豆科植物属的系统发育框架Aeschynomene对依赖nod和不依赖nod的共生生物进行比较遗传分析

背景

豆科植物属的半水生物种Aeschynomene，有些具有通过光合作用结瘤的性质Bradyrhizobium缺乏nodABCNod因子合成所必需的基因。关于这种不依赖于nod的共生关系的特性的知识已经从豆科植物模型中获得Aeschynomene evenia但由于缺乏利用Nod因子依赖过程与相关类群进行遗传学比较，我们的认识仍然有限。为了填补这一空白，我们结合不同的方法对该属进行了全面的比较分析Aeschynomene．

结果

为了构建一个全面的系统发育，本研究显著扩大了以前的分类单元采样，包括亲缘属。在系统发育树中，绘制了5个主要谱系，包括一个新的谱系，nod独立分支和另一个包含多个多切分的分支Aeschynomene类群和所有相关属。该系统发育与染色体数目、基因组大小和低拷贝核基因序列的数据相匹配，揭示了二倍体物种和以多倍体类群为主的多切分。对于这些类群，推断出一个单一的异源多倍体起源，并确定了假定的亲本谱系。最后，结瘤试验用的不同Bradyrhizobium菌株揭示了新的结瘤行为，并比较了非结瘤分枝之外的二倍体物种的实验驯化性和遗传多样性。

结论

对不同谱系的遗传学和生物学的扩展知识揭示了该属的进化史Aeschynomene它们提供了一个坚实的框架，以有效地利用在Aeschynomene豆类。值得注意的是，我们的主干树包含了所有的二倍体物种，它阐明了不依赖nod的分支和依赖nod的谱系之间的遗传关系。这项研究使识别答:美国而且答:patula被认为是最适合进行nod不依赖和nod依赖共生的比较遗传研究的物种。

在固氮共生领域，科学家们对热带豆科植物属抱有长期的兴趣Aeschynomene自从有能力的物种被发现答:afraspera发育丰富的茎结节[1］．这种结瘤行为在豆科植物中是不常见的，在该属的极少数水生植物种中也是如此Discolobium，Neptunia而且田菁属但它在半水生动物中特别普遍Aeschynomene物种(2，3.，4］．这些stem-nodulatingAeschynomene物种能够相互作用Bradyrhizobium具有不同寻常光合特性的菌种[5，6］．然而，最突出的证据是，其中一些光合作用Bradyrhizobium菌株既缺乏nodABC合成关键的“结瘤因子”共生信号分子所需的基因，以及已知在其他根瘤菌中激活或调节结瘤的III型分泌系统(T3SS) [7，8，9］．这些特征表明，根瘤菌与豆科植物之间存在一种独立于Nod因子的替代共生过程。

在豆科植物属中落花生(花生),Aeschynomene使用细胞间共生感染过程，而不是在其他豆科植物群中发现的感染线形成[10］．这导致了一种建议，即不依赖nod的过程可能对应于根瘤菌共生的祖先状态，尽管不能排除它对应于与其他豆科植物中描述的相比的另一种共生相互作用[11，12，13］．值得注意的是，所有不依赖于nod的物种都形成了一个单系进化支Aeschynomene系统发育和联合它们在类菌分化过程中也显示出与其他类菌分化过程的显著差异Aeschynomene物种(4，14］．为了破译这种独特的共生关系的分子机制，不依赖nod答:evenia由于其遗传和发育特征(二倍体，合理的基因组大小-2n = 20,415 Mb/1C-，短的多年生和自交配，可杂交转化)使其具有分子遗传学的适应性[15，16，17］．功能分析显示，在其他豆科植物中发现的一些共生决定因子(SYMRK，CCaMK，HK1而且DNF1)，但几个关键基因涉及细菌识别(如。LYK3)、共生感染(例如:EPR3而且RPG)，以及结节功能(例如:DNF2而且FEN1)中没有表达答:evenia根和结节，基于RNAseq数据[14，18，19，20.］．这表明不依赖nod的共生关系不同于依赖nod的共生关系。

正向遗传学现在被期望能够识别特定的分子决定因素的节点无关的过程答:evenia［15，19］．此外，比较答:evenia与nod依赖密切相关Aeschynomene物种将促进我们理解不依赖nod的共生关系是如何进化的Aeschynomene．属Aeschynomene(现在仅限于这个部分Aeschynomene如在[4])，传统上由三个不fragenic分类群、亚属组成Aeschynomene(包括所有水生植物种)和亚属Bakerophyton而且Rueppellia［21，22］．该属也已被证明是para aphytic的，其中嵌套了若干相关属，但总的来说，它们在Dalbergieae部落中形成了一个不同的分支[4，23，24，25，26］．在这个广阔的支系中，有两组半水生生物Aeschynomene已经从遗传学和基因组学的角度得到了很好的研究答:evenia组，其中包含所有与nod无关的物种(其中大多数为2x)，以及答:afraspera类群(所有物种都依赖于nod)似乎有4倍的起源[27，28，29］．对于比较分析，使用具有二倍体结构的nod依赖物种将更合适，但这样Aeschynomene物种的记录很少。

