RAD-seq揭示了F₂-天然柳杂交种(柳树L.)和种间渗入的巨大潜力

背景

具有多孔基因组的物种杂交最终可以通过重复的回复导致迟发。物种之间迟发的可能性反映在后一代杂种中的分离畸变程度。在这里，我们研究了一群杂种Salix purpurea.和美国helvetica由于家长物种的二次接触，在欧洲阿尔卑斯山的冰川前往冰川堡的过去30年内出现了。我们使用了通过RAY测序产生的5758个双曲线SNP，其目的是确定返回的主要职位（F.₁杂种x亲本)或F₂杂交种（F.₁Hybrid X F.₁混合）杂交的后代中。此外，SNP被用来研究偏析失真在第二混合产生。

结果

分析结构和新杂于透露，人口由父母和f组成₁混合动力，而混合后代主要由父母种类的回复组成，而且还包括一些f₂混合动力车。虽然之间存在明显的遗传分化S.菊和美国helvetica(F_英石= 0.24)，在回交和F₂混合动力车。的回交的植物高度相似的相应亲本物种，而˚F₂杂交种更类似于高山美国helvetica．

结论

亲本品种的同现和在冰川forefield杂交，回交的高频，并通过回交至基因流动的低阻力使渐渗的场景在这个年轻混合群体的可能性高，有可能导致的转印适应性状。我们进一步认为，这柳树杂交群体可以作为近期全球变暖引发的进化过程的模型。

在许多植物和动物物种中已经观察到由于二次接触引起的自然杂交。特别是在北美和北部和中欧，二次接触的主要动力是冰川撤退后正在进行的重新调整[1］．通过人诱导的全球变暖扩增该方法，也导致物种的快速转移[2那3.那4.那5.]，特别是在山区，导致先前异域物种的二次接触[6.］．没有强的合子前或合子后生殖障碍可能导致杂交。

许多研究对杂交的进化相关性进行了研究。虽然有一些记录在案的同倍体杂交物种形成的案例[7.那8.那9.]，与大量报告的杂交事件相比，物种似乎是一个相当罕见的结果[10.］．对于homoploid混合形态重要的要求似乎是，限制混合动力车和亲本物种[之间基因流动强的生态或地理障碍7.那11.那12.那13.］．因此，杂交品种密切相关联于新颖或极端栖息地的可用性[14.那15.］．染色体重排也可以迅速在父母和杂种之间建立交叉障碍[9.］．一般来说，种间杂交似乎更有可能导致基因渗入而不是物种形成[7.那14.］．在极端情况下，基因渗入可能导致基因淹没，威胁物种的完整性，并造成严重问题，特别是在小种群或稀有物种[16.］．在另一方面，自适应渗入可导致有利等位基因的转移[10.那13.那17.那18.那19.］．有利性状渐渗可以增加物种的遗传和表型多样性，因此潜在适应新颖环境[9.那20.］．一个初期杂交事件的结果是不容易预测，因为这取决于很多因素，如混合动力车的健康和他们的后代[21.]，某些基因型的内源性和外源性的选择，相互作用的与环境的影响[22.]，和栖息地可用性[23.］．

为了评估杂交事件的进化影响，知道基因组易受异质特异性等位基因迟钝的程度至关重要。隔离扭曲，偏离预期的孟德尔分离比率，可以用作杂交物种基因组对血液引入的抗性的量度24.那25.］．此外，可以假设扭曲的基因座与影响杂交种或其配子的活力或适合性的基因相连[25.那26.］．因此，分离扭曲也与生殖障碍和抑制种间基因流动有关[27.那28.那29.］．在性染色体或性别决定区域的低重组率也会导致分离失真[30.那31.］．在雌雄异株植物，女性偏置性别比例被连接到隔离失真失真基因座[32.］．因此，即使在非典范物种中也已经应用了对偏析失真的基因座或区域，作为在物种之间的生殖屏障潜在的潜在原因的结论的基础[33.那34.那35.那36.那37.]，或确定负责环境适应的地点[29.那38.］．

