HyPRP1gydF4y2Ba对棉花抗性有负调控作用gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba通过细胞壁增厚和ROS的积累gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

发展中国家通过将耐药基因宽容品种被认为是用于控制黄萎病，导致棉花的产量和纤维品质严重损失的潜在战略。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这里，我们识别了这个基因gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba海岛棉gydF4y2Ba，它编码一个含有富含脯氨酸重复结构域和花粉Ole e I结构域的蛋白质。GbHyPRP1位于细胞壁。该基因的转录主要发生在棉花的根和茎中，并在棉根和茎中被侵染后显著下调gydF4y2Ba黄萎病dahliaegydF4y2Ba．沉默gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba显著增强了棉花对gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．表达的gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba显著降低了转基因的抗性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．这gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba启动子区含有几种推定的植物激素响应元素，其中SA与基因下调相关。我们比较了mRNA表达模式gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默的植物和控制在全球水平的RNA-Seq。共有1735个独特基因表现出显著差异表达。其中，79个deg参与细胞壁生物发生，43个deg与ROS的产生有关。进一步，我们观察到束间纤维和血管壁的显著增厚和木质素的增加gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默的棉花植株与对照比较gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．此外，沉默gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba活性氧在棉花根尖的积累显著增强gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的结果表明，我们的结果gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在棉花抗病性的负调控中发挥作用gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba通过细胞壁增厚和ROS的积累。gydF4y2Ba

植物细胞壁中含有大量组参与防御反应的结构蛋白。细胞壁蛋白异常丰富中的一个或两个氨基酸并含有高度重复序列结构域。目前，很多人知道它们的序列信息，但这些蛋白质的功能[很少直接证据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．混合富含脯氨酸的蛋白质（HyPRPs）形成脯氨酸富集推定的植物细胞壁的糖蛋白的一个亚组。HyPRPs由三个不同的结构域组成：疏水性的信号肽，在N-末端的重复富含脯氨酸的结构域，和疏水性C末端结构域，没有特别富含脯氨酸或甘氨酸，但是含有半胱氨酸。基于本C-末端结构域的半胱氨酸的丰度和特定分布，HyPRPs被细分为A，B组。In group A, four or six cysteine residues are present in a specific pattern (-CXXC-C-C-C-C-), while group B contains eight cysteine residues (termed the eight-cysteine motif, 8CM) in a specific order (-C-C-CC-CXC-C-C-) in the C-terminal domain [2gydF4y2Ba］．多项研究表明，B族HyPRPs在特定的发育阶段以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥着不同的功能作用。例如,gydF4y2BaCaHyPRP1gydF4y2Ba表现为基础防御的负调节器和细胞死亡的正规调节的不同的双重角色gydF4y2Ba甜椒gydF4y2Ba反对gydF4y2Ba黄定gydF4y2Ba［gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGmHyPRPgydF4y2Ba参与触发大豆抵抗响应gydF4y2BaPhakopsora pachyrhizigydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．HyPRP基因gydF4y2BaEIRGEI1gydF4y2Ba(早期拟南芥铝诱导1)诱导gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba受低温及盐胁迫影响[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGhHyPRP4gydF4y2Ba已被报道参与冷应激反应gydF4y2Ba陆地棉gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．过度的gydF4y2Bacchyprp.gydF4y2Ba从gydF4y2BaCajanus毛竹gydF4y2Ba增加了对多种非生物胁迫的酵母和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，A组HyPRPs在植物发展和国防建设中的作用对病原体的袭击仍不清楚，而相比之下，目前B组作为，只有一组蛋白质，PvPRP1，已被广泛研究的相对较好表征的蛋白质。gydF4y2BaPvPRP1gydF4y2Ba通过可降reglatedgydF4y2Ba炭疽菌lindemuthianumgydF4y2Ba和通过伤害法国豆下胚轴而上调(gydF4y2Ba菜豆gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．的下调表达gydF4y2BaPvPRP1gydF4y2Ba响应于真菌感染是由于mRNA的去稳定化通过PRP-BP的结合（gydF4y2Ba光伏gydF4y2BaPrP1 mRNA结合蛋白质）在3'未翻译区域中的27核苷酸U-富域gydF4y2Ba光伏gydF4y2Baprp1 mRNA [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

黄萎病dahliaegydF4y2BaKleb是一种能引起棉花维管束枯萎病的土传病原菌。gydF4y2BaGossypiumgydF4y2Baspp)。黄萎病在大多数棉花产区已成为棉花最重要的病害[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．不幸的是，目前使用的杀菌剂并不能有效地保护棉花免受这种血管病的感染。因此，结合抗病种质资源开发抗病品种是目前防治该病最有效的策略。通过相关基因介导的分子水平上抗黄萎病的遗传解剖，将增强我们利用现有种质减少棉花产量损失的能力[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

