转录组签名揭示了大豆扫帚疾病中花蕾畸变的机制（大豆）

家门口贾斯瓦尔¹^na1那
普拉文·诉Jadhav²^na1那
Rahul Singh Jasrotia.¹那
Prashant B.羽衣甘蓝^3.那
Snehal k·科安达²那
Magicesh P. Moharil.²那
Mahendra S. Dudhare.²那
Jashminkumar Kheni.^4.那
Amit G. Deshmukh.²那
Shyamsundar金黄色鬃毛²那
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Suprasanna Penna^5.那
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Rukam Singh Tomar.^4.那
Prashant G. Kawar.^6.那
阿尼尔•拉伊¹＆
迪·库马尔ORCID:Orcid.org/0000-0001-5466-0686.¹

BMC植物生物学体积19文章编号:26（2019）引用这篇文章

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摘要

背景

大豆(大豆L. merril）作物是食用油和人类和动物蛋白质的主要来源，除了其各种工业用途，包括生物燃料。植物诱导的花芽畸变综合征（FBD），也称为女巫的扫帚综合征（WBS）是主要的生物强调的一个，对其生产率产生不利影响。转录组种方法可用于通过晶体生理关键途径来用于该疾病表现的知识发现。

结果

利用Illumina HiSeq NGS数据对大豆FBD进行转录组学研究，揭示了17454个差异表达基因、5561个转录因子、139条通路和176,029个基因区域推测标记的单序列重复、单核苷酸多态性和插入缺失。本文阐述了PmbA、锌依赖蛋白酶、SAP家族和生长素应答系统的作用，揭示了花粉、柱头发育中花芽畸变的机制。随机选取10个基因进行qPCR验证。本研究揭示了FBD发病的基本机制，即寄主植物感知植物原体感染，触发分子信号，导致碳水化合物和蛋白质的动员，叶状体，花粉发育异常，昆虫在寄主植物体内的定植从而传播疾病。研究揭示了植物原体如何劫持大豆表现FBD的代谢机制。

结论

这是大豆或WBS疾病的转录组签名的第一个报告，揭示了吸引昆虫的形态学和代谢变化。所有基因区域推定标记物可用作各种改善和新农业化学发育的基因组资源，以提高大豆生产率。

背景

大豆(大豆L. Merril）迎合牲畜，家禽和鱼类食用食用油（25％）和蛋白质浓缩物（67％）的全球需求。它有助于肉，牛奶，奶酪，面包和油。每单位面积，这种作物产生的蛋白质是最高的，因此这种作物具有各种绰号，如“牛的牛”或“来自土壤的黄金”，“黄色宝石”，“大宝”，“大自然的奇迹蛋白”[1]．全球五大大豆生产国分别是美国、巴西、阿根廷、中国和印度，贡献率超过92% [2]．它也在涵盖20多个国家，包括印度的四大大陆。大豆是一种很有希望的作物，因为它在降低胆固醇，抗致癌物质和肥胖，糖尿病，消化道，骨骼和肾脏疾病的肥胖，刺激性症的保护作用中的潜在有益作用3.]．作为生物燃料生产的生物能源作物，大豆及其副产品作为牲畜饲料也更为相关[4.]．大豆的生产力受到各种生物和非生物胁迫的不利影响，如盐分、病原体、热、干旱、热、土壤重金属和压实[5.]．在生物胁迫中，植物原体和病毒是造成生产力损失2 - 90%的主要障碍[6.]．根据早期的报告，已经在宿主中发现了一些导致花粉活力下降的生物因素[7.]种子质量变体[8.]、花畸形、萼片肥大、绿色、叶状、生殖器官流产[9.，增强营养生长[10，过早的花败[11)等。植物生殖器官的细胞学检查显示，有症状的植物花粉粒畸变，妨碍授粉和受精[12]．

大豆巫婆帚状病的症状和传播在印度有充分的记录[13]．这种紊乱导致豆荚不能形成，直到季末才衰老成熟。症状也是不可预测的。大豆巫婆病的花芽形成异常发育，甚至导致生产力的严重损失[12]．它在印度被称为“花蕾扭曲”，由植物原体引起[14那15]．在美国和伊朗，这被称为芽增殖综合征[16， pod集故障[17那18]，分别。

