比较转录组学鉴定了玫瑰的选择模式

背景

玫瑰是人类的重要植物，具有枢轴经济和生物学性状，如连续开花，花卉建筑，颜色和香味。由于频繁的杂交和高基因组杂合子，玫瑰和他们的亲属的分类仍然是一个很大的挑战。

结果

在此，为了识别蔷薇系统发育重建的潜在标记，揭示蔷薇的自然选择模式，我们生成了一套高质量和全面的参考转录组罗莎对《老脸红》(Old Blush, OB)和r . wichuriana'Basye's Thornless'（BT），两种物种表现出对比的高度经济性的特征。组装的参考转录om显示成绩调节N50以上BP。两朵玫瑰共用约10,073份转录物（N50 = 2282 bp），其中一套5959名转录物在属内被保守罗莎．进一步与蔷薇科物种进行比较，发现共有4447个转录本(蔷薇科-共有)罗莎，马鲁斯，李属，rub， 和草莓属，而164名成绩单的游泳池是针对玫瑰的特异性（罗莎特殊技能)。在蔷薇科常见转录本中，有409个转录本表现出阳性选择的特征，并在不同组织中呈聚集表达。有趣的是，这些快速进化的基因中有9个与DNA损伤修复和对环境刺激的反应有关，这可能与杂交后基因组冲突有关。与这种快速进化模式相一致的是，24个F-box和4个TMV抗性蛋白在玫瑰基因中显著富集罗莎特殊的基因。

结论

我们期望这些蔷薇科常见和罗莎特异性转录物应促进蔷薇科植物的系统发育分析以及研究罗莎特殊生物学。这里报告的数据可以提供基本的基因组工具和知识，对理解生物学和玫瑰的驯化和玫瑰育种至关重要。

了解木质植物适应局部环境条件的分子机制仍然是生物学仍然是由于他们的长期和多年生的生命史上的生物学挑战。然而，木质植物代表地球上的大部分生物多样性，涉及草本植物不具有特征的许多不同的酚类特征（https://www.worldwildlife.org)．其中一个特征就是玫瑰连续开花的行为，玫瑰是人类社会中具有高度重要性的重要作物。为了保证切花及相关产品的原料供应，连续开花成为玫瑰最重要的生物学和经济性状之一[1］．因此，持续调控花期的遗传控制和相关基因调控网络不仅是科学家们多年来的研究课题，也是育种家们多年来的研究课题[1，2］．调节连续开花的QTL数量仍然是争议的[1，2，3.］．RoKSN,拟南芥的同源物TFL1是唯一已知的负责持续开花的基因[4，5］．

耕种玫瑰的驯化主要涉及十几种物种中的杂交[2，6，7，8］．频繁的不同人物交叉/回复和玫瑰的多倍化已经使玫瑰的分类非常困难[9，10，11，12］．一套高质量和特色的基因组工具/资源是理解现代玫瑰的生物学和驯化所必需的，包括超过30,000种品种[13］．最近，已经开发了几个基因图谱群体(参见综述[1，2])，并进行玫瑰基因组的测定[14]序列最近发布了一倍的单倍体罗莎对'旧腮红'[15］．然而，由于种间杂交和多倍体化极有可能导致高水平的杂合度，要获得一个准确和完整的玫瑰基因组似乎并不容易。另外，还可以利用不同物种的多个组织构建一个全面的基因表达图谱。

利用含有350个四倍体的微阵列构建了第一套基因表达图谱r .矮牵牛) ［16]，其后约有4800个选定的无害环境技术(r对，r . wichuriana， 和r .矮牵牛) ［17］．一个更全面的数据库，包含大约80,714个抄本集群r对“Old Blush”是利用Illumina和454测序平台从13个不同发育阶段或不同非生物和生物胁迫下的组织/器官构建而成的[18］．一些最近的研究也对各种罗莎不同目的的物种[19，20.，21，22即使对于单核苷酸多态性(SNP)阵列[23，24］．尽管所有这些研究都促进了对玫瑰生物学的理解，但这些转录om的质量通常相对较差，低N50值，完整性差和平均长度短。最近，发表了一倍的单倍体的基因组序列r对“老脸红”为玫瑰研究树立了里程碑[15，25］．然而，缺少玫瑰的半基因组信息，其中大多数通常具有频繁的杂交杂交和多倍化引起的高杂合子，可能导致缺乏能力在理解与隐性标记相关的玫瑰族特征的遗传基础时[3.］．