在这项研究中，我们研究了两个柳树物种之间的二次接触区域中的杂交，Salix purpurea.L.和美国helveticaVill。，位于瑞士中部Rhône冰川的前沿。Salix Helvetica.是一种灌木，其在亚高尔坡到高山区。Salix purpurea.，另一方面，是一种广泛分布的低地物种，由于全球变暖和随后的冰川退缩，它们最近能够在更高的海拔地区定居[39.］．这些物种的二次接触和杂交发生在最近变得无冰的冰川前野。这些冰川前地覆盖着稀疏的植被，为柳树等先锋物种的定居提供了充足的空间和不同的生态位[39.那40那41.］．杂交甚至是跨节杂交和远亲种间杂交是一种常见的现象柳树[42.那43.］．虽然S.菊和美国helvetica属于属的不同部分[44.，它们在欧洲阿尔卑斯山形成了天然的杂交地带[39.］．这种混合区的组成将用于这些杂交事件的进化结果的评估提供了重要的线索。回交的优势会更容易使父母物种之间的基因渗入，而F的统治₂混合动力车(例如F₁Hybrid X F.₁杂种)可能是杂种群体形成和进一步杂种进化的潜在指示。在Rhône冰川上对柳树种群的早期研究中，曾试图确定杂交的确切类别(F₁，F.₂基于微卫星标记的基因分型，冰川前沿的倒退）[39.］．这些标记清楚地区分了两个亲本物种，并确认了表型中间个体的杂交起源，但它们的分辨率不足以将所有个体明确地分配到某个杂交类群[39.］．因此，混合区的精确组成仍不明朗。然而，我们发现之间的杂种S.菊和美国helvetica是可育的，并在自然种群中产生可行的种子，从而证实杂交可以继续进行F₁混合生成[45.］．从这些天然所形成的种子中提出的后代提供了不仅研究第二代杂种的后代类，而且提供了占地的分离畸变和表型性状。

为了克服标记数量少造成的限制，我们使用限制位点相关DNA测序(RAD-seq)在这个非模式物种中生成了一组全基因组的数千个单核苷酸多态性。利用高质量的双等位基因SNPs (i)测定冰川前野杂交和F₁为了混合动力车预测这种杂交事件的后果。另外，（II）我们在寻找在F各个基因座从预期偏析图案的偏差₂杂交和回交，以确定是否一个亲本品种的等位基因优于其它。人口基因组分析伴随着形态测量在相应的第二代杂种类（III）得到的见解到选择的，潜在的自适应表型性状（植物高度）的变化。

radseq和SNP呼叫

RAD的-SEQS.菊那美国helvetica它们的杂种平均产生7.5×10^6.SD 2.4 × 10^6.）.每个碱基序列质量的平均值非常高，并且在所有样品中读取的所有位置都有40的捕获得分。读取覆盖的平均深度为59倍（SD 18）。当栈-pipeline最初生成了49,081个位点。在所有过滤器应用后，5758个核位点保留下来。将基因座定位到质体基因组后，未观察到匹配。然而，在被过滤的位点中，933 reads与基因组的编码区域一致p . trichocarpa．剔除编码区域的SNPs后，群体遗传分析和子代分析结果没有变化，因此我们对所有5758个SNPs进行了全部分析。

种群遗传结构

当结构分析证实，最可能的人口数目(K.）在样本中是两个（附加文件1:图S1)。因此可以假定所有的杂交种都是杂交的S.菊和美国helvetica与参与（图没有第三物种。1a）。F._英石之间的值S.菊和美国helvetica对于过滤的基因座为0.53，但只考虑所有49,081个未过滤的基因座，只有0.24，表明F的强烈依赖_英石在座位选择值。该NewHybrids分析证实了父母类和透露，罗纳冰川冰川forefield采样所有杂交个体都˚F₁混合动力车。虽然数据集必须限制在300位点，因为NewHybrids不能处理位点的数量较多，用于分配给不同类别的结果有100％所有个人后验概率的支持。因此，S.菊和美国helvetica沿后交通动脉（图1中的第一轴线被清楚地分离。2)，在Rhône Glacier聚类中采样的杂交个体正好位于第二轴的中间位置。