近年来，高通量技术已被用于系统监测棉花的表达谱，并筛选广泛的差异表达基因/蛋白gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba最终目的是利用基因工程培育抗病品种。在根中共鉴定出188个差异表达蛋白gydF4y2Ba海岛棉gydF4y2Ba在感染gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba基于比较蛋白质组学分析[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．此外，有3442个ungenes与防御反应有关gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba被确定在gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba简历。7124使用RNA-Seq [gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．此外，从黄萎病菌的全长cDNA文库中鉴定出3027条抗黄萎病基因gydF4y2Bag .取得gydF4y2BaCV Pima90-53 [gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．这些全面的基因和蛋白表达的数据提供有用的分子信息。然而，深入了解了解棉花的防御机制响应gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba是必要的。gydF4y2Ba

之前，我们获得了大量的转录序列gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba有关对防御反应gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．其中，一种编码a组HyPRP蛋白的cDNA克隆，命名为gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba，其在棉花中的表达显著下调gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba接种。在本研究中，gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba其同源基因被克隆到其他地方gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba品种。的转录表达gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在不同的组织中进行了研究，并对不同的激素和gydF4y2Ba诉dahliae。gydF4y2Ba潜在的作用gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在负调控植物抗性方面gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和棉花病毒诱导的基因沉默（VIGS）。我们应用转录组分析，以systematacially探索背后的分子机制gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-介导的棉花防御反应gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．的重要作用gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba与棉花抗性有关gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba通过细胞壁和ROS积累的增稠证明。gydF4y2Ba

GbHyPRP1是一种细胞壁蛋白gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba挑战gydF4y2Ba

在此之前，我们从一个全长cDNA文库中分离到一个全长cDNA克隆gydF4y2Bag .取得gydF4y2BaPima90-53挑战与gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．cDNA克隆的5′非翻译区(5′UTR)为41 bp, 3′UTR为186 bp，具有多聚a尾，开放阅读框(ORF)为945 bp，可能编码一个314-氨基酸的蛋白。该蛋白由一个带有起始ATG密码子的26残基信号肽(SP)序列、一个位于n端富含165残基的脯氨酸结构域(PRD)(包含一个碱性组氨酸结构域)和一个123残基疏水的c端花粉Ole e I结构域(含半胱氨酸结构域)组成(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).根据序列特征和同源性搜索，该蛋白属于a组HyPRPs，命名为gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba（GenBank登录号kp162172）。Gbhyprp1具有预测的分子量为约33.59kDa，具有9.97的理论pi。对准结果表明gbhyprop1来自gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba与6个品种的其他GhHyPRP1蛋白序列一致gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。gydF4y2Ba

一个GFP基因融合在c端gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba在构建CaMV 35S启动子的控制下，成功转化烟草表皮细胞并瞬时表达。对照gfp分布于整个细胞，表明gfp定位于质膜和细胞质。相比之下，GFP信号表明融合的HyPRP1-GFP蛋白定位于细胞外周(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).此外，GbHyPRP1属于A族HyPRPs(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)，它们形成了富含脯氨酸的植物细胞壁糖蛋白的一个亚群。因此，我们推断HyPRP1定位于细胞壁。gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac,gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba在棉花植株各部位均有表达，其中茎中表达量显著高于叶片。的表达式配置文件gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba响应于所述高腐蚀性脱叶gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba对感染株进行检测gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba根和茎。qPCR的（实时定量PCR）分析表明，的表达水平gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba接种后，茎和根均显著减少gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这些数据表明gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba涉及棉花-gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba相互作用。gydF4y2Ba

诉dahliaegydF4y2Ba响应性的表达gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba表现出相同的趋势gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba如此gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba

我们进一步确定了gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba响应性的表达gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba使用抗性cv。ND601(DI = 22.63±2.28)和易感cv。Ccri8 (di = 57.59±2.76)[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]接种gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba结果表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba接种后抗病性和感病棉茎、根均显著降低gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba与对照组相比(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).此外，表示gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在抗性品种。ND601是显著较低较敏感品种。CCRI8（图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba这些结果进一步表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba棉花中是否存在负调控因素gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba相互作用。gydF4y2Ba