为了鉴定支撑蔷薇特性的分子组成，并找到阐明蔷薇科系统发育关系的分子标记，我们为两个蔷薇种生成了一套高质量的参考转录组，其中至少有6对对比性状[3.[，通过在不同的发育阶段测序三个组织，并通过整合公开的数据集。我们鉴定了在Rosaceae植物中保守的约4447份转录物，其中405在显着的选择压力下，只有164个转录物仅在玫瑰中存在。

转录组测序和组装

利用高通量测序技术对茎叶和幼叶的RNA样本进行了分析。1和2)．这导致了4.218亿和4.275亿的干净读数罗莎对《老脸红》(Old Blush, OB)和r . wichuriana《巴斯耶的无刺》(Basye’s Thornless) (BT)，分别为1)．原始序列文件已上载至国家生物技术信息中心序列读取档案(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，注册号码为SAMN07808857-07808870。

然后我们生成了BT(68,612个转录本)和OB(74,975个转录本)的组装体，其中转录本N50约为2099/1732 bp (BT/OB)，平均长度约为1338/1170 bp (BT/OB)。这比之前公布的这两个物种的数据要好得多(见表)2额外的文件1:表S1，附加文件2：表S2;无花果。3.) (18，20.，26，27和其他物种/材料罗莎［19，21，22，28］．进一步结合OB的所有数据进行组装，得到了更好的转录本N50 (2092 bp)和平均长度(1359 bp)。将组装的OB转录本与包含45,469个编码基因和4918个非编码基因的基因组组装(v2.0_a1)进行比较[15发现这些转录本几乎100%都可以被绘制出来。另一方面，通过在组装的转录本中寻找包含在基因组组装中的基因，我们在OB组装中鉴定了大约97%的这些基因。各组份的平均GC含量(44.2 ~ 46.4%)与已发表的(45.8 ~ 46.5%)蔷薇具有可比性2)．BUSCO分析显示，完整(C)和单拷贝(S)的比例从54.4 ~ 68.8%，完整(C)和重复(D)的比例从24.5 ~ 28.2%。碎片化(F)和缺失(M) BUSCO项目约占5.6-17.4%(图4)。3.b;额外的文件1:表S1)。预测高数量的转录本可能与玫瑰种内/种间杂交和多倍体化的高频率有关。综上所述，这些结果表明组装的BT和OB转录组具有高质量、完整和覆盖率。

功能注释

探讨了五个数据库，包括NR，Go，Uniport，Swissprot和Cog数据库，以注释这些组件的功能。大约72.7％（BT）至74.4％（OB）转录物可以用任何一个数据库注释，而只有约17.6％（OB）到18.6％（BT）成绩单，为所有数据库共享注释（表2)．有趣的是，大约67.4% (BT)到71.8% (OB)的转录本具有GO注释特征，使GO富集分析在以下步骤中可行。图中包含了详细的标注信息。3.c以及附加文件2:表S2和附加文件3.:图S1。对于两个物种，范畴相关草莓属呈现了最大比例的文本(附加文件2:表S2)。

鉴定在OB和BT之间的保守的正非转录元件组（coreset1），而对于罗莎（coreset2）

为了鉴定所有蔷薇科植物共享的转录本，我们首先鉴定了两个物种之间共享的转录本。采用相对严格的阈值(identity = 90%， minimum length coverage =0.7, minimum alignment length = 200 bp)，我们鉴定了两个物种共有的10073个独特转录本(coreset1；无花果。3.D和表2)．有趣的是,coreset1显示超过80%的转录本带有注释(图。3.c和附加文件4:表S3)。