F的后代₁杂种包括回交S.菊，回廊到美国helvetica，和F₂杂种(F₁混合动力汽车)。F₂仅在五种母种中的一个的后代观察到杂种（图。1b）。所有其他植物产生的双向回交。总体而言，显著更多回交S.菊（N = 40) than to美国helvetica（N= 16)(二项检验，双侧，P.= 0.001,N = 57). The different hybrid classes also formed well-separated clusters in the PCoA analysis (Fig.2）.在相应的父母半中聚集在相应的父母半部分，而不与纯种个体重叠。F.₂杂交种形成了自己的一簇，沿着第二条轴与其他个体明显分开。F.₁个人与f群集₂杂交种是f的母亲₂混合动力车。

在第二代杂合体分离失真

所有位点对f的滤波_英石 = 1 betweenS.菊和美国helvetica检索396物种特异性的SNP，其中包括在编码基因组区域的SNP。其中，334位点能够被排列到S.菊基因组。染色体排列结果显示，它们在所有19条染色体上都有分布柳树基因组（表1）.

在回交和F₂混合动力车。虽然纯合子和杂合子基因型的分布在某些位点上呈偏态分布₂混合动力车(附加文件2:表S3)，个体的数量似乎太低，无法支持显著的偏差。

在第二代杂种植物高度

单向方差分析显示三组之间株高（F显著差异_2,67 = 15.064, MS = 219.71,P.< 0.001,无花果。3.）.回交S.菊范围从15到70厘米（m = 41.8cm，sd = 14.2），并且明显高于遥控美国helvetica(12.5-38厘米，M = 24厘米，SD = 6.3)或F₂杂交种（16-46.5cm，m = 29.4cm，sd = 10.2）。

自然杂种群体组成

我们的研究证实了天然二次接触杂化带的存在美国helvetica和S.菊在罗纳冰川前方。RAD-SEQ数据使Hybrid类的解决方案能够优于我们之前研究中应用的微卫星标记[39.］．而基于微卫星基因分型的结果表明，三分之二的杂种可能是后代杂种(F₂杂交种或横跨杂交种与RAD-SEQ数据的分析显示，最大统计支持显示，所有在RhôneLacier的前沿上采样的混合人都是F.₁混合动力车。杂交分类上的这种差异可能是由于之前的研究中使用的微卫星位点数量较少，只能局限于两个物种中扩增的引物。此外，由于在微卫星位点上缺乏物种特异性等位基因，因此很难确定哪个物种在混合基因型中遗传了等位基因。在杂交种的分类中也观察到类似的差异杨树混合区。而没有杂种被归类为F₁基于微卫星基因分型的杂种[46.[后续基因分序列显示，大多数杂交种属于F.₁一代(47.］．作者用微卫星的缺点解释了不同的结果，例如等位基因辍学[47.］．我们认为，基于RAD-SEQ数据的结果是由于大量的位点产生一个更高的分辨率比DNA指纹至今使用的技术更可靠[48.］．此外，所有的杂交被分配到与所述RAD-SEQ分析100％后验概率的相应混合类，而SSR分析许多个体获得小于95％的后验概率。共有RAD-SEQ显然是在种间杂交比微卫星研究执行得更好。

我们希望在冰川前方寻找一些后代的混合杂种，因为从自然授粉F中收集的种子种植的后代分析₁Rhône冰川前场的混血儿[45.]建议回廊和f₂可以在这个人群进行定期形成的后代。然而，结果显示仅F₁一代杂交种。我们假设第二代杂交种的缺乏是由于抽样策略。由于幼年植株和幼苗的叶片、花和果实尚未表现出成年杨柳的典型表型特征，因此我们只选取了成年个体的材料。在之前的一项研究中，我们已经得出结论，在这片最近出现的冰川前野上的杂交种群可能不超过20-30年[39.］．因此，我们认为，在冰川上forefield第二代杂交我们的采样过程中没有在成年一代目前不存在或很少见的。为了澄清是否回交和F₂与此同时，杂交种已经在自然种群中成长起来，一种扩展的抽样策略，包括幼植物和广泛的表现型代表将不得不被应用。