为了克服这些限制，我们的目标是建立一个物种综合系统发育树，补充遗传和结瘤数据。为此，我们在这两个属中使用了广泛的分类单元采样Aeschynomene并在密切相关的属中捕获该属的全部物种多样性，并阐明分类单元之间的系统发育关系。对于大多数物种，我们还记录了染色体数量、基因组大小和低拷贝核基因的分子数据，从而可以识别二倍体物种，并解开多倍体类群的基因组结构。此外，这些物种的特点是他们的结节与各种Bradyrhizobium含有或缺乏的菌株点头最后，对二倍体种的性状进行了比较分析。根据本研究获得的数据，我们提出了两个互补的建议Aeschynomene物种设置了比较遗传系统与答:evenia模型。

Aeschynomene属及其近缘属的系统发育

为了深入了解属内的系统发育关系Aeschynomene亚属Aeschynomene我们通过添加新的种质资源，显著提高了以前的采样水平，如果这些种质资源无法获得，我们使用植物标本室标本。这种策略可以检查物种身份，并获得同一植物材料的互补数据。从41个物种中分离出40个物种的DNA(相比之下，[4])在分类学和遗传学研究中被列入这一组(附加文件1:表S1) [4，21，27，28，29］．此外，确定了该亚属与的系统发育关系Aeschynomene亚类Bakerophyton而且Rueppellia,不保密的Aeschynomene物种，以及与相关属Bryaspis，Cyclocarpa，Geissaspis，Humularia，Kotschya，Smithia而且Soemmeringia，我们还对这10个类群进行了采样(相比之下，[4)) (23，30.］．这为我们的总样本增加了21个物种(附加文件1:表S1)。dalbergioid种Pictetia angustifolia被用作外组[4，26］．

系统发育重建的所有类群样本进行了叶绿体的贝叶斯分析matK基因和核糖体它的单独处理的区域(附加文件2:表S2，附加文件3.:表S3)。的matK而且它的序列产生了贝叶斯树，几乎可以区分所有不同的序列Aeschynomene组和相关属(附加文件4:图S1;额外的文件5:图S2)。这两种系统发生树具有非常相似的拓扑结构，尽管其中一种树可以低支持一些分支。不一致也被观察到答:deamii还有属Bryaspis，但冲突的位置是低支撑，因此，他们被解释为缺乏解决方案，而不是硬不一致。为了提高主要世系之间的系统发育分辨率，研究人员采用了matK吉恩和它的序列数据集被合并到一个单一的系统发育分析中，其中只考虑支持良好的节点(后验概率(PP)≥0.5)(图。1)．我们的分析恢复了五个主要谱系的等级，其分支顺序得到了强有力的支持(PP≥0.92):(1)基本分支谱系包括答:美国(2) a答:montevidensis血统，血统答:evenia与nod独立分支相对应的谱系[15，27]，(4)一个新确定的谱系包含答:patula(5)由未解决的多切分所代表的谱系答:afraspera进化枝(19]和所有剩下的分类群。

我们的工作还提供了良好的物种水平的分辨率，它表明Aeschynomene亚属Aeschynomene(目前限定)是多系的，被点缀在系统发育树上的谱系包含答:patula的另外两个亚属Aeschynomene以及一些与之相关的其他属Aeschynomene(无花果。1) [4，24，26，31］．联合分析还对该属进行了分组Bryaspis与…有关的物种答:afraspera在一个高度支持的分支中，但它仍然不确定其确切的位置，如先前在a中观察到的trnL基于系统发育(图;1) [4］．最值得注意的是，几个类间关系一直被揭示，特别是在Cyclocarpa而且Smithia以及在演化枝中包含Aeschynomene亚类Bakerophyton而且Rueppellia和属一起Humularia(下文简称BRH演化支)(图;1)．这支支系支持先前对之间的形态连续体的观察Aeschynomene亚属Rueppellia还有属Humularia并对它们的分类学分离提出了质疑[22］．

