基因组鉴定，分子演化和疾病响应因子（ARF）基因家族的表达分析Broachypodium distachyon.L.

背景

生长素反应因子(东盟地区论坛）基因家族参与植物开发和激素调节。虽然东盟地区论坛基因家族进行了研究某些植物物种，其结构特点，分子进化，并且在表达谱Broachypodium distachyon.L.．仍然不清楚。

结果

全基因组分析发现19东盟地区论坛基因B. Distachyon.．系统发育树为182东盟地区论坛七种植物的基因揭示了三种不同的进化枝东盟地区论坛虽然在不同的植物中出现了某些分歧，但仍然存在结构保护。分支部门模型鉴定了可能发生阳性选择的一些位点，并且功能性分析发现比I型更常见的发散位点。特别地，241h，243g，244 l，310中可能发生阳性选择和功能性发散。 T, 340G and 355 T. Subcellular localization prediction and experimental verification indicated that BdARF proteins were present in the nucleus. Transcript expression analysis revealed thatBDARFS.主要在叶子和根尖，茎和发展种子中表达。一些BdARF基因在各种非生物胁迫下表现出显著的上调表达，BdARF4和BdARF8响应非生物应激因子如水杨酸和重金属而显着上调。

结论

这东盟地区论坛基因家庭B. Distachyon.高度保守。几个重要的氨基酸位点确定了积极的选择和功能分化发生，他们可能在功能分化中起重要作用。BdARF基因具有清晰的组织和器官表达偏好，并参与非生物应激反应，表明其在植物生长和胁迫性中的作用。

生长素在植物生长和发育中起重要作用，包括芽伸长，侧根形成，血管组织分化，顶端边缘图案化和响应于环境刺激[1]。生长素基因家族参与植物应激反应，并且包括AUX / IAA.那小生长素Up RNA（Saur.),格雷琴Hagen 3（GH3） [2那3.]。生长素反应因子(Auxin response factors, ARFs)是生长素介导途径中一个重要的转录因子家族，参与激素调控和植物发育[4.那5.那6.]。它们特异性地结合在恒生响应基因的启动子区域中的助长响应元件（辅助）（5'→3'tgttcc）以调节基因转录[1那7.]。

ARFs包含三个独特的结构域:一个保守的n端dna结合结构域(DBD)，一个可变的中间转录调节区域(MR)，作为激活结构域(AD)或抑制结构域(RD)，和一个c端二聚结构域(CTD) [8.那9.]。一个DBD的主要功能，其中包含B3和auxin_resp结构域，被结合的生长素应答基因AuxREs [10]。MR中的氨基酸的类型决定了基因转录是否被激活或压抑。AD通常富含谷氨酰胺（Q），丝氨酸和亮氨酸（L）残留物，而RD富含脯氨酸（P），丝氨酸，苏氨酸（T）和甘氨酸（G）残留物[7.那9.]。甲CTD，类似于AUX / IAA蛋白的PB1结构域，基序包括III和IV涉及蛋白质 - 蛋白质相互作用并介导ARFs的同源二聚化或ARF和AUX / IAA [的异二聚7.那10那11]。通常通过ARF和Aux / IAA蛋白的相互作用对植物素的特异性反应发生[12]。当唾液浓度低时，Aux / IAA和ARF的异二聚体抑制ARF的转录活性，从而防止相关基因的转录。然而，当植物素浓度达到一定水平时，泛素连接酶SCF^{tir1 / afb}亚基泛酸菌素/ IAA并通过26s蛋白酶体途径降解它，削弱了AUX / IAA对ARF的抑制作用[7.那8.]。

由于鉴定东盟地区论坛基因拟南芥[13］，东盟地区论坛已发现约16种植物物种。以及它们的结构，演化和表达分析已被广泛研究这些植物，例如拟南芥[14]， 白饭 [15]，以及玉米[16]。ARFS在植物生长和发展中发挥着重要作用。例如，AtARF2可调节的花脱落[17]，叶子衰老[18]和种子大小[19];AtARF3缺陷导致无异常的花卉分生和生殖器官[20.];AtARF5与维管束和下胚轴的形成有关[21];ARF6和ARF8从不成熟的坐标过渡到成熟，育花[22];和AtARF7和Atarf19调节侧根的形成，激活小黑裙/美国手语基因[23]。在番茄植物中（Solanum lycopersicum）那东盟地区论坛基因可能影响花和果实发育[24]， 和SlARF4在果实发育过程中的糖代谢中起作用[25]。在米饭，OsARF12在调节磷酸盐稳态中发挥作用[26]。值得注意的是，这是东盟地区论坛基因家族参与植物对非生物压力的反应[27那28那29那30.]。例如，许多东盟地区论坛基因高粱双色在盐和干旱胁迫下表现出显著的表达变化[29]。一些水响应响应GMARFS.大豆（大豆）使用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）和微阵列数据[已经确定30.]。

