50%多数规则共识树。当分裂频率的平均标准差保持在0.01以下时，认为已经达到了平稳性。

叶绿体基因组特征

以往的实验表明，同一种植物的叶绿体基因组序列是相同的。因此，我们对四个类群进行了测序Diospyros.（D. Cathayensis.，D.弗吉尼亚州，d . rhombifolia和D. Deyangensis.）使用Illumina Hiseq 4000系统，获得20,675,288至33,584,779〜33,584,779份成对的原始读数（平均读取长度为150bp）。在映射每个成对的读数之后Diospyros.分类，357,721至1,338,624次提取读数，屈服340×至1271×覆盖率（表1）.通过使用基于PCR基测序确认组装序列中的倒置重复（IR）结区域。由此获得高质量的叶绿体基因组序列并用于下游分析。四Diospyros.叶绿体基因组序列保存在GenBank中(登录号:MF288575- MF288578)。

十个完全叶绿体基因组Diospyros.本研究调查的碱基对为157,300对(D．jinzaoshi）到157,934个碱基对（D．deyangensis)的长度。所有叶绿体基因组都具有被子植物典型的四联体结构，由一对反向重复区(IRs: 25,910-26,119 bp)和一个大的单拷贝区(LSC: 86,948 - 87246 bp)和一个小的单拷贝区(SSC: 18,076-18,485 bp)分开(图1)。1；表格2）.每个完整的叶绿体基因组具有以相同顺序排列的113个独特的基因，包括79个蛋白质编码，30个TRNA和4 rRNA基因。每种叶绿体基因组的GC含量相同37.4％（表2）.基因组结构包括基因数和基因令在高度保守范围内Diospyros.（无花果。1；表格2）．

叶绿体基因组的比较分析

重复的简单序列（SSR）的数量范围为48（D. Cathayensis.或d . rhombifolia）至82（D．jinzaoshi)在十个中Diospyros.分类单元。均聚物重复数变异性最高，范围为29 (D. Cathayensis.）到70（D．jinzaoshi），虽然二核苷酸的数量，三核苷酸或五核苷酸重复的差异在十个中没有显着差异Diospyros.分类赛（图。2）.均聚物重复代表了遗传多样性的主要来源Diospyros.．LSC区域共检测到505个SSRs, SSC区域共检测到141个SSRs, IR区域共检测到26个SSRs(图1)。2）.

使用声示软件在叶绿体基因组中检测到四种重复类型。转发重复编号范围从17（D. Kaki.)至22 (D. Deyangensis.），其在十个叶绿体基因组中发现没有显着差异。串联重复数字从20（D．jinzaoshi29（D.弗吉尼亚州）.回文重复数由18 (d .变色或D.弗吉尼亚州)至33 (D. Kaki.）.发生在的回文重复数量的最高值D. Kaki.与其他分类群有显着差异。观察到最高的串联重复数量D.弗吉尼亚州（无花果。3.）.

观察到核苷酸替代数的最低值（31）d . glaucifolia和D.莲花，而核苷酸取代数最大值为1493D. Cathayensis.和D.弗吉尼亚州，根据10个叶绿体基因组的序列比对，显示出更大的变异范围(表3.）.

序列距离之间Diospyros.类群范围为0.0002 ~ 0.0092。最小的序列距离发生在D.莲花和d . glaucifolia，最大的序列距离发生在D.弗吉尼亚州和D. Cathayensis.(表3.）.LSC区是叶绿体基因组中进化最快的区域，IR区是叶绿体基因组中进化最慢的区域。SSC区域的演化速度是中等的。

系统发育分析

系统发育分析表明，所有十个出征的分类都明确歧视，其中七分钟内在其中识别出来（图。4）.品种Diospyros.属于一个人的人D. Kaki。DNA序列数据支持分离位置D. Deyangensis.和D. Jinzaoshi.它们以前被认为是品种，最近的其他研究建议根据形态和DNA特征按物种水平排序[2，3.，4，5，6]．思工d .鉴定和D. Deyangensis.，和思潮D. Jinzaoshi.包括栽培柿子植物最近的野生亲属D. Kaki.（无花果。4）.相对而言，D.莲花和d . glaucifolia，和思潮D.弗吉尼亚州有密切的遗传关系D. Kaki.．D.莲花和D.弗吉尼亚州生产可食用的水果，同时d . glaucifolia主要用于木材生产。D. Cathayensis.和d . rhombifolia这是彼此的基因上，形成一个疏水板。这与基于形态特征的分类相同。d .变色在遗传学上是距离栽培植物最远的分类群吗D. Kaki.在本研究的类群中。

叶绿体DNA标记的发展

根据叶绿体基因组序列对准十个Diospyros.分类群，八个高度可变区域，trnh-psba.，rps16-trnQ，rpoB-trnC，RPS4-TRNT-TRNL，ndhF，ndhF-rpl32-trnL，ycf1一个,ycf1B被发现（图。5）.这8条序列可以作为DNA标记进行分类和揭示遗传差异Diospyros.分类群，高度歧视成功范围为60至100％（表4)，其中演化最快的三个区域(即RPS4-TRNT-TRNL，ndhF-rpl32-trnL,ycf1a）能够区分本研究调查的所有征征。