多倍体谱系的种倍性水平和起源

修改后的Aeschynomene以系统发育为主干树，研究了不同物种的遗传状态和倍性水平的演化。之前的研究已经证明答:evenia进化枝大多是二倍体(2n = 2x = 20)，即使有些种如答:籼稻(2n = 4x = 40,2n = 6x = 60)似乎是最近的异源多倍体起源[27，29］．相反，所有的物种答:afraspera被发现为多倍体(2n = 4x = 28,38,40,2n = 8x = 56,76)，具有共同的AB基因组结构，但多倍体事件的起源仍未确定[28］．以评估倍性水平Aeschynomene分别测定了种和近属、染色体数和核DNA含量(见图2)。2a，附加文件1:表S1，附加文件6:图S3和附加文件7:图S4)。我们证明了血统包含答:美国，答:montevidensis，答:evenia而且答:patula，以及Soemmeringia semperflorens，为2n = 20的二倍体，最小的2x基因组为答:patula(0.58 pg/2C)和最大的2倍基因组答:deamii(1.93 pg / 2 c)。除了美国semperflorens，属于多切分的所有群体都具有较高的染色体数的特征。这些染色体数量大约相当于二倍体物种的两倍(除了2 = 28)，这表明相应的群体很可能是多倍体。假设多倍体物种的染色体数目偏离2n = 40，很可能是二倍体起源，已在描述答:afraspera进化枝(28］．在这里，重要的基因组大小变化范围为0.71 pg/2CGeissaspis4.82 pg/2C为4倍答:schimperi强调不同类群的基因组分化(图;2a，附加文件1:表S1)。

为了坚定地将染色体数量与倍性水平联系起来，并阐明不同谱系之间的遗传关系，我们克隆并测序了选定物种中的四个核编码低拷贝基因:CYP1(还有1),eiF1α(真核翻译起始因子α)，超对称性理论(蔗糖合成酶)和中,1(膜体内禀蛋白1;1)(补充文件2:表S2)。对于所有的二倍体物种，只获得了一个基因序列，而对于所有的多倍体物种，在几乎所有的情况下，都分离出一对假定的同源基因，从而证实了它们从核型数据推断的遗传状态(附加文件)3.:表S3)。一般来说，复制的拷贝高度分散，并嵌套在每个基因生成的贝叶斯系统发生树的两个不同的主要分支中(附加文件8:图S5)。一个分支包含所有的A拷贝(除了一个异常序列)b . lupulina在eiF1α树)和另一个分支收集了之前在答:afraspera［28］．这两个支系A和B并不总是得到很高的支持，但值得注意的是，A副本与A形成了一个单系群，或姐妹答:patula序列和类似的B复制或姐妹与美国semperflorens序列，在所有基因树(附加文件8:图S5)。为了提高系统发育的分辨率，四个基因数据集被连接起来。这种组合产生了高度支持的贝叶斯树，将a拷贝支作为二倍体的姐妹答:patula(PP =1)， B拷贝支为二倍体姐妹支美国semperflorens(PP =1)2b).因此，这些系统发育分析与核型数据相结合，表明5个主要谱系均含有二倍体物种。他们还揭示了所有多倍体群体共享相同的AB基因组结构，与二倍体答:patula而且美国semperflorens物种是A和B基因组祖先供体的现代代表。

此外，还进行了祖先状态重建分析它的+matK系统发育表明二倍体是整个修正类群的祖先状态，四倍体很可能在多切分体中进化了一次(补充文件)9:图S6)。为了为同种异体多倍体事件可能的单一起源提供支持，进一步使用独立和串联的核基因树进行系统发育网络分析。在该分析中，两种非异体多倍体化假设(T1和T2)被发现比两种允许杂交的假设(N1-best和N2-best，分别为172和169)成本更高(附加文件)10:图S7a-d)。单异源多倍体化假说(N1-best)有力地表明杂交答:patula而且美国semperflorens产生了多倍体谱系，如上所述(图;2c、附加文件10:图S7c)。尽管两种异体多倍体假设(N2-best)获得了绝对最好的分数，但分数的改善非常低(169 vs 172)，由此产生的网络包括与一种异体多倍体假设推断的杂交，使得后一种假设最有可能是正确的(附加文件)10:图S7d)。

不同Aeschynomene系的结瘤特性

种Aeschynomene亚属Aeschynomene已知的主要是两栖和超过15个这样的水生物种(发现于答:evenia而且答:afraspera枝，以及答:fluminensis)被描述为具有发展茎结节的能力[3.，21，28，32］．在答:fluminensis，这些结节仅在淹没条件下观察到(在豆科植物中也可见到)Discolobium pulchellum)，而它们则出现在答:evenia而且答:afraspera演化支(无花果。3.) (4，33，34，35］．所研究的不同世系的表型分析显示，它们都沿茎显示不定根原基(图2)。3.a、b)。不定根被认为是对临时水浸的适应，它们也对应于茎结瘤的结瘤部位Aeschynomene物种(图。3.b) (35］．考虑到答:evenia而且答:afraspera现在证明了枝具有不同的基因组背景，为光合慢生根瘤菌茎结瘤的独立发展提供了遗传学论据。祖先文字重建的基础上它的+matK系统发育证实了整个类群的祖先是湿生态，并赋予不定根原基，但茎结瘤能力比先前推断的进化了几倍(补充文件)11:图S8;额外的文件12:图S9;额外的文件13:图S10) [4，28］．