我们没有理由假设回复父母以及f₂杂交种不能在冰川前野建立。在杂种育性研究中，我们发现杂种的种子产量比亲本低，但种子萌发能力强，幼苗发育良好[45.］．因此，似乎不太可能没有回溯或f₂在冰川杂交forefield，尽管他们的人数恐怕还仍然比较低到F₁混合动力车。另外，栖息地介导的选择可以作用在父母的网站建立后一代杂交种，因为它已被观察到杜鹃混合区[49.］．第一个F₁形成混合动力，冰川forefield仍然在继承与较少植被覆盖的早期状态，这样的条件是建立柳树，这是先锋树种更有利。后来的时间，当回交和F₂杂交品种被生产出来了，植被可能变得更密集了，所以建立的条件可能变得更困难。然而，也应该记住的是，冰川正在退缩，开放的拓荒地将会持续存在。虽然我们在目前的采样中没有发现后代杂交种群，但仍然可以得出结论，冰川前场的杂交种群能够发展到F₁一代使得杂交可能具有进一步的后果，如下一节所述。

杂交后代的类别

与在冰川前场的自然种群的研究结果相反，在野外形成的种子的后代包括F₂杂交种（F.₁与f₁）和父母种类的横康。有趣的是，F.₂杂交种仅在五种母植物中的一个的后代发现。在冰川前沿，这款雌性植物距离雄性F不到3米₁混合(S. Gramlich，未发表的观察)。因此，F₂混合动力车仅在较高的数量，当男性和女性f时产生₁混合动力车站立在一起。在冰川前方，这种安排非常罕见，以便女性f₁混合动力更接近的雄性个体S.菊或美国helvetica在大多数情况下(S. Gramlich，未发表的观察)。亲本物种和杂种物种均匀地分布在整个区域，因此不存在从一个亲本物种到另一个亲本物种的集群分布或渐变的空间结构[39.］．因此，女性F更有可能₁杂交种由一个纯种授粉，这样它们就会产生回交。因此，我们的结果表明，抽样F的后代₁杂交种以回交为主，少数为亲本₂混合动力车。在杨树中也有类似的发现，当纯种雌性植株被F₁混合动力汽车(50.］．总的来说，有更多的回交S.菊比美国helvetica在样本中，此结果的原因尚不清楚。可能的原因可能是在开花时间之间的更大重叠S.菊而杂交种，合子后选择对抗回交美国helvetica，随机因素如靠近男性的近距离S.菊和女性F₁混合动力车比之间美国helvetica男性和F₁杂交种，或采样偏见，因为在分析中，在分析中选择母植物，在抽样年份的后代数量或授粉条件下。另一种可能的解释可能是花粉的限制对花粉更强烈美国helvetica比花粉S.菊．因此，纯种的结实率降低美国helvetica与纯种相比S.菊[45.］．柳树上的种子花粉有限51.，因此花粉美国helvetica也可以减少有效地运输。Pollen-pistil Incongruences还代表了柳树中强烈的倒闭横向障碍[52.］．花粉管生长可以在差别之间作用S.菊和美国helvetica作为前种具有更短的风格和无喙的胶囊，而后者已久的风格和喙胶囊。然而，观察到的图案的确切原因的确定需要进一步的研究。不论它回交的方向可以推断出，至少在二次接触，有较高的生产回交的除F的这个早期阶段₂混合动力车使未来的血栓突出术比混合物种更可能。