早期花组织的基因表达研究局限于基于微阵列的有限差异基因表达[19]．虽然大豆的RNA-Seq图谱有14种不同的组织，包括花，但没有任何非生物和生物胁迫的表达数据可用[20.那21]．已经对FBD进行了细胞学和有限分子研究，发现27 DEG具有ARF9转录因子和调节蛋白FHA以及它们的蛋白-蛋白相互作用网络[12]．虽然大豆的全基因组序列已经在2010年完成[22但如果没有RNA-Seq方法，就无法解释FBD的详细机制。这种知识发现不仅是了解病害的基本机制所必需的，而且对大豆生产中病害防治策略的设计也有重要意义。通过RNA-Seq方法，单个作物基因型的胁迫响应主要形态和生理途径已经成功破译了像茶叶这样的作物[23,番茄24cassava [25]．对于像大豆这样的农业作物，应激反应被发现是特定于品种/种质的[26]．

本研究旨在揭示大豆巫婆病花芽扭曲的关键候选基因及其分子机制。本研究还旨在描述与FBD相关的生化途径，以及基因区域标记(SSR、SNP和InDels)的发现和预测与FBD相关的转录因子。

结果与讨论

鉴定FBD的症状和无症状植物

通过花粉活力，形态，耻辱应接受，花药形态和萌发测定成功地通过花粉生殖器官的细胞学研究成功进行症状和无症状植物的歧视（图。1）.花器官、花粉和花药的扫描电镜(SEM)也证实了这一点。2）.随后，通过扩增子大小及阳性和阴性对照的PCR检测，进一步成功证实了它们(图)。3.）.由于不容易排除无症状植物支原体感染，因此需要基于PCR的诊断[27]．

RNA-Seq数据生成

感染组和对照组分别产生30669 583和3667 121对端读。从两个样本中共删除156,054和198,931个低质量reads，其余高质量reads用于转录组分析。Trinity汇编器生成的de novo汇编具有258,427份默认抄本k-mer值251）.然后用CAP3汇编器去除冗余序列，共获得211343个转录本用于进一步分析。最终组装的GC含量为41.96%，N50为1081 bp。最小和最大转录本长度分别为190 bp和50081 bp。

表1在修剪之前和之后读取“统计”

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虽然大豆基因组具有66,210个预测的基因模型[20.[所构造的转录组组件似乎由相对较高数量的转录物（211343）表示。观察到的转录物数量相对较高的潜在原因可以是（1）大豆基因组的古基多倍素来源，其具有两次的重复事件（59 mEA和13 mERA），其中预期变体转录物由于基因组的同源物的差异半衰期/保留时间是预期的它们之间的变化。这些变化是由于重组，由于插入，缺失，反演，不等交叉，假性生成和背景突变而导致的结构变异[22那28]，（2）应激诱导的同种型由于免疫相关基因的替代剪接[29（3）（3）较高数量的基因（> 66 k）和每个基因的平均外显子数量，这些基因不同于3-5，也有望产生更多数量的转录物（196至330万）[20.]．

差异表达基因的鉴定

DEG的分析是通过基于转录组组装的方法进行的，因为它有望发现“额外的基因”[30.和异构体[31.也保留了植物原体转录本。然而，通过大豆参考基因组组装的转录本作图来评估获得的DEG2）.这表明转录组组装的准确性以及覆盖率和深度的均匀性，因为有< 5%的变异。

表2大豆参考基因组组装的转录本图谱

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通过转录组件方法，我们发现35,725,1487和4490°，分别在三个不同的q值参数中。q = 0.9，q = 0.95和q = 0.99。通过方法，即Edger和噪音问题发现了Degs。通过jeckq发现的Deg与Edger进行了比较。通过edger获得的17,454℃，发现总共12,182和12,053次分别在Q = 0.9和0.95中常见。在Q = 0.99，两种方法的比较显示3879次常见的次数。我们的比较分析通过噪音验证了该DEG。与不同Q值的edger的比较呈现在表中3.．在更严格的条件下(q = 0.99)，有更高表达(>±8倍变化值)的基因是常见的，超过85%。这些组中上调和下调基因的图示在热图中描述(附加文件)1）.