为了研究新研究的物种是否可以被光合慢生根瘤菌结瘤，我们扩展了Chaintreuil等人的结果。[4]通过测试22种可用物种的结瘤能力(见图。4A)有足够的种子。三种不同的Bradyrhizobium相当于Alazard定义的三个交叉接种(CI)组[2DOA9(非光合作用BradyrhizobiumI族)，ORS285(光合作用Bradyrhizobium与点头i - II族基因)和ORS278(光合作用Bradyrhizobium缺乏点头用这些菌株接种22个种属，在21 dpi时分析其结瘤能力。为此，我们通过乙炔还原试验(ARA)和植株活力的观察，记录了结核的形成，并比较了固氮效率。在所有被测物种上观察到结瘤，除了美国sensitiva那有根发育的问题，因为答:montevidensis而且美国semperflorens．对于这三个物种，无论是培养条件还是Bradyrhizobium使用的菌株不合适(图;4一个)。

非光合作用菌株DOA9显示出广泛的寄主光谱，但无法使不依赖nod的物种结瘤，答:deamii，答:evenia而且答:tambacoundensis．光合菌株ORS285高效结瘤答:afraspera与nod无关Aeschynomene物种(图。4A)，如先前报导[4］．有趣的是，ORS285菌株也能诱导固氮结节答:patula可见无效结节答:fluminensis还有属Bryaspis，Cyclocarpa而且Smithia(无花果。4a).为了研究这些物种的结瘤过程是依赖于一个依赖于nod的共生过程，还是依赖于nod的共生过程，我们利用了∆的可用性点头ORS285突变株。均未发现ORS285∆结节点头这表明在这些物种中，结节的形成依赖于Nod信号(图2)。4a).事实上，ORS285∆点头发现突变株只能结瘤的种答:evenia与自然缺乏的光合菌株ORS278相似的分枝点头基因(无花果。4a).通过对重新审视的系统发育进行祖先状态重建，对这些结瘤能力的进化进行分析，表明与光合慢生根瘤菌相互作用的能力出现了几次，并独特地出现了被根瘤菌结瘤的能力点头先前观察到的基因缺失菌株(附加文件14:图S11;额外的文件15:图S12) [4］．最后，从这些结瘤试验中，二倍体出现了不同的结瘤模式Aeschynomene物种(详见图。4b-d)， DOA9和ORS278菌株分别特异性于nod依赖组和nod不依赖组，ORS285在两者之间表现出一定程度的相容性。

不依赖支系以外的二倍体物种的多样性

为了进一步描述不依赖nod进化支的二倍体物种，其中答:evenia依赖，他们的发育特性和遗传多样性进行了分析(图。5a).所有物种都被描述为一年生或短多年生[21，30.，31］．而答:美国，答:摘要，答:fluminensis，答:parviflora而且答:montevidensis强壮而直立，成熟时可达2米高答:evenia，答:patula而且美国semperflorens是匍匐或匍匐的草本植物。这些植物习性的差异反映在这两组之间种子大小的重要差异上(图2)。5a).这对植物操作有影响，因为答:patula而且美国semperflorens种子刻痕需要适应(浓硫酸25分钟，而其他物种40分钟)，离体植物生长需要稍长的时间才能使根系充分发育以供接种Bradyrhizobium菌株(发芽后10天，而不是其他品种的5-7 dpi) [15］．观察到一致的开花和制种答:美国，答:摘要，答:patula而且美国semperflorens当在充分的环境光下生长在热带温室在短日照条件下，如前所述答:evenia，使得通过连续自交形成自交系成为可能。5) (15］．为答:fluminensis，答:parviflora而且答:montevidensis，开花稀疏或未观察到开花，表明未满足控制结实率的有利条件(图。5一个)。