第二代杂种没有表现出分离扭曲的迹象

这是利用RAD-seq数据分析非模式植物偏析失真的首次研究之一。该标记系统在检测分离畸变和连锁群方面的能力已被证明，例如在杂交鱼上[29.]和在白色柏松[38.］．仅存在每个基因座的两个等位基因的事实使得难以在杂交个体中确定等位基因的起源物种，特别是当等位基因在家长物种中均匀分布时。因此，我们将我们的分析限制为特定于特定的基因座。我们认为，这种限位是代表基因组杂交模式，因为标记位于所有19个染色体上柳树基因组。

我们没有从F-预期的孟德尔分离比检测显著偏差₂杂交或回交。预计畸变位点的大小与亲本物种之间的分化程度相关[53.］．之间的分歧S.菊和美国helvetica原来与f很低_英石基于微卫星制造商的研究中的0.3值[39.］．基于RAD-seq的轨迹发散也与F相当低_英石对于完全未过滤的位点，值为0.24，但对于过滤过的位点，值为适中(F_英石 = 0.53). This increase of F_英石被认为是由于去除位点不区分家长的物种。因此，我们认为，低F_英石基于未经过滤的基因座的价值为人口分歧提供了更现实的估计。另一个提示在差异之间的低分歧S.菊和美国helvetica它们是否很容易杂交，尽管它们属于不同的，不相关的部分或支系的属柳树[44.那54.］．系统发育研究表明，该属的种间和组间的遗传差异一般较低柳树，特别是在灌木种中[55.那56.那57.］．近日，包括灌木柳树整个亚属的系统发育可以使用RAD测序而比较保守的标记未能解决[54.］．因此，亲本物种之间的低遗传差异似乎是杂种中没有分离扭曲的一个可能的解释。

遗传不亲和性导致杂种不育或不能生存，从而作为合子后生殖障碍，随着亲本物种的进化差异而积累[58.那59.］．我们观察到那个F₁杂交种产生的种子少于S.菊或美国helvetica但是它们产生的种子是可以存活的，并且和纯种的种子生长得一样好[45.］．由于亲本的遗传差异较浅，在减数分裂、授粉、受精或种子发育过程中，在种子成熟之前似乎存在一定程度的合子后选择(即内在选择)，但分离畸变的缺失表明异质性等位基因并没有被选择性地清除。因为大部分基因组似乎不受分离扭曲的影响，可以假设基因组易受渗透，因为它也得出回交在鸢尾花[25.］．

另一个有趣的发现是，只有两个物种特异性位点位于承载在性别决定基因座染色体XV柳树[60.］．其他研究发现，由于抑制重组和物种特异性差异的积累，性染色体高度分化[30.］．然而，在柳树，以及在杨树在美国，尚未发现异型性染色体。Stölting等[61.也没有发现固定的SNPs杨树第19号染色体上携带性别决定位点的物种杨树[62.那63.那64.］．他们的结论是，与预测相反，早期的性染色体杨树不是基因流动和基因渗入有抗性。因此，马卡亚-Sanz等。[65.]也检测到19号染色体上的基因流动杨树．这一发现似乎反映在柳树由于低数量的染色体XV物种特异性的SNP在该研究中检测到。

与基因组数据相比，偏析在一岁的青少年植物中表型性状中显而易见。Salix Helvetica.是达到约的高度的灌木50.–80 cm [43.］．Salix purpurea.在低地可达6米[66.]但是在冰川面前，灌木是加利福尼亚州。160-180厘米高（S. Gramlich，未发表的观察）。关于植物高度，回廊似乎保持了经常性父母的特征，如预期，而F₂杂交通过的较低高度S. helvetica，即使在没有外部选择的庭院条件下也是如此。这是醒目的，因为高山灌木的典型特征是植物高度（通常<50cm）的减少，因为在冻结期间，植物更好地保护雪覆盖[54.那67.］．因此，生长高度似乎是在该混合系统中研究自适应性状的有希望的候选者。