Broachypodium distachyon.L.．（2n = 10），第一测序成员Pooideae[31，是研究谷物的理想模式植物[32]。它具有简单的增长要求[32那33]，基因组小，二倍体遗传(272 Mb)，自交，世代短，个子小但种子大，亲缘关系较近Triticeae作物而不是米[34]。虽然有些研究专注于东盟地区论坛基因家族[14那15那16]，结构表征，分子演化，表达分析和功能性质b . distachyon ARF家人至今未明。我们完成的第一个全面的全基因组分析东盟地区论坛基因家庭B. Distachyon.和我们的研究结果提供新的见解的结构，演变，植物的功能东盟地区论坛家庭。

基因组识别东盟地区论坛在B. Distachyon.和其他植物物种

已知的23和25个ARF氨基酸序列来自水稻和水稻拟南芥,分别从RGAP和TAIR数据库获得。这些序列被用作在植物血统数据库中搜索的查询。如果是E.-value≤1e-5的序列，视为候选序列。使用在线工具SMART对BLASTP的搜索结果进行了进一步的检查[35]及pam [36]，以确定是否存在保守的B3和Auxin_resp结构域，人工去除多余或部分序列。其余序列均满足CDS中不含N的从M开始的氨基酸序列，具有完整的基因序列。最终，共有19个ARF蛋白家族成员来自B. Distachyon.从其他六种植物中鉴定出163种：20种奥雅萨苜蓿63年,从Triticum Aestivum., 18脚趾斜体，从25Zea Mays.21岁的高粱双色， 16来自拟南芥．包括基因名称、基因座、蛋白长度、内含子数目、预测等电点(PI.)和分子量(MW)列于附加文件1：表S1及其由SMART和Pfam识别的保守基序列在附加文件中1：表S2。一般来说，东盟地区论坛用513-1175氨基酸（AA）编码蛋白质，预测等电点（PI.）从5.45〜9.18和分子量（mw）之间的63.74和130.93kda。

染色体和亚细胞定位BDARFS.

使用MapInspect程序，所有19东盟地区论坛基因B. Distachyon.被定位到五个不同的染色体上(图。1): 01号染色体上有两个基因(BDARF2.：BRADI1G32547和BdARF19：Bradi1g33160)， 6个位于02号染色体(BdARF10：Bradi2g59480；BdARF11：Bradi2g16610;BdARF12：BRADI2G50120;BDARF13：BRADI2G46190;BDARF14：Bradi2g08120;和BdARF15：BRADI2G19867.），四染色体03（BdARF3：BRADI3G04920;BDARF6.：BRADI3G45880;BdARF16：BRADI3G28950和BdARF17：Bradi3g49320)，第04号染色体上有3条(BDARF1.：Bradi4g01730；BdARF7：BRADI4G17410.和BdARF9: Bradi4g07470）和四种染色体05（BdARF4：Bradi5g25767;BdARF5：Bradi5g25157;BdARF8：Bradi5g10950和BdARF18：Bradi5g15904)。

19编码的蛋白质的位置东盟地区论坛在B. Distachyon.五个不同的软件程序都预测它们位于细胞核中。为了验证这些亚细胞定位预测，5东盟地区论坛被选择的基因以执行与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白的瞬时表达在拟南芥悬浮培养细胞。用共聚焦激光显微镜进行显微检查。利用这些蛋白(BdARF1, BdARF4, BdARF5, BdARF8, BdARF16)构建重组质粒(BdARF1 :: GFP那BdARF4:绿色荧光蛋白那BdARF5:绿色荧光蛋白那BdARF8 :: GFP， 和BdARF16:绿色荧光蛋白）35s启动子。附加文件1：表S3总结了所使用的引物。五种GFP融合蛋白的绿色荧光信号在核中特别强烈较强（图。2）和与预测结果一致。

系统发育和分子特征东盟地区论坛

使用逻辑预期（肌肉）程序的多个序列比较进行182 rF蛋白的多个序列比对[37那38]，接着施工使用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）方法的无根系统树基于贝叶斯推理[39.]。通过组合拓扑和结构相似性分析，将182个ARF蛋白分为三个分支：Clade I（包括Clades Ia和Ib），Clade II和Clade III（图。3.)。Clade Ib是最大的分支，有58个东盟地区论坛其次是分支Ia(51个成员)、分支III(39个成员)和分支II(34个成员)。系统进化树显示东盟地区论坛单子叶植物的基因B. Distachyon.均匀地分布在各个分支，而来自双子叶拟南芥主要存在于克莱德IA。