五个品种(答:摘要，答:fluminensis，答:parviflora，答:montevidensis而且年代．semperflorens)是严格意义上的美国人答:美国是泛热带物种答:patula是马达加斯加特有的[21，31，32］．一些物种的地理分布很窄或似乎不常见，这解释了在种子库中可获得的数量非常有限(图2)。5) (21，31，32］．这与两者形成了鲜明的对比答:美国而且答:摘要它们被广泛收集，作为杂草植物被广泛发现，有时被用作牛的牧草(图2)。5) (36］．为评估这两个种的遗传多样性，对79份种质资源进行了收集答:美国16人入选答:摘要，并使用跨越它们的已知分布(附加文件16:表S4)。基因分型-测序(GBS)方法获得了6370和1488个高质量多态性SNP标记答:美国而且答:摘要分别登记入册。这两个SNP数据集随后用于基于多维尺度(MSD)方法的聚类分析。MSD的分析区分了三个主要的组别答:美国而且答:摘要沿坐标轴1和2(图;5b).在绘制全球范围内的资源图谱时，三个组确定为答:摘要在墨西哥共同观察到，只有组(3)延伸到南美洲北部(图3)。5c、附加文件16:表S4)。相反，观察到一个明确的地理划分答:美国第(1)类群分布在南美洲中部，第(2)类群分布在南美洲上部，而第(3)类群分布在从墨西哥到巴西的不同地区以及所有古热带地区(图2)。5c、附加文件16:表S4)。答:美国被假设为美洲原住民，并归化到其他地方[36］．观察到的分布，结合在MSD分析中，与组(1)和组(2)相比，组(3)紧密聚集在组(3)这一事实，支持这一观点，并表明其组(3)最近在全球范围内传播。

豆科植物Aeschynomene属的系统发育框架

我们对该属进行了一个新的、全面的系统发育Aeschynomene及其密切相关的属补充基因数据集，基因组大小，核型和结瘤试验。对于植物属，它们很少有分类多样性的文献是广泛的，并有一个良好解决的，有力支持的系统发育，以揭示这些类群的进化史[37］．在这里，整个类群，包括属Aeschynomene包括nod不依赖支系在内的5个主要谱系，在所有谱系中均可发现二倍体种。多基因数据分析提供了强有力的证据，其中两个以两个二倍体物种为代表答:patula而且美国semperflorens，参与了一个古老的异体四倍化过程，该过程导致不同的多倍体谱系聚集在一个多切分中。来自同一二倍体亲本或单一异源多倍体的独立异源多倍体事件是这些世系形成的合理解释。然而，结合基因数据得到的系统发育树的一致分辨率，其中答:patula而且美国semperflorens是A和B亚基因组序列的姐妹，支持单一异源多倍体起源的假设，这也为其他古代植物的异源多倍体事件所争论Asimitellaria(Saxifragaceae)和银合欢(豆科)[37，38］．系统发育网络分析也支持单异源多倍体化假说。然而，额外的核基因将需要最终确认没有额外的杂交事件发生。虽然不是目前研究的重点，但值得注意的是，大多数二倍体物种都在新热带地区被发现，导致4倍谱系的A和B基因组捐赠者的两个现代代表位于不同的大陆(美国semperflorens在南美洲答:patula在马达加斯加)，而且所有的4x谱系都位于古热带地区[30.］．这就提出了关于整个群体的进化和4倍血统起源的问题。此外，多切分体的存在表明，这一异源多倍体事件先于被归因于不同的4x群体的快速和主要多样化Aeschynomene亚属或完全不同的属，合计占整个类群总种的80%以上[26，39］．同种异体多倍体的分化在该属中反复发生Aeschynomene由于在这两种植物中都发现了几个新的多倍体物种答:evenia进化枝和答:afraspera演化支以…为例答:籼稻(4x, 6x)和答:afraspera(8 x) [27，28］．数个密集抽样Aeschynomene分类单元或分支还可以更精确地划定物种边界(对于形态相似但遗传分化或对应于不同的细胞类型的分类单元)，并证明种内遗传多样性通常是基于地理的，如泛热带物种所示答:美国(本研究),答:evenia，答:籼稻而且答:sensitiva［29］．所有这些Aeschynomene茎上有与结瘤感染部位相对应的不定根原基。在整个类群的所有类群中始终存在不定根原基和祖先状态重建，证实了先前提出的茎结瘤进化的两步模型Aeschynomene在整个类群的基部具有共同的遗传倾向，在茎上产生不定根原基，作为对洪水的适应，随后在各个支系中独立发生的突变使茎结瘤[4］．与水生环境中存在的光合慢生根瘤菌相互作用的能力似乎也进化了至少3倍[4，这项工作，图。4］．这种光合活性对细菌共生生活方式很重要，因为它为感染提供了可用的能量，随后为茎结节内的固氮酶活性提供了能量[5］．迄今为止，仅报道过光合慢生根瘤菌自然发生结瘤的情况答:evenia而且答:afraspera枝，为答:fluminensis［6，34，40］．然而，我们不能测试分离的光合菌株答:fluminensis结节和新研究种中存在的菌株的性质答:patula还没有被调查。它们将允许将其结瘤效率与参考光合作用进行比较BradyrhizobiumORS278和ORS285菌株。此外，我们可以问是否半水生生活方式和/或与光合慢生根瘤菌的结瘤可能促进了植物中不依赖结瘤共生的出现答:evenia进化枝。