表3 noise和edgeR得到的DEGs比较

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注释和功能表征

对大豆差异表达基因进行同源性搜索，结果显示，在数据库中17454个与其他已知基因相似的基因中，共有12900个与其他已知基因相似。最大匹配次数(6701)大豆，其次是甘氨酸Soja.和菜豆即3590和280。4.额外的文件2）.植物原体特异性转录本仅为411份，占总数的2.35%。通过基因本体论分析，将基因分为分子功能、生物功能和细胞功能三个子类(图1)。5.）.

在对PlantTFDB v4.0进行blast分析的17454个差异表达基因中，5561个ungenes与转录因子具有相似性。与MYB相似的unigenes最多为449个，其次为bHLH、ERF、NAC和FAR1，分别为439、363、339和296个(附加文件)3.）.KEGG通路分析显示，有6041个unigenes参与了139个通路(附加文件)4.）.

在大豆花芽组织转录组数据中，共发现296个与植原体相关的基因序列。FBD转录组是宿主和寄生虫的混合转录。这是由于在有症状的大豆样品中存在植物原体。寄主植物的许多转录本都是响应植物原体的需要。植物原体的生存依赖于宿主的蛋白质合成机制[32.由于其较小的基因组大小（500-1500kbp），它含有非常有限的基因组[33.]．类似的更高丰度的植物浆转录本在其他作物中也有报道，巫婆的扫帚病也包括泡桐[34.]．植物浆体通过抑制水杨酸途径降低宿主植物的系统抗性，增强其生长以进一步入侵、增殖和扩散[35.]．

其中发现了DNA旋回酶的调节基因PmbA的调控。这是加快细菌复制速度所必需的，随着解旋酶双向DNA解开叉[36.]．由于其在基因组大小可塑性中的作用，发现了多组被称为“逆转录酶”的转录本，这显然是在植物浆中预期的[37.]．其编码基因内含子II逆转录酶分散在植物原体基因组上，通过产生变异性实现基因的横向转移。由于这些基因的存在，同一种植物原体的不同品系大小不同[37.]．

我们发现Zn依赖性蛋白酶转录物的差异表达，所述蛋白酶转录物已知用于毒力触发基因的作物苹果。已发现该基因的多态性与中度至严重的疾病病症有关。该依赖性蛋白酶基因也称为HFLB（同义词FTSH），其用于膜相关ATP和Zn2 +依赖性蛋白酶控制组件，蛋白质的蛋白质和细胞质的蛋白质的劣化和稳定性[38.]．

毒力蛋白SAP54上调，也是一种效应体，它通过26S蛋白酶体穿梭蛋白RAD23介导MADS-box转录因子的降解，导致叶状花发育过程中花芽扭曲(FBD)。这是植物原体通过扩大营养组织(叶状花)来吸引昆虫载体的适应性反应。这进一步增强了昆虫定植，这是植物原体通过昆虫载体更广泛传播的一种战略适应[39.]．

植物生长素反应因子、植物生长素转运蛋白、植物生长素诱导蛋白的各种转录本均有差异表达。它们在花粉的壁纹和花粉发育中发挥作用[40]．生长素响应启动子元件与环境信号一起参与营养向生殖阶段的转换。植物原体扰乱花组织的正常生殖发育，导致FBD [12]．

在女巫的扫帚综合征(WBS)中，碳水化合物蛋白质和叶绿素增加> 2倍[41.]．这是由于激素平衡受损，导致氨基酸和碳水化合物易位随着衰老而受损。营养期随着植物的延长，但豆荚没有适当的发展。

在芸苔属植物中也有这种花毒力和畸变，并伴有异常的枝分枝和发育不良[42.]．糖的运输和积累导致FBD表现的遥远信号[9.]．

在SAP11基因中观察到上调，已知用于通过衰减植物发育和免疫力来增强昆虫载体繁殖的植物蛋白效应器[43.]．据报道，植物等离子体效应剂可以改变花的发育，从而诱导巫婆的扫帚和改变叶子的形状，以促进植物和昆虫的相互作用。这些效应体促进植物原体在生命周期中的优势进入两个不同的领域，即植物(大豆)和动物(昆虫)[44.]．这些效应剂可用于进一步研究开发防治疾病战略所需的新农药[45.]．