沉默的gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba提高对黄萎病棉花抗性gydF4y2Ba

我们进一步测试是否gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba是利用VIGS进行棉花抗黄萎病的必要条件，VIGS是一种常用的反向遗传技术。大约在浸润后两周，标记基因gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba-VIGS植物开始在真叶子中显示白化表型(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2A)。同时，表达gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在易感CCRI8使用半RT-PCR未检测到，这表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba已被静音(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图开通)。利用hyprp1沉默的植株接种黄萎病菌。在接种后15天(dpi)，与对照相比，VIGS植株的褪绿和萎蔫叶片较少(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa). VIGS植株的DI(32.67±1.96)显著低于对照(81.00±2.13)，即敏感的CCRI8变耐受性(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). VIGS测定表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba显著提高棉花对黄萎病的抗性。gydF4y2Ba

表达的gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba妥协gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba以抗黄萎病gydF4y2Ba

为了进一步确定参与gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba在黄萎病抗性中，植物过表达载体含有gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba构建35S启动子驱动的ORF并转化(gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba介导）成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．L1、L2和L3三条线用于进一步分析。15 dpi后gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba，与野生型相比，所有转基因株系表现出更多的萎蔫和黄化(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).转基因植株的平均DI为69.5(易感)，显著高于对照(29.8;分类为宽容)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).这些结果表明gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba妥协gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba到黄萎病阻力。gydF4y2Ba

GbHyPRP1gydF4y2Ba启动子中含有激素元素，并被SA下调gydF4y2Ba

的上游区域gydF4y2BaGbHyPRP1，gydF4y2Ba名为pgydF4y2BaGbHyPRP1，gydF4y2Ba基于测序的长度为1431 bp(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3)。pgydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba与引入的报告基因GUS融合gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物，GUS染色证实了启动子gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba在报告基因表达方面表现良好(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).利用PLANTCARE搜索启动子表明有几种潜在的诱导gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控元件与激素、防御和病原菌诱导子反应相对应gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).因此，我们研究了表达谱gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba以下治疗植物激素，包括SA（水杨酸），脱落酸（ABA），茉莉酸（JA）和乙烯（ET）。结果表明表达了gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba在喷施后12、24、36和48 hps (h)， SA显著下调，而ABA、JA和ET在不同时间点均显著上调(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba令我们吃惊的是，gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba草甘膦处理后的植株转录水平与草甘膦处理后的植株相当gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba-接种的棉花幼苗(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad和gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。这些结果意味着gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba可能在棉花抗gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba通过sa介导的信号通路。gydF4y2Ba

VIGS棉的转录组分析表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba影响的基因与细胞壁重塑和ROS平衡gydF4y2Ba

为了更好地理解HyPRP1介导的棉花防御反应的分子机制gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba，我们采用VIGS和RNA-Seq相结合的方法来比较mRNA的表达模式gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-在全球范围内静音和控制工厂。转录组文库产生了56,364,572到63,092,290个原始读取。经过清洗和质量检查，得到55,741,348 ~ 62,384,322个高质量reads，其中79.66 ~ 80.87%的reads被唯一映射到gydF4y2Bag .分子gydF4y2Bal . acc。TM-1 [gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，代表4万多个unigenes(RPKM≥1)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.下gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba应力，共1735个独特基因与对照相比表现出基于VIGS显著差异表达，其中包括816上调和919下调基因（gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value≤0.05)(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:数据S1)。gydF4y2Ba

其中，根据细胞壁基因组网络服务器(cell wall genomics webserver)的注释，我们鉴定了79个可能参与棉花细胞壁生物发生的差异表达基因(DEGs)。gydF4y2Bahttps://cellwall.genomics.purdue.edu/intro/index.htmlgydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.膨胀蛋白和木葡聚糖修饰酶通常在各种压力下上调，然后参与细胞壁重塑[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］．我们的RNA-Seq结果显示，6个expansin基因(Gh_A10G1374、Gh_A05G2385、Gh_A05G3493、Gh_A13G0050、Gh_D04G1924和Gh_D05G2650)和7个木葡聚糖内转葡萄糖基化酶/水解酶(XEH)基因(Gh_A02G1426、Gh_A11G1910、Gh_D03G0294、Gh_D11G2065、Gh_A11G0455、Gh_D05G1444和Gh_D02G1371)的表达显著上调gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2BaVIGS棉苗接种gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba与对照组相比。此外，活性氧(ROS)已被证明与棉花对真菌病原体的抗性有关[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．在这里，我们发现了43个与HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba，允许调节活性氧水平的动态变化(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.因此，我们的研究结果表明，HyPRP1的细胞壁结构蛋白可能在棉花抗的潜在作用gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba通过重塑棉花细胞壁和活性氧的产生感染。gydF4y2Ba

沉默的gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba导致细胞壁厚度和木质素含量急剧增加gydF4y2Ba