用于结瘤的Aeschynomene种的比较分析答:evenia

目的:揭示植物根和根瘤转录组数据中几种关键共生基因的缺失答:evenia是由于基因丢失或失活，为了确定不依赖于nod的共生的特定共生决定因素，目前正在进行基因组测序结合诱变方法答:evenia在我们的实验室。与nod依赖的比较分析Aeschynomene物种有望巩固这一基因组和遗传分析进行答:evenia通过有助于阐明使nod独立过程出现的遗传变化。系统基因组学和比较转录组学，再加上功能分析，在共生研究中正在不断发展，以揭示与共生缺乏发展有关的基因损失，同时也鉴定新的共生基因(对于丛枝菌根共生[41，42];对于结瘤共生[43，44])。然而，关于共生植物的比较工作经常受到阻碍，原因要么是缺乏表现出获得或丧失共生功能的密切相关物种，要么是缺乏被充分理解的遗传框架，如[10，43，45，46］．事实上，这样的情况很少，但在这种情况下发生了结瘤Parasponia/ non-nodulatingTrema系统中，精细的比较分析非常有力地证明了关键共生基因的平行损失NFP2，外祖母而且以序列,在不结瘤的物种中，挑战了长期以来的假设Parasponia特别获得了结瘤的潜力[45，46，47］．在这方面，揭示了该属的遗传进化Aeschynomene和相关属，以及在不依赖nod进化支之外的二倍体物种的鉴定，提供了一个强大的系统发育框架，现在可以用来指导选择依赖nod的二倍体物种进行比较遗传研究。其中，有些品种由于缺乏结瘤参照等重大不便而被丢弃Bradyrhizobium菌株或在温室条件下无法产生种子。基于高效结瘤、短开花时间和易于制种，答:美国(2n = 20,600 Mb)和答:patula(2n = 20,270 Mb)似乎是最有希望发展一个比较遗传系统的nod依赖二倍体物种答:evenia(2n = 20,400 Mb)。相比之下答:evenia，答:美国仅由非光合作用的缓生根瘤菌结瘤，在这方面，它的行为类似于其他豆科植物。本种广泛分布在热带地区，数百种质资源是可用的，它已经受到研究研究，特别是分离它的结节Bradyrhizobium其中DOA9菌株[48，49］．作为答:美国属于最基本的世系Aeschynomene系统发育，它可能是在属中发现的祖先共生机制的代表。另一方面，答:patula它在马达加斯加的分布有限，只有一个可获得的增补，但它在植物大小和基因组大小上都相对较小(实际上是该组中最小的二倍体基因组)，使其成为世界上最大的“拟南芥”Aeschynomene．就像答:美国，本种被非光合慢生根瘤菌有效结瘤，但也与光合作用相容点头含基因的ORS285株。这一特性使这个物种特别有趣，因为它允许直接比较之间的机制和途径答:evenia而且答:patula没有潜在的菌株对共生反应的影响。此外，在考虑的时候Aeschynomene发展史,答:patula更接近于答:evenia比答:美国，因此阐明将依赖于nod的进程转换为独立于nod的进程或反之亦然所必需的更改可能更合适。

在本研究中，我们建立了一个全面和健全的分子系统发育属Aeschynomene以及相关属，用分子、基因组和结瘤数据进行记录，以揭示整个类群的进化史。这一系统发育框架为有效利用植物的遗传和结瘤多样性提供了支持Aeschynomene豆类。在本研究中，它指导的选择答:美国而且答:patula，认为这两种二倍体物种最适合与nod不依赖的物种建立相对的遗传系统答:evenia模型。开发序列资源和功能工具答:美国和/或答:patula现在有必要建立一个完全可行的比较吗Aeschynomene系统。从长远来看，处理这样的遗传系统将有助于理解光合作用Bradyrhizobium和一些Aeschynomene物种共同进化，并揭示了不依赖nod的共生的分子机制。

植物材料

所有的加入Aeschynomene在本研究中使用，包括他们的地理来源和收集数据列在附加文件1:表S1和附加文件16:表S4。如Arrighi等所示，在温室中进行种子萌发和植物栽培。[15］．在温室中直接观察到不定根原基和茎结节等表型性状。