外显子内部结构东盟地区论坛基因家族的B. Distachyon.另外6种植物提交分析东盟地区论坛编码序列（CDS）及其对基因结构显示服务器（GSD）的相应基因序列[40]。同一思工成员之间的外显子数量没有显着差异，但不同的植入物之间存在值得注意的差异，特别是在思工三世和其他地图林之间（附加文件）2:图S1)。支Ia、支Ib和支II分别有12-15个外显子、12-16个外显子和9-12个外显子。在进化支III中，所有的成员都有2-5个外显子SbARF1有14个外显子。

主题检测软件模因（用于图案诱导的多个EM）[41.，对ARF蛋白序列进行基序分析。从182个ARFs中共检测到10个保守motif。单个ARF中主题的订单和数量显示在附加文件中3.：图S2，以及每个主题的序列组成在附加文件中显示4.：图S3。包含在通常范围从8到10。根据基序检测时，基序的分布和位置的结果ARFs基序的数目是进化枝的内部成员之间相对保守。有趣的是，进化枝II的几乎所有成员有8个主题，从其他分支显著不同与10-11图案。

功能性分歧和自适应选择

为了探究氨基酸替换是否会导致功能差异，我们对该基因簇的I型和II型功能差异进行了研究东盟地区论坛使用DIVERGE v2.0程序进行估算[42.那43.)(表1)。结果表明，ARF蛋白任意两个分支的I型功能分化系数(Type I functional divergence coefficient， θI)范围为0.209 ~ 0.733，显著大于0。LRT值差异显著(P. < 0.5), indicating the possible presence of Type I divergence sites during the evolution between the clades of plant ARF proteins. Similarly, the Type II functional divergence coefficient (θII) ranged from − 0.161 to 0.113, which is also significantly greater than 0, indicating that Type II functional divergence sites may be also present.

根据Yang等人[44.]，发散的每个氨基酸位点的后验概率（Qk的）计算，以确定每两个进化枝之间相关功能分化关键位点。Qk的大值指示功能分化两个进化枝[之间的高概率42.]。I型和II功能分歧残留物与QK≤0.95以减少误报。结果表明，在片状的成对分析中发现了每两片曲线和可变数量的I和II型功能性分发位点（DS）之间存在的I和II型功能分歧位点：CLADE IA和IB（0 DS），IA和II（8DS），IA和III（12ds），IB和II（2DS），IB和III（8ds）和II和III（3ds）。相比之下，II型网站比I型网站更常见（表1)。具体的第I类和第II类功能分歧地点见附加文件1：表S4。特别是，8个氨基酸位点接受I型和II型功能分歧，表明改变了它们的进化率和物理化学性质（附加文件5.:图S4)。

为了假设位点之间的可变选择性压力，将特定于站点的模型应用于东盟地区论坛7种选定植物的基因家族。两对模型，M0(一个比例尺)和M3(离散)，以及M7 (beta)和M8 (beta和ω) [45.]，在本分析中应用（附加文件1：表S5）。没有氨基酸位点被鉴定为在阳性选择下，表明东盟地区论坛基因家族是不是在选择压力下。的分支站点模型东盟地区论坛使用特异性分析进一步分析基因家族（表2)。在进化枝Ia中鉴定出7个阳性选择位点，包括4个关键的阳性选择位点(340G、355 T、356 T和358P、P. < 0.01). Meanwhile, 44 and 20 positive selection sites were present in clade II and clade III respectively, including 34 critical sites in clade II (232S, 250H, 259 T,P.< 0.05;230m、238D、239S、240m、241H、243G、246A、247A、255 N、275 L、276A、279 V、282 V、287 V、289 V、295 M、308 M、310 T、312 T、314I、337S、338 T、340G、343Q、344P、345R、353P、354 L、358P、371P、P. < 0.01) and 12 critical sites in clade III (253A, 254 T, 286R,P. < 0.05；204D，230 M、 231P、232S、233S、236S、237S、246A和144G，P. < 0.01). Interestingly, clade Ib had no positive selection sites, implying that clade is under neutral or negative selection, while clades Ia, II and III may undergo strong positive selection. In particular, six sites (241H, 243G, 244 L, 310 T, 340G and 355 T) experienced two types of functional divergences and positive selection pressure (Additional file5.:图S4)。

启动子分析东盟地区论坛基因家族

启动子区域包含独联体-调控基因表达的作用元件。这独联体-作用元素在上游1500bp区域东盟地区论坛由PlantCare在线工具调查基因家族[46.]。总共鉴定出七种类型的元素：激素响应，环境应力相关，促进者相关，位点结合相关，轻响应，发育相关元素等。其中，光周期，发育调节，荷尔蒙反应和环境反应是与监管要素密切相关的主要生理过程（附加档案1:表S6)。