由气候变化引起的范围转移将增加某些物种二次接触杂交的可能性[68.］．比较由气候变化引起的各种杂交事件的结果对于评估这些事件对生物多样性的影响是很重要的，以便在必要时启动保护措施[69.］．杂交事件对杂交柳树种类的遗传多样性有何影响？我们发现迟发很可能是因为抗杂交和基因流动的内在障碍S.菊和美国helvetica很低。此外，杂交和纯种出现在冰川前野的混交林中，导致F₁杂交和回交。基因渗入可能是不对称的，因为有更多的回交S.菊在采样。由于孤立的位置，渗入可能是高度本地化的主要影响的基因库S.菊和美国helvetica冰川前场和周围斜坡上的个体。另一方面，我们已经发现了另一个杂交种群S.菊和美国helveticaMorteratsch冰川海拔较高的地方[39.[因此，由于冰川的持续撤退，可以假设它可以假设进一步的混合人群将出现在欧洲阿尔卑斯山的其他位置。许多本地化的独立杂交事件将更有可能使狭窄的等位基因分布更有可能。

一般来说，杂交似乎增加了后代群体的遗传和表型变异性。通过基因渗入的种间基因交换被认为是一种重要的进化力量，因为它可能导致适应性的转移[70］．适应被认为是物种形成过程中促进分化的最重要的过程[13.那71.］．这样，适应性性状的渐渗可能导致生态型甚至新物种的形成[70］．然而，灌木的长长的成交量和建立群体所需的时间使得难以预测特征的自适应价值。这些混合人群的长期监测对于得出最终结论至关重要。

柳杂交种也可以作为全球变暖引发的进化过程的模型。由于其作为先锋种的特性，在新生境中柳树的迁移和建立可能比其他物种更快。因此，在这个模型系统中所做的观察可能有助于预测进化过程，这些进化过程可能在很晚的时间内影响扩散速度较低的物种。

抽样

叶样品在罗纳冰川瑞士中部的forefield从混合收集支架（46°34'03.0“N，08°22'12.3”E）S.菊，S.黑体，以及他们的混血儿。所有的植物样品都是在瓦莱州，forêts和付款服务的许可下采集的。在之前的一项研究中，所有的个体都已经在9个微卫星位点上进行了基因分型，该研究还包括冰川前野以外的一些参考种群[39.］．在本研究中，我们从6个个体的叶片中取样Salix purpurea.和九个人美国helvetica从冰川前野。为了扩展纯种的数据，我们还纳入了4个个体S.菊从德国另外三个地点(51°18 ' 53.0″N, 11°54 ' 19.8″E, 51°44 ' 32.2″N, 10°43 ' 31.8″E;49°21′13.0″N, 8°14′15.0″E美国helvetica来自奥地利的个人（46°49'21.6“N，10°59'25.0”E）。

我们包括从冰川forefield 45个混合动力车的综合采样。这些植物由已在先前的研究中已经进行亲物种和遗传分析两者之间的中间表型分类为杂种[39.］．所有标本的鉴定由S. Gramlich完成。每个纯种和杂交样品的标本室凭单保存在Göttingen大学(GOET)的标本室。

在这45个杂交种中，我们选择了5个> 95%概率为F的杂交种₁在我们之前研究的新杂交种分析中[39.］．为了研究第二种杂交生成，从这五种自然授粉的F中收集的种子₁Rhône冰川前场的杂交植物是在受控条件下发芽的(详情见[45.])。幼苗在同等条件下在气候生长室中生长1年(见下文)。在数百个幼植株中，每株母株选出20-30个子代，代表了后代之间的表型多样性。五个F中的每一个₁母株13-14后代（总N = 68) were finally sampled for RAD-seq analysis. The five mother plants from the natural population at the Rhône Glacier were also included in the sampling. The final dataset for RAD-seq analysis comprised 133 individuals.