有节测试

结瘤试验使用Bradyrhizobium菌株ORS278(最初从答:sensitiva结节)，ORS285(最初从答:afraspera结节),ORS285∆点头和DOA9(最初从答:美国结节)[7，49，50］．Bradyrhizobium菌株在34°C的酵母甘露醇(YM)液体培养基中培养7天，必要时补充抗生素[51］．如Arrighi等所述，在充满缓冲结瘤培养基(BNM)的试管中进行植物离体培养。[15］．5天大的植株接种1 mL细菌培养物，调整OD为600 nm至1。接种21天后，对6株植物进行根瘤分析。通过测量乙炔还原活性(ARA)来估计整个植物的固氮活性，并使用Bonaldi等人发表的立体宏观显微镜(Nikon AZ100，法国尚比尼-马恩河)进行微观观察。[50］．

分子的方法

采用经典的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取法从新鲜植物中分离出基因组DNA。对于植物标本室材料，通过增加孵育(90 min)、离心(20 min)和沉淀(15 min)步骤来适应该方法。核糖体内部转录间隔区，即叶绿体matK基因及四个低拷贝核基因(CYP1，eiF1α，超对称性理论,中,1)答:evenia而且答:afraspera转录组用于系统发育分析[27，28］．如Arrighi等人所述，对基因进行pcr扩增、克隆和测序。[27](附加文件2:表S2)。对于从植物标本室标本中提取的基因组DNA，开发了一组引物来扩增短至250 bp的重叠片段中的不同基因2:表S2)。本研究中生成的DNA序列保存在GenBank(附加文件)中3.:表S3)。

系统发育分析和性状定位

序列用MAFFT比对(−-localpair -maxiterate 1000;［52])。使用Phylobayes 4.1b方法，对每个基因以及连接的数据集进行系统发育重建[53]和站点异质CAT+F81 + Γ4演化模型。对于每个分析，两个独立的链运行10,000个Phylobayes循环，并进行50%的老化。祖先状态重建是通过使用Phytools R包进行随机字符映射[54为每个角色进行10次模拟。

物种网络和杂交

为了测试将四个低拷贝核基因串联得到的系统发育(CYP1，eiF1α，超对称性理论,中,1)最有可能是由基因重复之后的差异损失或由重复的组合，损失加上一个或几个异体多倍体事件涉及答:patula而且Soemmeringia semperflorens，采用[55]被使用。简而言之，这种方法通过比较系统发育网络和一个或几个基因树来计算和解分数。该方法允许异源多倍体事件发生在杂交节点上，而网络的所有其他节点都与物种形成事件相关;同时，在基因树的所有节点上允许复制和丢失事件的代价(这里，任意固定为1)。

因此，4个核基因树被用来评分不同的系统发育网络对应4个不同的潜在进化历史。用A组(T1)或B组(T2)获得的两种拓扑结构对应的两个无网格的替代网络用于评估无异源多倍体化假设。产生最佳分数(T2)的拓扑用于生成和比较具有一个或两个杂交节点的所有系统发育网络，涉及答:patula和/或美国semperflorens，依次测试一个异源多倍体(N1-best)和两个异源多倍体进化(N2-best)。

GBS分析

基于描述的协议构建了一个GBS库[56］．对于每个样本，使用双酶系统PstI(稀有切刀)和Mse(普通切刀)消化150 ng基因组DNA (New England Biolabs, Hitchin, UK)，在37°C下孵育2小时。使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs, Hitchin, UK)在22°C下进行连接反应30分钟，连接酶在65°C下灭活30分钟。使用Illumina Primer 1(带有PstI悬垂的条形码适配器)和Illumina Primer 2(普通y适配器)对结扎的样本进行聚合和pcr扩增。该文库在Illumina HiSeq 3000 (1 × 150 pb)上测序(在法国图卢兹的Get-PlaGe平台上)。

原始序列数据的处理方法与[中描述的研究相同。57］．从原始Illumina读取的SNP调用是使用自定义的python管道VcfHunter执行的https://github.com/SouthGreenPlatform/VcfHunter/(纪尧姆·马丁，CIRAD，法国)。对于所有样本，这些序列标记对齐到答:evenia1.0参考基因组(JF Arrighi，未发表数据)。所有样本的SNP结果被转换为VCF格式的一个大文件，随后使用基于web的应用程序SNiPlay3分析多态性数据[58］．首先，对每个物种的SNP数据进行单独处理，并使用集成的vcftool过滤掉缺失数据超过10%的SNP以及等位基因频率(MAF)为0.01的SNP。其次，利用SNiPlay3中实现的PLINK软件获得物种多样性结构的整体表示。该软件基于多维尺度法(MSD)生成二维图。