我们分析了在东盟地区论坛基因家族的B. Distachyon.，包括P-box [47.]，Gare-motif [48.]，TCA元素[49.]，ABRE [50.] TGACG-MOTIF和CGTCA-MOTIF。其中，ABRE，TGACG-MOTIF和CGTCA-MOTIF丰富，平均拷贝数分别为2.737,1.789和1.789。这些元素主要与脱胶（ABA）和甲基茉莉酸（MEJA）应力相关。

此外独联体-对环境压力源作出反应的元素被吸引和识别B. Distachyon.，包括HSE [51.]，LTR，GC-MOTIF和[52.]， Box-W1, wun motif, TC-rich [52.]。值得注意的是，GC-基序和ARE元件，涉及在不存在氧的应力基因表达的调节，被认为是丰富的（1.000和1.474份）。发展相关的元素，如GCN4基序，和CAT-中，被确定，这是比较丰富（附加文件1表S6)，与胚乳发育和分生组织生长有关，但在单子叶植物和双子叶植物中，它们的丰度没有显著差异。与此同时,photoreactive元素Sp1在二象状体中不存在拟南芥，但在丰B. Distachyon.(1.316拷贝)比较高。这与其他单子叶谷物相似，表明东盟地区论坛基因可能在光合作用或碳水化合物合成中发挥作用。

BDARF蛋白的三维结构预测及临界氨基酸位点的鉴定

19个bdarf的三维结构B. Distachyon.通过搜索PHYRE2数据库并使用Pymol软件进行可视化预测[53.]。所有BdARF蛋白具有相似的结构特征;一个代表BdARF1示于图4.．六个key sites (688H, 690G, 691 L, 774, 839G and 856 T) identified by positive selection and functional divergence are marked in green in the 3D structure (Fig.4.A和B）。Three sites (241H, 243G and 244 L) were located on helix, two (340 T and 355 T) on the loop and one (310 T) on the sheet. Interestingly, 5 sites (241H, 243G, 244 L, 310 T and 355 T) exist on the surface of the 3D structure (Fig.4.C和D）。

BDARFS的蛋白质相互作用分析

蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）的研究有助于了解基因功能[54.]。因此，为了更好地了解ARF是否通过蛋白质交互施加生物学功能，使用字符串数据库来构建BDARFS的PPI网络[55.]。从整个相互作用网络中提取出PPI网络和潜在底物，并用Cytoscape软件(version 3.0.2)重建。在PPI网络中共鉴定了10个bdarf(均非来自分支II)和5个Aux/IAA蛋白(附加文件)6.：图S5）。

的表达b . distachyon ARF不同组织和器官的基因

19的表达配置文件b . distachyon ARF基因D.ifferent clades in six tissues and organs were analyzed by qRT-PCR, including root, stem, leaf, root tip, leaf tip, and developing seeds at 15 days post-anthesis (DPA). The primer sequences for qRT-PCR assays are listed in Additional file1: S7表。最优参数得到一个相关系数(r²)0.994–0.999，PCR扩增效率（E）为90–110%（附加文件7.:图S6，附加文件8.：图S7）。

如图1所示。5.那BDARFS.通常在叶、根尖、茎和发育中的种子中有较高的表达量。这BdARF不同进化支的基因表达也存在差异。我进化枝,BDARFS.主要表达于叶、根尖或种子中。六个BdARF基因（BDARF6.那BdARF7那BdARF8那BdARF9那BdARF10， 和BDARF14）从进化枝IA曾在叶/根尖高水平的表达。除了BDARF6.和BDARF8，其他四个基因也高度在种子中表达。这是与启动子分析表明一致BDARF6.和BdARF8几乎没有独联体-与胚乳发育有关的作用元素。这BDARFS.来自Clade IB也具有类似的表达偏好。例如，BDARF1.在根尖上大量表达，但没有在根和叶子中表达。BdARF5在除叶片外的所有组织和器官中均有表达，且在发育中的种子中表达量最高。BDARFS.从Clade II主要表达茎和叶尖，其中BdARF11和BdARF15主要在茎中表达，而BdARF12和BDARF13主要在叶子提示中表达。BDARFS.来自进化枝III主要表达在叶和根尖和发育中的种子，其中BdARF16种子中具有极高的表达水平（图。5.)。

表达分析二穗短柄草ARFs响应各种非生物压力源

九代表BDARFS.进一步检测其在不同非生物胁迫下根和叶中的表达模式(图2)。6.)。这些基因包括在内BDARF6.那BDARF8，和BdARF10来自克莱德IA，BDARF2.和BdARF4从进化磅，BdARF12和BdARF15从进化枝II，和BdARF17和BdARF18从进化枝III。这一种B.iotic stressors used were osmotic (NaCl and polyethylene glycol (PEG)), heat (42 °C), heavy metals (Zn^{2 +}和铬^3＋）和植物激素ABA，吲哚-3-乙酸（IAA）和水杨酸（SA）。引物序列，最佳参数和PCR放大效率列于附加文件中1：表S7，附加文件7.：数字S6和附加文件8.：图S7分别。