接下来我们筛选了所有罗莎具有80%序列一致性的植物。在这个阈值下，共有5959个转录本(N50为2326 bp，平均长度为2161 bp)罗莎物种(coreset2)，其中大多数都有很好的注释(98.7%;表格2；无花果。3.c)。

蔷薇科植物的鉴定罗莎您记录

本研究的目的之一是寻找可能用于蔷薇科植物系统发育重建的转录本/标记。然后我们比较了coreset2来自基因的转录物M. domestica，r。orcidentalis，P. Avium，和Fragaria veseca.的近亲罗莎(无花果。4a).在所有五个属中发现了大约4447个转录本(蔷薇科共有;74.6%的coreset2而只有164份转录本是特定的罗莎植物(罗莎-具体的;2.75％coreset2)．大多数rosaceae-常见的转录物被注释（4228或约96％;表2和额外的文件5:表S4)，并能编码蛋白质(4341;97.6%)。大约504个蔷薇科常见转录本属于1440 BUSCO单拷贝基因(35%;额外的文件5:表S4，附加文件6:表S5)。氧化石墨烯富集试验显示，这些转录本中的大多数都参与了非常重要和基本的功能(图)。4b,额外的文件5：表S4）。系统发育分析表明，大多数Rosaceae-常见的转录物支持聚类p .鸟结核与M. Domestica.(2812或65%;无花果。4c上面板和图。4D黑点)或r对与f . veseca（1436或33％;图。4C下板和图。4d蓝点）（附加文件7:图S2)。

蔷薇科常见转录本的特征

在4447个蔷薇科常见转录本中，有编码潜能的有4341个(97.6%)，用于选择压力分析dN（非同义）与dS（同义）变化。马吕斯/李属/草莓属近似序列作为背景（附加文件8：表S6）。该分析确定了409种显着选择的转录物P< 0.05(在Bonferroni纠正)．令人惊讶的是，约42%(173)的这些基因在茎尖分生组织(SAM;无花果。4f，蓝色条)，而其他基因在两种植物的叶片中表达量均较高，在SAM和叶片材料中表达量均较低(图2)。4F，红条）。这些显着选择的基因显示了DNA修复的富集样品（GO：0006281），对DNA损伤的反应刺激（GO：0006974），对应激（GO：0033554）的细胞反应和对刺激的细胞响应（GO：0051716）（GO：0051716）（图．4e,额外的文件9:表S7)。有趣的是，所有四个GO项目都有相同的9个基因(附加文件10:表S8) [29，30.，31］．虽然绝对表达水平不同，但9个基因中有8个在茎尖分生组织材料中表达增加11图S3)，表明这些基因可能在玫瑰的发育或环境适应中发挥重要作用。

的特征罗莎您记录

在164罗莎-特异性分子中，147个具有蛋白编码潜能，其中136个具有注释(65个以前未被描述;额外的文件12:表S9)。约72其中罗莎-特异基因在叶片和SAM材料中均有较低水平的表达。5其中约有92个(~ 56.1%)在SAMs中表达量高于叶片材料(图2)。5A，蓝黄条)。无GO项显著富集。然而，假定F-box家族成员的转录本编码强烈富集(24x;无花果。5b;额外的文件12:表S9)。F-box蛋白是真核生物中最大的超家族之一，含有F-box motif，用于识别泛素-蛋白酶体途径中的底物蛋白[32，33］．F-box蛋白在细胞周期进程、转录调控、激素信号、程序性细胞死亡和细胞信号转导等生理活动中发挥着关键作用。F-box蛋白可分为三种类型:F-box/kelch-repeat型、F-box/LRR-repeat蛋白和其他F-box蛋白。至少7罗莎实惠的成绩单属于F-Box / LRR重复类型，这可能在自动应力适应方面发挥重要作用（附加文件12:表S9)。巧合的是，四个TMV抗性基因对防御各种植物病毒至关重要[34，35，这些物质中也显著富集罗莎特殊基因(图。5b).这些表明玫瑰可能已经进化出新的防御相关蛋白来对抗其特定的生物胁迫。还需要进一步的实验来研究这些物质的生物学作用罗莎您记录。