进一步确定消声的效果gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在细胞壁上，棉茎被组织学检查。采用10日龄的两个子叶完全展开的幼苗进行VIGS。两周后gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba沉默的植物接种gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．在14 DPI，的基部的横截面茎表明interfascicular纤维壁的厚度在明显增加gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默植物与对照的比较(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA和A'）。此外，我们研究了在使用透射电子显微镜，它揭示了厚度的显着降低超薄切片血管壁（图gydF4y2Ba6gydF4y2BaB和B'）。这些结果表明那沉默gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在无病原体条件下不影响细胞壁的发育，但抑制gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba表达显著增强细胞壁增厚响应gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．此外，测定了细胞壁残基中木质素的含量。数据显示gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在0 dpi、7 dpi和14 dpi时，沉默植株的木质素含量高于对照。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa - c)。因此，木质部和维管束的木质化细胞壁的自身荧光gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默的植物比对照更强烈，覆盖面积更大(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad - i)。gydF4y2Ba

沉默的gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba增强ROS积累感染棉花的根尖gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba

我们评估是否gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba沉默会导致棉花产生更多的活性氧gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba感染。DAB和NBT染色显示gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2BaVIGS棉O含量显著高于对照gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对照之下gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba感染(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaA和B）。特别地，Vigs植物不仅显示出较深从尖端染色约一毫米，而且在根的上部也检测到染色（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa和b). DCFH-DA染色进一步证实细胞内ROS水平升高gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba与对照相比，VIGS的棉花根系(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba这些结果表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba参与了感染gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．gydF4y2Ba

HyPRP1gydF4y2Ba是棉花抗黄萎病的负调控因子gydF4y2Ba

的角色gydF4y2BaHyPRPsgydF4y2Ba对多种非生物和生物因素的响应，如寒冷、盐度、干旱和病原体，主要是从它们的表达谱推断出来的[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba］．值得注意的是，所有这些gydF4y2BaHyPRPgydF4y2Ba据报道，基因在非生物因素作用下上调，在感染病原体时下调，如gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在gydF4y2BaC. annuum.gydF4y2Ba和gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba后gydF4y2Ba辣椒疫霉gydF4y2Ba感染 [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaPvPRP1gydF4y2Ba在细胞培养中gydF4y2Bap .寻常的gydF4y2Ba用诱导剂治疗[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．同样，在我们的研究中，转录抑制gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在抗性和感病棉花的根中也进行了检测gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba感染(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad和gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).这表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba参与棉花与黄萎病菌的相互作用。此外，基于VIGS和棉花中过表达的功能损失和增益研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物分别，我们展示了这一点gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba与对gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.因此，我们有理由推测，HyPRP1在棉花抗黄萎病过程中起着重要的负调控作用。gydF4y2Ba

HyPRP1gydF4y2BaSA可能下调棉花对gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba

当病原体攻击时，植物可以迅速启动免疫反应，该反应由特定的植物激素调节，这些激素在成分、数量和时间上都有很大的差异[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．通过差异基因表达和棉的转录图谱与接种的分析gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba， SA-， ABA-， JA-和et -介导的信号通路已被证实参与gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba电阻(gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．ABRE (ABA响应元件)(−292)、tca元件和ERE(乙烯响应元件)(−1128)已被报道在许多基因的上游区域，分别对ABA、SA和ET表达调控[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．在本文中，这些潜力gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-regulatory元件还发现在gydF4y2BapGbHyPRP1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).此外，表达式配置文件gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba以下这些激素治疗进行了检查。表达gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba而ABA、JA和ET则显著上调(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).激活复杂而协调的植物激素信号网络是植物免疫调节的重要机制。在许多情况下，这些激素相互作用是拮抗的或协同的[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba］．一般来说，需要活宿主(生物营养体)的病原体与sa介导的防御反应有关，而杀死宿主并以内容物为食的病原体(坏死营养体)与JA/ et介导的防御有关[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．有趣的是,然而,gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba是一种半生物营养的植物致病真菌。因此，我们推断gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba参与棉花抗病性研究gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba可能是由一个复杂的植物激素信号网络调控。这gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba转录水平在sa处理和gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba-接种的棉花幼苗(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad,gydF4y2Ba2gydF4y2Bab和gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)。此外,gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba感染显著增加SA水平gydF4y2Bag . thurberigydF4y2Ba［gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]，gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba和gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba幼苗(我们未发表的数据)。因此，我们推测gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba可能主要受SA信号通路的负调控gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．gydF4y2Ba