一般来说，大多数九个BDARFS.响应单一和多种非生物应激处理，在根和叶中表现出显着上调的表达。同时，观察到转录表达差异BdARF不同进化支的成员，包括显著的上调BdARF8从IAA，SA下的CLADE IA，CR^3＋，Zn.^{2 +}和PEG应激源；BdARF10从IAA应力下的同一分支;BdARF4从SA，铬下分支磅^3＋和zn.^{2 +}压力源;BdARF15IAA和SA胁迫下的进化枝II;和BdARF18从ABA，锌条件下进化枝III^{2 +}，和NaCl胁迫(图。6.)。

这BDARFS.在非生物胁迫下，根与叶之间的表达也有明显差异。在根，几乎所有BdARF外部治疗下的基因显着上调，除了BDARF2.和BdARF12,显著下调。相比之下,只有BdARF10和BdARF18ABA处理下，其他基因表达上调，其他基因表达下调。SA治疗显著上调BDARF2.那BdARF4那BdARF8， 和BdARF15．在重金属下（Zn^{2 +}和铬^3＋）压力源，BdARF4那BDARF8，和BdARF18被显著上调。当植物从渗透压力之苦，BdARF基因在根叶比更敏感，并且通常显示后PEG和NaCl处理显著下调。对于热应激，所有的基因被下调，除了BdARF4是显著的调节。

在叶子里，BDARFS.通常从激素治疗中显着上调，包括全部BdARF基因除外BDARF2.那BdARF17,和BdARF18IAA胁迫下，四种基因（BDARF6.那BdARF4那BdARF17,和BdARF18)， 5个基因(BdARF4那BdARF8那BdARF12那BdARF15,和BdARF17)在SA应力下。当受到重金属（Zn^{2 +}和铬^3＋)治疗BDARFS.被上调，除了两个基因（BDARF2.和BdARF10）在Cr.下^3＋应力和三种基因（BDARF6.那BdARF10和BdARF12）锌条件下^{2 +}压力显着下调。在渗透压下，BdARF15那BdARF17,和BdARF18盐胁迫下被上调显著和BdARF4那BDARF8，和BdARF17在PEG应激下显着上调。但是，所有人BDARFS.对热应激的响应下调(图。6.)。

我们的结果显示BdARF基因（BdARF4那BdARF8那BdARF10那BdARF12,和BdARF18)在根和叶中普遍表现出显著的上调表达^3＋，Zn.^{2 +}， PEG和IAA治疗。因此，这些动态的表达模式BDARFS.在6个时间点(0、6、12、24、48 h和恢复48 h)， Cr^3＋，Zn.^{2 +}PEG和IAA)进行了进一步研究(图。7.)。结果显示BDARFS.胁迫处理后，叶片中普遍表现出明显的上调表达模式，而根系中则表现出明显的下调表达模式BDARFS.在治疗后在6,12和24小时上上调并在48小时和48小时后下调（图。7.在树叶)。BDARFS.W.ere upregulated at 6, 12, 24, and 48 h after stress treatments and at 48 h of recovery (Fig.7.b).有趣的是BdARF4那BDARF8，和BdARF12在叶片和根部响应于IAA胁迫而上调，但在CR下呈现出对的趋势（下调）和叶子（上调）^{3 +}压力。

分子表征与进化东盟地区论坛基因家庭B. Distachyon.

全基因组分析表明19BDARFS.从B. Distachyon.其他6种植物的163种被分为3个分支(图。3.)。这东盟地区论坛进化枝内具有相似的内含子 - 外显子结构特征，这表明的保护东盟地区论坛片断内的结构（附加文件2:图S1)。大部分的东盟地区论坛主题集中在8-10(附加文件3.：图S2和附加文件4.：图S3），证明的进化保守东盟地区论坛植物物种之一。然而，几乎所有的进化支II成员都失去了两个motif，这可能是由于进化过程中选择压力的影响。进一步的蛋白质预测分析显示，ARF可以通过形成同源二聚体或异源二聚体来实现生物学功能，这与以往的报道一致[10那11那56.]。进化支II没有成员参与蛋白质相互作用网络(补充文件6.：图S5），可能是由于缺乏这两个重要的主题的。

在一个基因家族中，通过复制产生的新基因可能由于新功能的进化而被保留，也可能丢失[57.]。一般来说，复制基因在进化的早期阶段没有受到选择压力，或者不表现出通常在积极选择压力下出现的特征。在特殊功能的进化中，选择压力往往是负的，因为每个基因都有一个固定的功能[58.那59.]。在这项研究中，一个站点的具体型号并没有检测到任何积极的选择位点（附加文件1：表S5），和玉米东盟地区论坛发现基因家族受到负面选择[60.]。因此，我们推测古代植物ARF蛋白经历了负面选择以保持其功能。