作为最重要的园艺植物之一，罗斯有其特殊的生物学。连续开花，香味，花形，刺和许多没有呈现的特征杨树在玫瑰中还可以找到其他木本模型植物，因此玫瑰现在正成为了解这些特性的分子机制的木本模型物种。有趣的是，现代玫瑰的选育往往涉及品种间频繁的杂交和多倍体化，往往具有更强的抗病性和抗寒性，更好的香味和无刺[36，37，38］．另一方面，追踪现代玫瑰驯化和育种的过程和历史仍然是一个挑战[2］．

在本报告中，我们生产了高质量的转录组组装r对《老脸红》(Old Blush, OB)和r . wichuriana贝叶斯' Thornless ' (BT)，转录本N50大于2 kb，平均长度约1.3 kb。通过合并已发表的OB数据，我们生成了一个平均转录长度超过1.3 kb的改进组装。我们鉴定了10073个高度保守的转录本(coreset1)之间的OB和BT与BUSCO检测，证实了这些组装的高度完整性。作为coreset1转录本基于相对严格的序列一致性(90%)，它们可以直接用于评估物种间同源基因的差异表达。

然后探讨这些组件以确定共享的约5959份转录物罗莎sp．最后我们检测到4447个转录本共享于蔷薇科，其中约164个转录本仅存在于蔷薇科罗莎转录组。由于比较选择压力分析为理解形态性状变异和驯化背后的分子信号提供了一种有效的方法[39，40，41，然后我们在这些蔷薇科常见转录本中鉴定了蔷薇中正选择的基因。该分析检测到409个显著筛选的玫瑰基因，其中约40%的基因在SAM组织中高表达，表明这些基因可能在玫瑰幼器官/组织的发育中发挥重要作用。值得注意的是，这些积极选择的基因中有9个属于与DNA修复和应激适应相关的GO项目(图)。4) ［29，30.，31，42］．这种强富集似乎与生物过程中由于环境条件转换和/或频繁的种内和种间杂交而导致的基因组损伤/冲突的强烈要求有关。rosaceae -公共数据集包含约504个与BUSCO基因集重叠的单拷贝转录本。这些单拷贝转录本可以直接用于阐明蔷薇科的系统发育关系(图。4)，这可能是由频繁杂交、快速辐射、多倍体化和驯化引起的挑战[43，44，45，46，47］．

与蔷薇科常见的转录本相比，鉴定罗莎-特定的转录本似乎非常有趣。尽管驯化的过程已经有文献记载[2]，其进化历史和控制玫瑰特殊性状的分子机制尚不清楚[1］．大约有164名转录物中的一半是无声的或没有已知的GO注释。这些罗莎特异性转录物可能与尚未以其他物种特征的表型有关。这些转录物的序列可能显着分歧但仍然存在类似的功能，如拟南芥和玫瑰中的同源物。有趣的是，我们观察到F盒和TMV抗性蛋白质的强烈富集。这些蛋白质可能在涉及玫瑰的生物应力调整的过程中发挥作用。

在本研究中，我们提供了更好的玫瑰转录组组合，并筛选出了可能使玫瑰特殊的基因。此外，我们还鉴定了蔷薇科植物中常见的转录本，这将有助于我们澄清蔷薇科植物的系统发育关系。