在进化最快的区域分别检测到72个、122个和123个可变碱基，其中39个、54个和60个信息性碱基，占2.52-2.80%。相比之下，一般推荐的DNA片段(:和mat)分别只取得了40%和80%的歧视成功(表4，附加文件1:图S1)。

当不同方法用于系统发育树重建时获得了类似的结果（附加文件1:图S1)。8个高度可变cpDNA区域的组合序列数据提供了10个高度可变cpDNA区域的系统发育拓扑结构Diospyros.分类群，类似于使用完全叶绿体基因组序列获得的拓扑，但实验成本的更低（图。6）.系统发育树中的所有节点接收到高自举值（100％）。

叶绿体基因组变异与进化

在本研究中，我们对四个叶绿体基因组进行了测序Diospyros.使用Illumina Hiseq-4000平台，并将这些基因组与从GenBank下载的其他6个已发表的叶绿体基因组进行了比较。的叶绿体基因组Diospyros.展示了开花植物的典型的四己钛矿结构，在基因秩序和基因含量中保守，与大多数血管植物谱系相比。叶绿体基因组长度为157,300至157,934bp。IR膨胀和收缩和较大诱导的发生（插入/缺失）被认为是影响高血管卟啉基因组的长度变异的主要机制。在十个的SC / IR边界处仅检测到微小的变化Diospyros.叶绿体基因组。纤维的发生是影响纤维长度变化的主要因素Diospyros.叶绿体基因组。与之前发表的被子植物叶绿体基因组相似，该基因的克隆Diospyros.叶绿体基因组含有比GC含量更多。

简单序列重复序列(SSRs)是一种基因可变的分子标记，广泛应用于群体遗传学[41.，42.]多态性研究和系统发育分析[43.]．使用MISA, ssr在十Diospyros.鉴定了叶绿体基因组。SSR的数量从48到82Diospyros.，类似于Lagerstroemia［28]．在其他植物中报道了具有丰富性的SSRS [44.，45.]．均聚物是叶绿体基因组中最常见的SSRs。由于叶绿体基因组的结构和组织是保守的，SSR引物可以跨种、属甚至科转移。本研究涉及到的SSRs信息将为估计种属间的遗传多样性和研究种属间的系统发育关系提供有用的资源。

潜在的CPDNA条形码

Diospyros.是其科中最大的属，在世界各地有400多种。为了有效的勘探、保护和驯化，准确鉴定野生种将为该属提供一个清晰的遗传背景。然而，分类目录Diospyros.仍有很长的路要走，因为物种数量庞大，具有广泛的全球分布和可塑性的形态特征。DNA条形码已广泛用作一种新的生物工具，以促进准确的物种鉴定[46.]．两种叶绿体DNA区域，:和mat，推荐作为植物中的核心通用DNA条形码。因此，更完整的叶绿体基因组序列的基因组对比研究已经成为显影变量DNA条形码是必需的。这些突变“热点”区域可以为物种鉴定提供足够的遗传信息，并且可用于开发新型DNA条形码[19]．八个潜在的突变热点（trnh-psba.，rps16-trnQ，rpoB-trnC，RPS4-TRNT-TRNL，ndhF，ndhF-rpl32-trnL，ycf1一个,ycf1b）本研究中鉴定的B）可能是植物分类的合适条形码Diospyros。在以前的研究中,ycf1基因在叶绿体基因组中表现出高度分化，推荐作为植物核心DNA条形码[22］．Ycf1基因在植物系统发育和DNA条形码研究中的应用越来越广泛[47.，48.，49.，50.，51.］．TrnH-psbA, ndhF和rps16-trnQ是系统发育研究的热门候选人[52.，53.］．RPS4-TRNT-TRNL和ndhF-rpl32-trnL是本研究新发现的。

最近，讨论了使用叶绿体基因组作为植物物种的超级条形码鉴定[49.]．对叶绿体基因组序列差异和系统发育的分析表明，叶绿体基因组确实可以作为物种鉴定的超级条形码Diospyros.(表3.和图。4）．进一步的研究是研究这些超可变区是否或完全叶绿体基因组序列可以用作可靠且有效的DNA条形码，用于种类Diospyros.．本研究结果对今后的全球遗传多样性评价、系统发育和群体遗传学研究具有重要意义Diospyros.．

未来柿子研究展望

开发高效的鉴定方法，阐明其亲缘关系是重要的和基础的Diospyros.策划育种策略，密集管理和保护的分类群Diospyros.种质资源。的起源D. Kaki.及其与其他人的关系Diospyros.物种也是吸引科学家的热门问题。ng [54.)建议d .鉴定是一个父母D. Kaki.基于形态学，地理学和细胞学证据。Yonemori等人[55.)建议D.弗吉尼亚州和D. Kaki.具有密切的关系，如叶绿体DNA的限制性片段长度多态性透露。但是，Choi等人。［9]考虑到之间的关系D.弗吉尼亚州和D. Kaki.可能比其他人更远程。