氨基酸位点突变经常发生并积累质量变化，使得重复基因在功能中发散[61.那62.那63.那64.]。我们发现在每对片状之间发生功能歧化，而II型歧化位点的数量远远大于I类型（附加文件）1:表S4)。进化支之间的功能差异主要是由于氨基酸理化性质的变化和进化速度的变化[42.]。此外，8个关键氨基酸位点同时存在I型和II型功能差异。这些位点的进化速率和理化性质发生了变化，表明这些位点对ARF蛋白家族的功能分化具有重要作用。特别是，6个关键氨基酸位点同时经历了功能分化和正向选择压力，这可能在结构域分化中发挥关键作用(附加文件)5.:图S4)。

表达和功能二穗短柄草ARFs对非生物应激源的反应

蟾蜍素在对非生物压力源的反应中起重要作用，ARF是毒素信号通路中的重要转录因子[65.]。的启动子区域东盟地区论坛含有大量的独联体- 与非生物压力相关的元素，表明这一点东盟地区论坛可能参与压力防御。

ARFs的活性受生长素浓度的调节[8.]因此，我们重点研究了外源激素对细胞凋亡的影响东盟地区论坛表达。几乎所有的BDARFS.显着上调B. Distachyon.幼苗、根和叶。这一现象可能是由于外源IAA影响生长素的稳态，促进运输抑制剂抗性1 (transportinhibitor resistant 1, TIR1)的上调，TIR1具有F-box结构域，与SCF泛素连接酶结合形成SCF^TIR1复杂的 [66.]。当AUX / IAA绑定到SCF时^TIR1复合物，它被泛素化，随后被蛋白酶体降解[4.那67.]。随后，由于Aux/IAA的降解，ARF蛋白被释放并积累，激活或抑制下游基因的表达[68.]。ABA作为一种重要的植物激素，参与多种非生物胁迫的响应，调节胁迫耐受性以应对环境胁迫[69.]。植物可以感测外部环境变化的多种方式，其中之一是在生长素浓度的变化[70]。当应激源引起生长素增加时，植物激活ABA和其他途径[71.]并促进应激防生基因的表达，例如C-重复/脱水响应元件结合因子（CBF）或响应于脱水（RDS）基因[72.]。同时，大量的GH3家族基因通过促进ARF的基因的表达来诱导负调节生长素水平[72.]在本研究中，我们发现外源性ABA和SA通常会上调BDARFS.在叶子中（图。6.)。因此,BDARFS.可以被ABA和SA诱导，激活下游基因以响应植物激素胁迫[15]。

重金属污染是一个日益严重的全球性问题。当植物受到重金属胁迫时，活性氧(ROS)的增加是一种普遍现象[73.那74.]。随着ROS的增加，植物通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导的信号通路来应对应激[75.那76.]。活化的MAPK途径可能主要通过诱导一些保护基因的表达并激活压抑A的表达RFS.[77.]。此外，ROS可以通过抑制TIR1影响与ARF相关的泛素降解途径，进而影响内源性生长素水平[70]。

在NaCl和PEG治疗下，大多数BDARFS.被抑制,但BdARF8那BdARF10，和BdARF18被显著上调（图6.），这表明它们参与渗透应激反应。先前的研究发现，slarf8a.和SlARF10A响应于盐和干旱胁迫在番茄植株[被上调78.]。此外，AtARF8在拟南芥中可能通过影响下胚轴和根的生长习性而参与生长素稳态[79.]。Atarf10影响根的形成，暗示它在应对压力中起着重要作用[80]。此外，在盐和干旱胁迫下，植物会激活GH3通过表达东盟地区论坛和ABA途径来维持生长素稳态，并激活相关的胁迫响应基因以减弱或消除胁迫的影响[72.]。我们的结果表明，只有BdARF4基因在热应激下的根部中显着上调。迄今为止，植物机制东盟地区论坛对热应激的防御是不太清楚。许多研究发现，ABA / SA和Ca^{2 +}，其表示ABA依赖性和钙依赖性蛋白激酶（CDPK）信号传导途径，都涉及植物热应激反应[81.那82.那83.]。BdARF4此外，尽管植物通过ARF相关泛素降解途径和ABA途径来维持生长素的内环境稳定，以应对激素、渗透和热应激，但胁迫也可诱导ROS的积累和与ABA和其他途径的串扰，以减少ROS铝与复杂非生物胁迫[70那84.那85.那86.]。