HyPRP1参与了棉花侵染后细胞壁聚合物网络的复杂相互作用gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba

细胞壁蛋白是植物细胞壁的基本成分，参与细胞壁结构的修饰[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．阿拉伯半乳聚糖蛋白31（AGP31），显着的植物细胞壁蛋白，包括一个SP，短AGP结构域，他的拉伸中，PRD和PAC（含PRP-AGP的Cys）结构域[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．拟南芥AGP31能够结合甲基化聚半乳糖醛酸，可能通过其His-stretch，并在体外通过其PAC域与自身相互作用[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．类似地，棉HyPRP1还包含一个SP，嵌入在PRD和图嵌入在花粉的Ole e口域内的含有半胱氨酸的结构域（内基本富含组氨酸的结构域。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。细胞壁，一种病原体需要侵入宿主植物的物理屏障，通常用酚醛聚合物木质素加强[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．木质素被认为是棉花的阻力发挥关键作用gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．通过比较转录组分析gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba沉默的棉花植株并且控制接种gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba，共鉴定出79个可能参与细胞壁生物发生的基因gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些基因，gydF4y2BaGh_D13G1445gydF4y2Ba被描述为甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶，催化生产gdp甘露糖。拟南芥gydF4y2Bacyt1gydF4y2Ba(编码甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶)突变体引起细胞壁成分的变化，如纤维素含量急剧下降[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．udp -糖基转移酶(UGTs)可以通过调节苯丙素和苯丙素衍生化合物的糖基化来影响植物对病原微生物感染的抗性，这对木质素的合成至关重要[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．木葡聚糖endotransglucosylase /水解酶（XTHs），特别是水解木葡聚糖作为底物，被认为是涉及建筑和在植物细胞壁木葡聚糖的交联的重组[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．钙调素是一种高度保守的钙调素gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba-结合蛋白，作为连接钙离子的中间体gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba参与植物防御反应的信号[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．以上所提到的大多数deg都有较高的转录水平gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默的植物，表明gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba是细胞壁相关基因的负调控因子。进一步，我们观察到束间纤维壁和血管壁显著增厚(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)和木质素的增加(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默的棉花植株与对照比较gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．在另一方面，一些人DEGS下调，这似乎是对细胞壁增厚和木质素的积累产生负面影响。例如，苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）是生物合成苯丙，其滋生各种重要的次级代谢物的前体，主要包括黄酮醇苷和木质素中的第一关键酶。在我们的研究中，gydF4y2BaPAL2gydF4y2Ba（gydF4y2BaGh_D06G0758gydF4y2Ba)明显下调。我们推断,gydF4y2Ba朋友gydF4y2Ba转录是由特定的生物合成中间体反馈调节的[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，这意味着。的表达gydF4y2Ba朋友gydF4y2Ba可能与木质素积累并不总是正相关。虽然许多细胞壁蛋白的作用已经得到了广泛的研究，但对组分间相互作用的认识还很缺乏。因此，我们推测gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba参与棉花侵染细胞壁聚合物网络内的复杂相互作用gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．gydF4y2Ba

HyPRP1通过增强ROS的积累来防御黄萎病菌gydF4y2Ba

活性氧在植物与叶面病原菌相互作用中的作用已被广泛研究。关于根防御反应中ROS的合成和功能，我们所知甚少，但在植物感知到病原体后，ROS一直在植物中积累[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．在黄萎病-棉花互作过程中，棉黄萎病菌的产生gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在棉根中观察到gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba［gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．此外，转基因番茄植株表达gydF4y2BavegydF4y2Ba抗性基因积累ħgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba感染 [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］．同样，表达真菌内几丁质酶基因的转基因棉花植株在接种病原菌后比对照植株更具有抗性，积累ROS的速度也更快[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．这些结果表明，感染了棉厂gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba伴随ROS积累增加。在我们的学习中，沉默gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba显着增强在根尖ROS积累（图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.因此，我们合理地推断棉花负调节gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在转录过程中生成ROS用于防御黄斑病菌。活性氧在棉花抗黄萎病中的作用有待进一步研究。然而，我们认为ROS有三种可能的功能:(i) ROS是主要的免疫信号分子[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba];（ii）ROS介导细胞壁改性[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba];及（iii）ROS是发挥国防有关的蛋白质翻译后修饰[作用重要调节gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

基于我们在植物抗黄萎病方面的研究和现有进展，我们提出了一个模型gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba棉花防御gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．之上gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba棉花的攻击、识别导致免疫反应的激活，包括产生特定的信号组合，如SA和JA，这已被证明参与了植物-gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba相互作用 [gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．表达gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba是最可能的，主要由SA信号下调。HyPRP1的显著减少可能会影响细胞壁聚合物网络，包括细胞壁厚度的增加和防止木质素含量的增加gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba感染。或者，下调gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba明显增强了活性氧的积累，介导了棉花对活性氧的防御反应gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba．gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