植物材料和数据的生成

r对《老脸红》(Old Blush, OB)和r . wichuriana“巴斯耶无刺”(BT)植物在云南省农业科学院花卉研究所(中国云南昆明)的温室中种植。叶材料约4厘米长(从花梗基部到叶尖3.5-4.5厘米，所有小叶刚刚变平;在这个阶段，叶子被认为完全具备光合作用的功能;无花果。1)，分别于秋季(2015年11月21日)和春季(2016年3月21日)从开花的OB植株和未开花的BT植株中采集。1)．拍摄尖端材料，其中大多数叶片材料被取样于2016年3月21日。为每个发育阶段和每个物种进行至少3个生物重复，组成至少3个单独植物。

用RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)分离总RNA，用poly-T寡聚附着磁珠纯化mRNA(见图)。2对于工作流程）。对于图书馆建设，使用大约1μgmRNA具有RNA完整性数（rin）得分大于8的得分。在Illumina专有碎裂缓冲液中的温度下使用二价阳离子进行碎片。使用Truseq RNA样品制备试剂盒（Illumina，San Diego，Ca，USA）产生测序文库。使用随机寡核苷酸和上标II合成第一链cDNA。随后使用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成。通过外切核酸酶/聚合酶活性将剩余的悬垂末端转化为钝端，除去酶。在DNA片段的3'末端腺苷酸化后，将illumina PE衔接子寡核苷酸连接以制备杂交。为了长度选择优选的380bp的cDNA片段，使用AMPure XP系统（Beckman Coulter，Ca，USA）纯化文库片段。在15个循环PCR反应中使用Illumina PCR引物混合物选择性富集两端具有连接衔接子分子的DNA片段。将产品纯化（Ampure XP系统）并在生物分析仪2100系统（Agilent）上使用Agilent高灵敏度DNA测定量化。 Sequencing was carried out on either Illumina NextSeq 500 or Hiseq2000 platform.

数据过滤

所有样本大约生成了105Gb对端数据(BT约52.3Gb, OB约52.8Gb;表格1)．OB的最终数据量约为116.1Gb(包括已发布的数据)。其他物种/材料的数据信息见表2．使用FastQC (V0.10.1;http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）和Trimmomatic（V0.36; Illuminaclip：Truseq3-Pe.Fa：2：45：10 /领先：10 /尾随：10 /滑动窗口：4：25 / Minlen：48）[48］．适配器序列，读取PHRED质量低于92%，PCR重复全部用自定义perl脚本(https://github.com/ckenkel/annotatingtranscriptomes.)．所有数据的短读归档(SRA)访问可以在表中找到1．

OB和BT的转录om的组装和功能注释

在组装之前，每个物种的数据被连接(SAM, leaf_Nov和leaf_Mar)，并使用Trinity中的in silicon标准化工具将读取丰度归一化为50倍覆盖范围[49]备用时间和最小化内存要求。BT的组装是由本研究生成的数据构建的，而首先使用新生的数据建立两个组件，并稍后与已发布的数据组合（见表1和2)．经过滤波和归一化后的数据约为157 Gb，包含约13亿个归一化读对，然后使用优化的参数(Kmer = 2, min_glue = 5, SS_lib RF)在三位一体(r2014_07-17) [49］．TGICL工具箱聚集了Trinity组装，以去除已识别的重复[50］．使用开放阅读框架（ORF）使用Transdecoder.（https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki)．hmmer3.用于识别额外的ORFS匹配PFAM-A.域(51］．

这些装配体的完整性通过使用1440个近乎通用的单拷贝同源物的RNA模式的Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO)策略进行了进一步评估[52］．使用定义蛋白质产品的定制流水线对肽水平的每个转录om进行功能注释，并针对多个数据库分配转录名称（图。2)．预测蛋白/多肽使用InterProScan5分析[53检索所有可用数据库，包括Gene Ontology (GO:201605)。利用NCBI非冗余蛋白序列(NR)数据库、真核生物同源组(KOG)数据库、KEGG同源组(KO)数据库、Swiss-Prot蛋白数据库、基因本体(GO)数据库和蛋白家族(PFAM)数据库进行BLASTx分析。由此产生的.gff3和.tbl文件进一步注释了转胶中的功能描述符（https://doi.org/10.5281/zenodo.10471)．