挖掘推定的分子标记

通过De Novo转录组合组件获得的211,344个转录物中断了总共27,925个SSR标记物大豆．表格4.提供单核苷酸，二核苷酸，三核苷酸，四核苷酸，戊核苷酸和己核苷酸标记物中发现的所有重复单元的信息。没有多态性发现，因为这些SSRS从单个基因型中开采，所生成的信息（附加文件5.)有基因座的详细信息以及用于基因分型的计算机引物。通过e-PCR对SSR位点进行硅分型，对这些基因组资源的未来利用进行了评价。为此，利用已发掘的具有双重复和三重复的SSR位点进行e-PCR验证。共使用1874个转录本(大小为> 1000 bps)进行e-PCR。排除“非特异性”e-PCR产物(有一个以上的命中，相似度100%)后，共发现193个特异性SSR位点，可用于未来的基因分型(附加文件)6.）.在大豆基因组中预期由多次命中表示的非特异性E-PCR产物，因为它含有重复事件引起的> 75％重复基因[22也与异构体有关。我们的e-PCR结果清楚地表明，对于像大豆这样的古二倍体基因组物种，该方法可以成功地在SSR位点的湿实验室验证之前使用，从而在基因分型中排除多个拷贝转录本，减少时间和成本。这些SSR位点可用于多样性、QTL定位和关联定位的基因分型。

表4挖掘出的简单序列重复序列和所有重复单元信息

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虽然转录组数据属于单基因型，JS- 335印度大豆品种，但SNP和InDels的挖掘已经成功地进行了比对，以代表美国Williams 82品种的可用参考基因组。大豆RNA-seq共检测到146,065个变异，包含139,461个SNPs和6604个InDels。18号染色体的变异量最大，为9582，其次是6号染色体的8748和2号染色体的7489。在11号染色体中发现的变异最少，为4739个。SNP的Ts/Tv比值为1.53,A-G和T-C是转化中的最大预测变量，而T-A和A-T是转化中的最大预测变量(图)。6.a).此外，注释是针对大豆基因组，其中最大变体（37.48％）在封面区域中发现，其次分别在下游（20.32％）和上游（16.88％）区域（图。6.b;额外的文件7.）.

所有176,029个推定标记（SSR，SNP和Indels）可用作未来研究的基因组资源，特别是对于QTL，基因测绘和连杆分析。这种DNA标志物用于柔软植物抗肌型QTL映射，如苦贝里（李古兰弗吉尼亚州)[46.]．使用DNA标记物的品种改善计划中的植物抗性性状迟发已在苹果中成功报道[47.]．在椰子中，由植物性DNA标记引起的致致死的致黄性疾病（LYD）已用于杂交品种发展方案，以改善Lyd抗性[48.]．

QPCR验证和表达分析

对所有10个上调和下调基因进行qPCR分析，得到的相对基因表达值与计算得到的DEGs的对数倍变化值一致(图2)。7.）.qPCR所用基因及引物的详细信息见表5.．

表5 qPCR基因和引物序列详细信息

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数据提交

该研究使用的测序数据集可在NCBI知识库中获得，生物项目:PRJNA472133、生物样本:SAMN09227257(大豆对照无症状花芽组织)和SAMN09227258(植物原体感染大豆有症状花芽组织)。

结论

这是大豆中FBD或WBS疾病的第一次转录组研究。我们报告了17,454只涉及疾病的139例途径的转录组签名。该研究在分子水平方面表现出异常的花朵发育，碳水化合物和蛋白质，植物异常，花粉发育，改善宿主植物中昆虫的定植。报告了总共176,029个基因区域推定标记物（SSR，SNP和吲哚），可用作未来分子育种计划的基因组资源，用于转移大豆种类改善的植物抗性。不仅需要在分子水平上理解疾病，因此不仅需要进行这些研究，但它们也需要种质改善大豆生产率的致力。