棉花种子gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba简历。Pima90-53,gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba简历。CCRI8和ND601在中国北方重点实验室进行保存河北农业大学中国教育部的作物种质资源，保定。对于转录分析gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba在不同的组织和反应gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba采用qPCR方法，在MS和Murashige (MS)培养基上培养2周龄棉花幼苗，接种gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba正如Zhang等人所描述的[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．在VIGS和激素处理试验中，种子在20% (gydF4y2BaVgydF4y2Ba/V) commercial bleach (the final concentration of sodium hypochlorite was approximately 1%) for 20 min followed by washing four times with distilled water. Seeds were soaked in distilled water for 2 days and then germinated on wet towels for another 2 days at 25 °C. Germinant seeds were transferred to pots containing commercially sterilized soil (a mixture of soil, peat, and composted pine bark) and covered with a plastic dome in a growth room at 25 °C under a 14-h light/10-h dark cycle. The答:芥gydF4y2Ba栽培条件为:22°C, 70%相对湿度，~ 150 μE mgydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}在9小时光周期下。gydF4y2Ba

诉dahliaegydF4y2Ba培养gydF4y2Ba

一种攻击性极强的落叶真菌gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba菌株临西2 - 1分离自河北省临西附近农田的一株陆地棉症状株，保存于河北农业大学华北作物种质资源教育部重点实验室。gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Bawas cultivated on potato dextrose agar (PDA) plates for 10 d and then inoculated into Czapek’s broth on a shaker at 150 rpm for 1 week at 25 °C in the dark. Spores were harvested by filtration through folded Fisherbrand™ lens paper and were resuspended in sterile distilled water to a specific density.

克隆gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba和gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba启动子区域gydF4y2Ba

GbHyPRP1gydF4y2Ba的全长cDNA文库gydF4y2Bag .取得gydF4y2BaPima90-53 [gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．的全长cDNAgydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba从其他陆地棉栽培品种，通过基于同源性的克隆而获得。进行了基因组步移法扩增其5'侧翼（启动子），根据制造商的说明书，使用基因组步移试剂盒（Takara，大连，中国）区。设计了已知的基础上嵌套序列特异性引物gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba基因序列和较短的任意简并引物经化学合成或由试剂盒提供。HyPRP1蛋白序列通过NCBI Web BLAST (gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.govgydF4y2Ba/）使用Clustal W程序对齐（gydF4y2Bahttp://www.clustal.orggydF4y2Ba/）。使用软件程序PlantCare和地点来分析启动子序列以定义推定gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-转录因子的元素或结合位点[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

qPCR和半rt -qPCR分析gydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用Trizol®试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取总RNA。在所有实验中至少三次施加在三个合并根，茎或叶样品上的每种处理。使用Nanodrop™1000分光光度术（Thermo Fisher Scientific）量化RNA。随后，使用具有GDNA橡皮擦的Primescript TM RT试剂盒（Takara，Dian，China），从1μg总RNA合成第一链cDNA。使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和Sybr®Green试剂（Takara，大连，中国）进行QPCR作为报告染料。使用CFX Manager™软件（Bio-Rad，Hercules，CA）收集数据。靶基因相对表达使用gydF4y2BaPP2A1gydF4y2Ba（蛋白磷酸酶2a的催化亚基）[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．对于半rt - qpcr，反应步骤为95°C变性5 min，然后94°C变性1 min, 55°C变性30 s, 72°C变性1 min，最后在72°C延伸10 min，共25个循环。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。gydF4y2Ba

瞬时表达融合蛋白的亚细胞定位分析gydF4y2Ba

对于亚细胞定位研究中，gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba采用PCR扩增ORF。将得到的产物插入到载体pDONR™207中。随后将片段重组到目的载体pK7WGF2中[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba使用L / R-Clonase]。该结构通过测序验证并转移到gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaGV3101菌株的冻融试验[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．烟草叶表皮细胞的瞬时转化过程如下[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．荧光蛋白的定位是使用共聚焦激光扫描显微镜（;奥林巴斯Fluoview共FV1000）浸润后3天监测。携带花椰菜花叶病毒35S-GFP驱动一个的pCAMBIA衍生物（pCamE）用作对照[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

激素治疗gydF4y2Ba

2子叶期棉花苗喷施100 μM SA、ABA、JA或ET，用塑料袋覆盖，保持100%的湿度。取6、12、24、36和48 hps激素处理植株的子叶组织，立即在液氮中冷冻，然后在−80℃保存至RNA提取。对照苗用蒸馏水喷洒。gydF4y2Ba