调用OB和BT之间的保守同源转录元件(coreset1），而对于罗莎（coreset2）

找出两人共享的文字记录罗莎物种,我们确定了coreset1在OB和BT之间使用orthoMCL [54]和优化的反向爆破方法[55]序列同一性为90％，覆盖率高于0.7且超过200bp长度。

来筛选内部共享的记录罗莎（coreset2相比),我们coreset1其他已发表的RNA-seq数据r .野蔷薇，R. Roxburghii.等（见表2为本分析所使用的数据)。序列一致性设置为80%。

蔷薇科的鉴定罗莎您记录

我们进一步比较了coreset2记录到已知的cd马吕斯有明显（v3.0.a1），李属鸟结核(v1.0.a1),悬钩子属植物occidentalis(v1.0.a1),Fragaria veseca.(v4.0)，以找出所有蔷薇科中仅在蔷薇科中存在的转录本罗莎植物。在序列一致性为70%的情况下进行反向blast分析，其他参数与coreset1相同。随着coreset2转录本被用来对来自其他植物的CDS进行blast，该分析没有检测到其他属特异性转录本/基因。随后，在超几何检验的基础上对两组转录本进行GO和KEGG Orthology (KO)富集分析(FDR < 0.05)。

蔷薇科常见转录本的选择分析

如前所述，对蔷薇科共有的一组分子中具有编码潜能的4341个转录本进行了选择压力分析[39，40，41］．推定的正非基因家蝇，禽亚种和f . veseca作为背景资料，而罗莎转录本被认为是选择分析的前景。对氨基酸进行比对ClustalO(带有默认参数)[56］．系统发育分析Fasttree.（−gtrγ；http://tree.bio.ed.ac.uk.无花果树/软件/ /)。的codeml计划PAML软件包被用来估计同义的(dS）和非同义（dN)的比率，根据杨[57］．费舍尔的确切测试使用Bonferroni校正来比较H0和H1模型之间的选择压力的重要性。

英国电信(BT):

罗莎WichurianaBasye的无刺的

车身:

基准通用单拷贝Orthologs

Coreset:

保守的同源转录本元素集

DN：

非同义变化

DS：

的变化

走:

基因本体论

OB:

罗莎对“老脸红”

RIN:

RNA完整性

山姆:

技条顶端分生组织

感谢张成军教授和他的同事们访问高性能计算机。

资金

国家自然科学基金项目(no . 31660583, no . 31570311, no . 31501034);中国科学院先锋百人计划项目(no . 292015312D11035);云南省应用基础研究计划项目(no . 2016FB040);云南省科技人才招聘计划项目。本工作在中国野生物种种质资源库的支持下进行。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据集包括在本文(及其附加文件)中。

作者笔记

1. 李书斌、钟米才、董雪对这一工作贡献相当。

隶属关系

1. 北京观赏植物种质创新与分子育种，北京市城乡生态环境中北京市植物工程研究中心，林树遗传学与繁殖植物，景观建筑学院，景观建筑学院北京林业大学35号北京市青花路35号，100083

   李淑斌，王四清，戴思兰

2. 植物分子遗传学及适应，中国科学院昆明植物研究所植物多样性和生物地理研究所，昆明，昆明，650201

   钟密才，董雪，姜晓东，孙一波，程方，胡金勇

3. 2 .中国科学院大学，北京100049

   钟密才，姜晓东，徐玉星，孙一波

4. 中国科学院昆明植物研究所野生植物种质资源库，云南昆明650201

   De-zhu李

5. 云南农业科学院花园研究所，昆明，650231

   李树斌，唐开学

贡献

JH、XD和SL与DL、SD、SW和KT共同构思了这项研究。SL, MZ, XJ, YS, FC进行了实验并帮助进行了数据分析。MZ、XD、YX和JH分析了数据。JH撰写的手稿由所有作者贡献。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应于中国科学院王要么Silan戴要么金永湖．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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