全基因组分析发现19BDARFS.在B. Distachyon.还有163种来自其他6种植物，它们被分为4个分支。内含子-外显子结构分析显示其具有进化保守性东盟地区论坛基因家族。蛹之间的功能分歧主要归因于氨基酸的物理化学性质的变化，其次是进化速率的变化。特别是，在六个位点（241h，243g，244l，310t，340g和355t）同时发生功能性发散和阳性选择，表明它们在结构域分化中的重要作用。BDARF通过亚细胞定位预测和经验证据位于核中。QRT-PCR分析表明表达了BDARFS.有一个组织和器官偏好表达，通常与在叶和根尖，茎高表达水平，以及发育中的种子。与此同时，一些BDARFS.在对非生物应激源的响应中显著上调，表明它们参与了应激抵抗。本研究结果为进一步了解该植物的结构、进化和功能提供了新的证据东盟地区论坛基因家族。

基因组识别东盟地区论坛基因Broachypodium distachyon.L.

东盟地区论坛基因Broachypodium distachyon.和其他六种植物物种，代表单焦炭和双点的植物谱系，包括脚趾斜体那奥雅萨苜蓿那高粱双色那Zea Mays.那Triticum Aestivum.和拟南芥.来自大米和拟南芥从RGAP获得（http://rice.plantbiology.msu.edu./)泰尔(http://www.arabidopsis.org/)数据库,分别。在植物数据库(http://www.phytozome.org；小麦- http://urgi.versailles.inra.fr/ seq-repository）[87.]，利用ARFs进行BLASTP分析大米和拟南芥作为一个查询。所有识别的arf都通过SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/） [35]及PFAM (http://pfam.xfam.org/） [36]E值小于或等于1E-5的数据库，因此手动删除冗余和部分序列。

染色体位置，亚细胞定位和系统发育分析

的位置东盟地区论坛基因B. Distachyon.从Phytozome数据库获得的染色体是由MapInspect程序映射和手动修改。

根据燃料-MLOC服务器的预测结果的集成来预测ARF的亚细胞定位（http://bioinfo.eie.polyu.edu.hk/FUEL-mLoc/） [88.]，狼Psort（http://www.genscript.com/wolf-psort.html） [89.]，大提琴版本2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）[90.), Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/） [91.]及UniProtKB (http://www.uniprot.org/).为了验证亚细胞定位预测，将东盟地区论坛不含终止密码子克隆到绿色荧光蛋白（GFP）载体，进行亚细胞定位。该重组质粒瞬时转化到拟南芥通过PEG介导的转化的叶片原生质体[92.]。After an overnight incubation at 26 °C in the dark, GFP signal was detected by a Zeiss LSM 780 fluorescence confocal microscopy.

基于Markov链蒙特卡罗（MCMC）方法基于贝叶斯推断构建系统发育树[39.].基于肌肉程序，使用全蛋白序列进行多序列比对(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/） [37那38]。

蛋白质特性和序列分析

ARFs的pI/MW由ExPASy蛋白质组服务器数据库(http://web.expasy.org/compute_pi/） [93.]。ARF基因的外显子-内含子结构来源于在线基因结构显示服务器v2.0 (GSDS:http://gsds.cbi.pku.edu.cn)的编码序列(CDS)和基因组序列[40]。MEME程序(Multiple Em for Motif Elicitation v 4.10.2 (http://meme-suite.org/tools/meme） [41.采用]用于识别候选ARF蛋白序列中的保守基序。MEME程序在本地运行，参数设置为最多10个图案。

1500 bp的上游区域东盟地区论坛构件区域被用作启动子分布区域，并且的启动子序列东盟地区论坛成员是从植物血红素中获得的（www.phytozome.net)数据库。将得到的启动子序列提交给启动子独联体- 在PlantCare数据库中进行分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） [46.]。

正选择与功能差异分析

本研究采用最大似然法检验阳性选择，PAML包中CODEML程序中的两个模型[45.那94.那95.]：网站模型和分支网站模型用于测试ARF蛋白家族的成员在进化期间是否被肯定选择。使用分歧V2.0软件包与后验概率分析相结合，分析I型和II型的ARF家族的不同亚属之间的功能歧化[42.那43.那96.]。

BdARF蛋白的三维结构的可视化

使用在线软件Phyre2构建BDARF蛋白的3D结构（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index） [53.]。然后，编辑被PYMOL软件（版本1.7.4薛定谔，LLC。，http://pymol.org/）以可视化BdARF蛋白质的三维结构和标记的3D结构地图上的筛选重要的氨基酸位点。

arfs与相关蛋白的互动预测

通过NCBI进行BLAST分析，收集ARFs的蛋白序列，并通过检索相互作用基因/蛋白(STRING)数据库(version 9.1，http://string-db.org） [55.]。Broachypodium distachyon.L.．，选择包括小麦和大麦的经济上重要作物物种的模型植物作为有机体，并且构建了具有信心得分至少0.700的PPI网络[97.那98.]并使用cytoscape（3.0.2版）软件显示[99.]。