转基因拟南芥株系的产生gydF4y2Ba

的编码序列gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba被放大gydF4y2Bag .取得gydF4y2BaPima90-53 cDNA和克隆入pBI121载体。基因组gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba扩增上游片段，克隆到含有-glucuronidase (GUS)基因编码序列的pBI121载体中，经酶切切除35S启动子区域gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba我和gydF4y2BaBamgydF4y2BaHI限制性内切酶的序列被取代gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba上游片段。重组质粒转化成gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba哥伦比亚野生型(WT)植株通过gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba菌株gv3101介导的花浸法植物转化[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．在含50 μg ml的½MS培养基中选择原代转化子gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}卡那霉素。纯合植物利用基因特异性引物分离。半RT-qPCR的随后的cDNA上从过表达株系进行使用全长确认转录的状态gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba引物。表达相对于肌动蛋白的表达。T3转基因gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba植物携带gydF4y2BaGbHyPRP1gydF4y2Ba启动子用于GUS染色的组织化学分析，如[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

棉花的VIGS测定gydF4y2Ba

来自清华大学(中国)Yule Liu研究小组的pTRV1和pTRV2被用于VIGS分析[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba扩增片段(364 bp)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S1)，插入pTRV2载体，生成pTRV-HyPRP1衍生物，转化为gydF4y2Ba农gydF4y2Ba菌株GV3101。一个gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba介导的VIGS在棉花测定如先前所述进行[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．棉花种子具有两个完全展开的子叶。在这个阶段，真正的叶子还没有出现。以alterados cloroplasos 1基因(cloroplasos alterados 1)为标记检测沉默效率。这些幼苗被注射了gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba以含有pTRV1和pTRV2(空载体)的培养物作为对照。每次重复使用30多株植物，VIGS检测至少重复3次。gydF4y2Ba

对24日龄的棉花幼苗进行试验gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba用根浸渍在孢子悬浮液中接种(10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba孢子毫升gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba})放置2分钟，然后放回原来的花盆。见面gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物感染了gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Ba用10ml分生孢子悬浮液(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba孢子毫升gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba})(80毫升)。对照植物以同样的方式接种蒸馏水。棉花和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba症状和疾病指数（DI）为15 dpi的进行评分。的DI如先前所述基于五个等级的疾病，计算[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．每个处理35株，每个处理重复3次。植物抗gydF4y2Ba诉dahliaegydF4y2Bawas determined based on the DI, where > 35 = susceptible, 20 to 35 = tolerant, and 10 to 20 = resistant (National Standards of the People’s Republic of China GBT 22101.5–2009, Technical Specification for Evaluating Resistance of Cotton to Disease and Insect Pests - Part 5: Verticillium wilt).

引物gydF4y2Ba

本文中使用的所有引物都列在附加文件中gydF4y2Ba5gydF4y2BaS1:表。gydF4y2Ba

RNA-Seq文库构建及转录组测序数据分析gydF4y2Ba

两套独立的控制和gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba-沉默的植物被取样产生两个生物复制品。对于每个样本，我们以12 hpi采集至少6株植物的第一批真叶，并将其汇集起来，以尽量减少植物间的变异。然后，按照制造商的说明，使用TRIzol®试剂提取总RNA，然后使用DNase I (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)去除基因组DNA。使用纳米光度计®分光光度计(IMPLEN, CA, USA)检测RNA纯度，使用Qubit®RNA检测试剂盒(Life Technologies, CA, USA)在Qubit®2.0荧光仪中测量浓度。使用Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, CA, USA)的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性。使用Illumina HiSeqTM 2000测序仪(Illumina, San Diego, CA, USA)进行转录组测序。gydF4y2Ba

按照前面描述的协议进行序列标签预处理[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．末端配对清洁读取进行比对的参考基因组gydF4y2Bag .分子gydF4y2Bal . acc。TM-1 (gydF4y2Bahttps://www.cottongen.orggydF4y2Ba/)使用Bowtie v2.0.6和TopHat v2.0.9。差异表达分析gydF4y2BaHyPRP1gydF4y2Ba使用DESeq R软件包(1.10.1)进行-沉默和非沉默(模拟)组(每组2个生物重复)。由此产生的gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值使用Benjamini和Hochberg的方法进行调整，以控制错误发现率。基因的调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba < 0.05 according to DESeq were assigned as differentially expressed.