本研究获得的DNA证据清楚地支持了之前的分类学建议D. Deyangensis.和D. Jinzaoshi.应根据形态、分子特征及染色体数目提升至物种级[4，9，10，11，12]．在基于cpdna的树中D. Kaki.世系和世系包括雌雄异株D. Deyangensis.和雌雄同株的d .鉴定共同分享了共同的海盗。有趣的是，染色体数量D. Kaki.(2n = 6× = 90)等于染色体数目之和D. Deyangensis.（2n = 4×= 60）和d .鉴定(2n = 2× = 30)．这种强烈暗示培养D. Kaki.可能是由遗传物质之间的叠加事件产生的D. Deyangensis.和d .鉴定通过在进化史上的某些遗传机制Diospyros.植物。d .鉴定自然分布于中国长江以南，对潮湿条件有较强的适应性和抗逆性，曾作为D. Kaki.在中国南方。它的水果也可用于提取柿子涂料。D. Deyangensis.，产于中国四川，开红花，叶、枝、果和部分花的表面有细毛[7]．

Diospyros rhombifolia.和D. Cathayensis.在基因上与D. Kaki.，与基于表型特征的分类一致．d . rhombifolia由于矮化效应，不能用作砧木或砧木间[2]．d . glaucifolia和D.莲花基于CPDNA序列聚集在一起。它们在表型特征中非常相似[2，5，6，55.]．D.莲花因其在柿子属中抗寒性最高，在我国北方柿产区作为砧木做出了巨大贡献。小的果实D.莲花作为食物和中药有着悠久的历史。在中国南方，雌雄异株种d . glaucifolia可以用来生产木材，也可以用作砧木．物种之间的边界D.莲花和d . glaucifolia应进一步研究，将来会取样更多个别植物[2，5，6，56.]．

上述问题的阐明肯定会改善我们对系统发育，关系和栽培柿子的起源的理解Diospyros.，并进一步加快定向培育Diospyros.植物。

叶绿体DNA序列可用于植物的分类Diospyros.种间水平的植物。本研究的结果表明d .鉴定，D. Deyangensis.，D.弗吉尼亚州，d . glaucifolia，D.莲花和D．jinzaoshi是与栽培柿子密切相关的重要野生物种D. Kaki.对这些类群的深入研究将有助于了解其起源D. Kaki。我们的结果对全球遗传多样性评估，系统发生和群体遗传有重大价值Diospyros.在未来。

双：

贝叶斯推理

cpdna：

叶绿体DNA

达克斯：

DNA序列多态性

信条:

双细胞细胞基因组注释器

GTR:

一般时间可逆

indel：

插入/删除

红外光谱:

倒置重复

它的：

核糖体DNA的内部转录间隔

LSC:

大单副本

密度:

马尔可夫链蒙特卡罗

ml：

最大似然

MP：

最大限定

NJ:

Neighbor-Joining

PCA类型：

授粉常数和收敛型

PCNA类型:

授粉常数和非收敛型

Pi:

核苷酸多样性

rrna：

核糖体核糖核酸

SSC：

小单副本

SSR：

简单序列重复

TRNA：

转移核糖核酸

作者感谢徐超在分子实验和数据分析方面的帮助，以及王建平和王renzi在实地调查方面的指导。

资金

本研究由山东省农业优良品种项目“林木种质资源收集、保护与评价”项目(LKZ201496-1-3)资助，资助项目(2017YFD0600604);LCNZ2016-36，国家森林遗传资源平台(2005DKA21003)，国家柿子种质资源服务共享基础设施(NICGR2017-50)。

可用性数据和材料

完整的叶绿体基因组D. Cathayensis.，D. Deyangensis.，d . rhombifolia和D.弗吉尼亚州使用Genbank登录号MF288576提交给NCBI数据库（D. Cathayensis.），MF288575（D. Deyangensis.), MF288578 (d . rhombifolia)及MF288577 (D.弗吉尼亚州）.

作者笔记

1. 文庆李，延磊刘和勇阳同等为这项工作贡献。

从属关系

1. 山东省林树种质资源中心，济南，济南

   李文庆，谢小曼，卢益增

2. 中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京

   Yanlei Liu，Zhirong Yang，Wenpan Dong＆Zhili Suo

3. 中国科学院大学，北京

   y磊刘

4. 西北A＆F大学园艺学院，杨凌

   永阳

5. 中国科学院北京植物园，植物研究所，北京

   Xiaobai金

6. 北京大学先进跨学科研究学院北京 - 清华生命科学院，北京

   Wenpan董

贡献

ZS、WD和WL设计了本研究;WD和YL设计实验，测序叶绿体基因组;YY、XX、YL、XJ、ZY、ZS进行了实地调研;WD、YL、XJ、ZY对数据进行分析;ZS, WD, WL, XJ撰写手稿;所有作者都已阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到Wenpan董或织里缩．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

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提交人声明他们没有竞争利益。

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