植物种苗培育和非生物胁迫处理

BD21的种子好心由约翰·沃格尔博士从美国农业部（USDA）农业研究局（ARS）美国能源部提供的。标准二倍体自交系BD21的均匀的种子用75％酒精和15％次氯酸钠进行灭菌，然后用无菌水洗涤三次。After sterilization, 500 g of seeds were germinated on water-filled filter paper for 3 days under complete darkness at 26 °C in three biological replicates. At the fourth day, seedlings were transferred to dedicated cultivation baskets with full-strength Hoagland solution (5 mM KNO_3.那5. mM Ca(NO_3.）₂， 2 mM MgSO_4.，1毫米kh₂宝_4.， 50 μM feena₂(EDTA)₂，50μmh_3.博_3.那10 μM MnC1₂, 0.8 μmZnSO_4.，0.4μmcuso_4.，0.02μm（nh_4.）_6.Moo.₂₄）在温室，在28/26°C（日/夜）条件下的16/8小时（光/暗）光循环下，相对湿度为70％。营养溶液每2-3天改变。在对照组的三个叶阶段中收集五种不同的器官和组织（根，茎，叶，叶子尖端和根尖端），以及15dPa的显影种子。同时，用以下条件处理幼苗：盐度应力（200mM NaCl），温和的干旱胁迫（20％（W./V.PEG 6000)、重金属应力(300 μM CrCl_3.和znso._4.)、激素胁迫(100 μM ABA和SA, 10 μM IAA)、热胁迫(42℃)。对照苗在0 h时采收叶片和根系样品。热胁迫2 h采集幼苗样品，其他处理幼苗分别在6、12、24、48 h采集，48 h恢复。每个样品均采自10株植物，分3个生物重复。所有收集的样品在使用前立即保存在−80°C。

总mRNA提取和基因表达水平分析B. Distachyon.的存在

通过使用Trizol试剂（Invitrogen）收集的冷冻样品中提取总mRNA，并且使用Primescript®Rtreagent套件（Takara，Shiga，Japan）进行cDNA合成。QRT-PCR过程中涉及的所有引物使用在线工具Primer3plus设计（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi.)，并通过相应的分离曲线和凝胶电泳检测引物的特异性。使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和插层染料SYBR green在2(−δC（T））方法[100.]。泛素（Bradi3g20790）用作参考基因，和qRT-PCR根据Cao等人进行的。[101.]，对每个标本进行3次生物重复，取Ct值平均值。

阿巴：

脱盐酸

广告：

激活域

东盟地区论坛:

助线响应因子

辅助/ IAA:

生长素/吲哚-3-乙酸

敬仰：

助线响应元素

CBF:

C-repeat / dehydration-responsive元件结合的因素

CDPK:

钙依赖性蛋白激酶

CD：

编码序列

仪:

C端二聚结构域

达皮：

4.^'，6-二脒基-2-苯基

DBD：

dna结合域

分区:

黄色假期

GFP：

绿色荧光蛋白

国际宇航科学院:

吲哚-3-乙酸;

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

Mapkk：

MAPK激酶

Mapkkk：

MAPKK激酶

MCMC：

马尔可夫链蒙特卡罗

MEME:

多个EM于Motif启发式

先生:

中间转录调节区

肌肉:

多重序列比较的对数期望

MW：

分子量

PEG：

聚乙二醇

pI:

等电点

PPI:

蛋白质 - 蛋白质相互作用

qRT PCR：

实时定量聚合酶链反应

RD:

镇压域

RDs:

反应脱水基因

ROS：

活性氧

SA：

水杨酸

TIR1：

运输抑制剂抗性1

英文本文件中已被至少两名专业编辑，英语母语人士检查。对于一个证书，请参阅：http://www.textcheck.com/certificate/bblkxd.．

资金

这项研究是由财政从国家重点R＆中国（2016YFD0100502）的d项目和中国国家自然科学基金（31771773）资助。出资者已在研究和收集，分析和解释数据的设计，并以书面的稿子没有任何作用。

可用性数据和材料

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

作者笔记

1. Nannan Liu，Liwei Dong和Xiong Deng在这项工作中同样贡献。

隶属关系

1. 首都师范大学生命科学学院，北京100048

   楠楠刘，董立伟，邓雄，刘Dongmiao，刘悦，李加盟费，迎考胡＆闫月明

贡献

LN和DL进行了所有的实验和数据分析。XD、LD和YL进行RNA、cDNA的制备、qRT-PCR和生物信息学分析。LM收集植物材料，对生物信息学和qRT-PCR结果进行分析，并对手稿进行修改。YY和HY构思了研究，策划了实验，并帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应于Yingkao胡或者Yueming严．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版

不适用。

竞争利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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再版和权限