DNA提取,RAD-seq

根据制造商的协议，使用DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)从硅胶干燥的叶子中提取DNA。DNA浓度用Qubit 3.0荧光仪(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)评估，样品归一化至30 ng/μl。然后将3 μg DNA的Aliquots提交给Floragenex公司(Eugene, OR, USA)进行文库制备和单端RAD测序(按照[72.])。用限制性内切酶对全基因组DNA进行酶切PST.I.使用Pippin Prep (Sage Science, Beverly, MA, USA)选择300 bp - 500 bp的大小，然后连接测序适配器和每个样本独特的10 bp条形码。样品在Illumina HiSeq 2500仪器(Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)上进行测序，原始读取以FASTQ格式发送，修改为100 bp。

原始数据和SNP调用的生物信息学分析

该软件栈v。1.44 [73.那74.使用用于解复用，SNP发现，和基因分型。首先，我们分离出的原始读取和删除低质量读取使用process_radtags.计划实施栈使用默认参数。在这个步骤中，10 bp的条形码被从读取中删除，这样读取的最终长度被缩短到90 bp。之后，采用FastQC v. 0.11.4对每个样品的质量进行评估[75.］．基因座使用了de novo使用denovo_map.管道将RAD标签合并到每个样本中的位置（Ustacks.)，创建一个目录，其中包含来自多个示例(Cstacks.），最后将每个样本与目录（SSTACKS.）.管道内的第一个步骤是所谓的堆叠（匹配读取）出原始的创建每个单独的读取。书库建设轨迹[提供依据73.］．创建堆栈所需的匹配原始读取的最小匹配数（最小覆盖深度）（m）设定为10。因此，主叫杂合子的需要至少10读取每个等位基因的。允许两个堆叠之间核苷酸错配的最大数目设置为5对个人内的处理位点（m）与个人之间（N）在构建目录时。适当的值m和N是在初步的测试运行中确定的。在这些运行时,m和N在2 ~ 7之间设置相同的值，并记录总位点数和多态位点数。遵循Viricel等人的建议[76.]我们选择了一组参数，其中基因座的总数以及多态位置的数量达到了渐近。最后我们使用了人口项目栈到提取物基因座存在于所有三组（S.菊那美国helvetica，杂种）在个体的至少70％的各组（R.）.数据分析仅限于每个位点的第一个SNP，以获得群体遗传分析所需的非连锁SNP。P链接v 1.0.7 [77.] was used to filter out SNPs with a minor allele frequency < 0.05, and SNPs that were out of the Hardy–Weinberg equilibrium atP. < 0.05 in one or both parental populations. Further, individuals with a genotyping rate < 90% were also excluded from the analysis leading to the exclusion of two individuals of the hybrid offspring. We also applied further filters to remove potentially paralogous loci resulting from the recent ‘salicoid’ duplication event [78.］．在这样的位点上塌陷的副同源副本的特征应该是过量的杂合度和增加的覆盖深度[79.］．因此，我们除去与观察到的基因座的杂合（H_O.≥0.6,f_是 < 0, or a coverage depth that was greater than twice the standard deviation. Further, we also removed loci with a F_英石- 距离0之间S.菊和美国helvetica以限制对亲本间变异位点的分析。H_O.，F._是和F_英石- 每个轨迹的值是由此产生的人口程序。过滤后的基因座与杨树trichocarpa基因组[78.来检测编码的snp，假定高度保守的区域，和质体Salix sudovensis.[80]（Genbank：KM983390.1）除去母产遗传性塑料标志物。然而，由于观察到与体积基因组不匹配，因此所有基因座似乎属于核基因组。在胰酸r 10.0.9中进行对准[81.］．过滤后，5758个基因座仍为群体基因组分析。