细胞壁检查gydF4y2Ba

茎切成1毫米的小块gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)和固定在2.5% (wt/vol)戊二醛0.1 M磷酸盐缓冲液，后固定在1%四氧化锇，然后嵌入Spurr树脂。使用Leica UC6 (Leica, Illinois, USA)制备的半薄切片(1 μm)，用1%甲苯胺蓝水溶液进行热染色。图像是用数码相机(尼康数码视觉DS-L1，日本)与奥林巴斯BX51显微镜(日本东京)连接拍摄的。使用Leica ultrtracut R超微切片机(Leica, Illinois, USA)制备的超薄切片(70 nm厚)，用醋酸铀酯和柠檬酸铅染色，并在JEM-1230电子显微镜(jol Ltd.， Tokyo, Japan)下检查。每个样品测量大约60个细胞，以确定细胞壁的厚度。gydF4y2Ba

木质素的提取与定量gydF4y2Ba

分别在0、7和14 dpi处采集hyprp1沉默株和对照株的茎干样本gydF4y2Ba．gydF4y2Ba在不同的时间间隔内，每株采集3个样品;样品立即在液氮中粉碎并冷冻干燥。细胞壁木质素的提取和定量依据Schenk et al.， 2014 [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

使用组织化学和自发荧光在细胞壁木质素沉积辨识的gydF4y2Ba

从棉花幼苗的茎(距茎基部5 cm处)采集标准的横切手切片。利用BX51显微镜在紫外激发和亮场模式下成像木质素的自荧光。gydF4y2Ba

活性氧积累的生物学分析gydF4y2Ba

由于ROS包括各种形式的还原和化学活性分子，如过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和超氧阴离子(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)，我们使用NBT和DAB染料，以及ROS活性荧光探针DCFH-DA来检测ROS的积累。黄色，水溶性NBT可被OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba蓝色，水不溶性甲卓。在H存在下，DAB在过氧化物酶活性位点聚合到红棕色聚合物中gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．荧光 - 自由DCFH-DA可以穿过细胞膜和，水解后，通过ROS被氧化以形成高荧光DCF [gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．ROS (HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，用5 μM DCFH-DA(二氯荧光素二乙酸酯;在37°C或含有2.5 mM DAB(3,3 ' -二氨基联苯胺)的10 mM k -柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中浸泡12 h，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．ROS (OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba完整的根在含有0.5 mM NBT(硝基四唑蓝氯化物)的10 mM k -柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中37°C孵育30分钟也可以观察其产生。采用奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜，激发波长488 nm分析DCF荧光。DAB和NBT染色时，将根在95%乙醇中煮沸10分钟，然后用50%乙醇漂洗2次，然后在光镜下(BX51;奥林巴斯，东京，日本)使用数码相机(DP71;奥林巴斯，东京，日本)和Image-Pro®Plus 6.0软件(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)。使用ImageJ软件1.48版本(美国国家心理健康研究所，Bethesda, MD)对荧光和着色强度进行量化。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有实验至少重复三次，每次确定。数据的统计分析，用GraphPad PRISM？6（图垫，圣地亚哥，CA，USA）的软件进行。这gydF4y2BaPgydF4y2Ba-值小于0.05被认为有统计学意义。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

CLA1:gydF4y2Ba

Cloroplastos alterados 1gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

迪:gydF4y2Ba

病情指数gydF4y2Ba

等:gydF4y2Ba

乙烯gydF4y2Ba

格斯:gydF4y2Ba

beta-glucuronidasegydF4y2Ba

HyPRP:gydF4y2Ba

混合脯氨酸蛋白gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

PDA:gydF4y2Ba

马铃薯葡萄糖琼脂gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

反应性氧气gydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

中收取:gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默gydF4y2Ba

WT：gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

所有作者都感谢实验室成员的帮助、建议和讨论。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由国家自然科学基金项目(No. 31301370)、中国农业科研体系基金项目(No. CARS18-08)和河北省科技支撑计划项目(No. 16226307D)资助。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

目前研究中分析的所有序列reads已保存在NCBI Genbank数据集(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbankgydF4y2Ba）下的SRA加入PRJNA490422。目前的研究过程中产生的或分析的其他数据包括从合理要求通讯作者发表该文章及其补充数据文件和可用英寸gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 河北农业大学华北作物种质资源教育部重点实验室，河北保定071001gydF4y2Ba

   杨军，张艳，王兴芬，王维桥，李志坤，吴金华，王国宁，吴立强，张桂银，马志英gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YJ和MZY设计了实验。YJ进行了研究并撰写了手稿。ZY、WXF、WWQ和WGN进行了实验。LZK、WJH、WLQ、ZGY进行了数据分析。所有的作者讨论了结果并审查了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba判断马gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

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