基因组大小估计和染色体计数

如Arrighi等人所述，利用叶片材料用流式细胞仪测量基因组大小。[15］．基因组大小的估计是由每次添加的3株植物的测量得出的Lycopersicum esculentum以(茄科)cv“Roma”(2C = 1.99 pg)为内标。计算1C值，用换算因子1 pg DNA = 978 Mb表示，单位为Mb/1C。为了计算染色体数量，从根尖制备了变染色体，铺在载玻片上，用4′，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，并使用荧光显微镜捕获其图像，如Arrighi等人所述。[15]。

ARA:

乙炔还原法

BNM:

缓冲结瘤培养基

BRH:

进化枝包含Aeschynomene亚类Bakerophyton而且Rueppellia和属一起Humularia

置信区间:

Cross-inoculation

DAPI:

4, 6-diamidino-2-phenylindole

dpi:

Days-post-germination

GBS:

Genotyping-by-sequencing

默沙东公司:

多维标度

页:

后验概率

SNP:

单核苷酸多态性

T3SS:

III型分泌系统

YM:

酵母中

我们感谢不同的种子银行和植物标本馆提供本研究中使用的种子和植物标本馆券。目前的工作得益于Imagerie-Gif (http://www.i2bc.paris-saclay.fr/spip.php?article279)，以及AGAP实验室的分子细胞遗传学设施(http://umr-agap.cirad.fr/en/plateformes/plateau-de-cytogenetique-moleculaire)．

资金

这项工作得到了法国国家研究机构(ANR-AeschyNod-14-CE19-0005-01)的资助，用于研究设计、实验和数据分析。

数据和材料的可用性

本研究生成的基因序列保存在GenBank中(登录号见表S3)。Illumina HiSeq 3000测序原始数据可在NCBI SRA (Sequence Read Archive)中获得，该研究的登录号为SRP149516。所有额外的数据都包括在这篇发表的文章作为补充信息文件。

作者指出

1. Laurent Brottier和Clémence Chaintreuil对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. IRD，热带共生实验室等Méditerranéennes, UMR LSTM, Baillarguet国际校区，34398，蒙彼利埃，法国

   Laurent Brottier, Clémence Chaintreuil, Joël Fardoux, Robin Duponnois, Eric Giraud和Jean-François Arrighi

2. 进化科学研究所(ISE-M)， Université de Montpellier, CNRS, IRD, EPHE, 34095 Cedex 5，蒙彼利埃，法国

   保罗·西米恩& Céline斯科纳瓦卡

3. CIRAD (Coopération国际农学研究中心Développement)， UMR AGAP, F-34398，蒙彼利埃，法国

   Ronan rivaran, Pierre Mournet, Catherine Hervouet & Angélique D 'Hont

4. AGAP，蒙彼利埃大学，CIRAD, INRA，蒙彼利埃SupAgro, 34060，蒙彼利埃，法国

   Ronan rivaran, Pierre Mournet, Catherine Hervouet & Angélique D 'Hont

5. IRD，植物与微生物环境相互作用，UMR IPME, 34394，蒙彼利埃，法国

   莱昂内尔冰川锅穴

6. 比较植物和真菌生物学系，皇家植物园，邱园，里士满，萨里，TW9 3AB，英国

   Gwilym P. Lewis

7. 细胞整合生物学研究所(I2BC)， CEA, CNRS，南巴黎大学，Université Paris-Saclay, 91198, Gif-sur-Yvette，法国

   斯宾塞·c·布朗，马里奥·戈麦斯-帕切科& Mickaël Bourges

8. 非洲黑色基础研究所植物实验室，迪奥普，BP, 206，达喀尔，Sénégal

   马修Gueye

9. 环境微生物学实验室/国家环境研究中心，马达加斯加塔那那利佛101

   Heriniaina Ramanankierana & Herizo Randriambanona

10. IAC，植物园和生态学实验室Végétale Appliquée, UMR高德地图，98825,Pouembout, Nouvelle-Calédonie，法国

    Herve Vandrot

11. IIBCE生物化学和微生物基因组系，乌拉圭蒙得维的亚11600

    玛丽亚·萨巴莱塔

12. 加尔各答大学生物化学系，印度加尔各答，700019

    Maitrayee DasGupta

贡献

JFA设计了实验。LB、CC、RR、JF、SCB、MGP、MB、CH、MD、JFA进行了实验并获得了数据。PS、CS、LM进行系统发育分析。PM, JQ, GPL, AD 'H, EG和JFA分析了数据。MG、RD、HR1、HR2、HV和MZ对资源的获取和分析有贡献。JFA撰写了这篇论文。LB和CC的贡献相当。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到让中的．

伦理批准并同意参与

本研究中使用的资料来源在附加文件中注明1:表S1和附加文件16:表S4。

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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