杂交带及其后代的遗传结构

利用mouse和Peakall的遗传距离测量方法计算个体间的成对遗传距离[82.在R包中实现PopGenReport[83.］．基于这些遗传距离我们进行在R包实现的后交通动脉ADE4.[84.］．我们使用该计划结构v。2.3.4 [85.来证实所有的杂交种都是由杂交产生的S.菊和美国helvetica没有第三种物种的参与。所有5758个基因座均被纳入结构分析。我们测试了K.- 值范围从1至7，而不混合模型假定独立等位基因频率下现有人口信息。五轮次每进行测试K.-值和最有可能K.-值采用Evanno等人的方法测定[86.］．最后，我们确定了亲本和杂种的种类(F₁，F.₂也就是回交)，用程序newwhybrids [87.］．我们仅指定混合X混合级为f₂杂交种，而整个后代被称为第二代杂种。由于前沿的杂交区的年龄（大约20 - 30年），可以假设所有人仍然属于早期混合世代，以便可以分配给精确的混合类别。NewHybrid无法处理大型数据集，因此我们将数据集限制为整个数据集的前300个位置。我们还在随机选择300个基因座中运行Newhybrid，以确保在基因组的不同子集中一致。结果是相同的，但我们选择使用前300个基因座来确保结果的再现性。S.tructure和NewHybrids的运行使用了10,000次的老化周期，然后是50,000次MCMC迭代。使用减少的数据集测试较长的运行时间，但并没有实质性地改变结果。

在第二代杂合体偏析失真的分析

我们选择具有固定差异的位点S.菊和美国helvetica为了分析偏析畸变，使混合动力人物中的等位基因的来源可以明确地确定。我们检查了所有45°F₁杂种在这些位点上是杂合的。总的来说，396个位点同时满足这两个标准。R包迟滞[88.]用于计数来自各亲本群体对于每个基因座上的每个混合个体衍生的等位基因的数目。这些计数作为基础来检测与预期分离模式的偏差。在歼₂杂交，我们检测了在每个位点上发现的纯合子和杂合子基因型偏离预期1:2:1分布。在回交中，我们检测了纯合子和杂合子基因型的偏离预期的1:1分布。χ²拟合优度检验在R [89.］．在对f的分析₂混合动力汽车，P.- 由于较数较多的人数，由Monte Carlo仿真计算了值。我们使用[的假发现率（FDR）方法校正了多次测试90.α = 0.10。

我们表演了一个b最后搜索所有含有物种特异性snp的rad位点S.菊使用基因组12 Phytozome [91.]确定基因座所在的染色体。当读数显示在90bp的整个读数长度上显示> 98％的同一性时，接受了对准。

评估植物高度

幼苗从五个自然授粉˚F成长₁Rhône冰川前场的混血儿[45.] were raised in climate chambers for about 1 year at 18 °C with a 16-h light period (c. 250 μmol m^− 2年代^− 1)，在相同的土壤和水分条件下。在这个年龄，植物有典型的成虫的叶子(一些例子见附加文件1：图S2），但还没有开花。Before these juvenile plants were transferred to pots for outdoor cultivation, the length of the longest shoot was measured to the nearest 0.5 cm. A one-way ANOVA was performed to test for differences between groups (according to the NewHybrids analysis: F₂回交,S.菊回交,美国helvetica)，其次是奥运会-豪厄尔测试。I型错误率α = 0.05。方差分析使用SPSS 24 (IBM公司，Armonk, NY)进行。

我们感谢Jennifer Krüger提取了DNA，感谢Silvia Friedrichs哺育了幼苗。裁判员的意见对改进稿件有很大价值。

资金

该研究由德国研究基金（DFG Project Ho 5462 7-1）提供资金至e.h。DFG不包括在研究设计中或该项目的任何其他操作部分。

数据和材料的可用性

所有解复用后的读数据提交到NCBI Sequence read Archive:登录号SRP133640, BioProject ID PRJNA429746。为进行群体遗传分析而生成的数据集(结构输入文件）是树妖数字仓储可用，https://doi.org/10.5061/dryad.4k3v0kg.．

从属关系

1. 植物，大学Goettingen，UntereKarspüle2,37073，Goettingen，Goettingen，Goettingen，Goettingen，德国的植物生物多样性和演变部

   Susanne Gramlich, natasha Dorothea Wagner & Elvira Hörandl

贡献

EH和SG设计研究，SG和NDW分析数据，SG写文章用NDW和EH的援助。所有作者阅读并同意最终的文本。

相应的作者

对应于Susanne格拉姆利克．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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重印和权限