用于定量实时PCR标准化的参考基因的选择植物病原体Puccinia Helianthi.Schw。

背景

实时RT-PCR已成为常见且稳健的技术，以检测和定量低丰度mRNA表达，并且是在检查感染宿主组织中的真菌基因表达时是优选的工具。然而，对基因表达数据的正确评估需要对参考转录物准确和可靠的归一化。因此，在不同条件下具有稳定表达的参考基因的鉴定至关重要。在这里，我们展示了体外和体外的研究在Planta.实验用于验证参考基因候选物的表达稳定性Puccinia Helianthi.SCHW.．，导致向日葵生锈的迫使病原体（Helianthus Annuus.）.

结果

11个参考基因p . helianthi在不同的增长阶段验证。基于Excel的软件改性，BestKeeper和Normfinder用于评估参考基因转录性稳定性。测试的11个参考基因候选物中，三种在尿针织孢子中稳定表达，发芽生长阶段和在Planta.．其中两个基因（UBC.那EF2），编码泛素缀合酶和伸长因子2，被证明是在所用实验条件下是最稳定的参考基因集。

结论

我们发现了UBC.和EF2是用于植物病原体基因表达研究的标准化的合适候选者p . helianthi潜在的其他相关病原体。

由底漆造成的向日葵锈病Puccinia Helianthi.是全球主要向日葵生产地区最具破坏性的疾病之一。它在中国普遍且广泛，每年发生耕地向日葵（Helianthus Annuus.(L.)和自然野生一年生种。这种专性的生物营养真菌在形态和功能上有几个不同的发育阶段，都在向日葵宿主中。最有效的防治措施是利用抗病品种和杂交种。然而，调控发病机制的因素p . helianthi不明。因此，研究涉及与互动中涉及的关键基因表达模式的研究p . helianthi和在分子水平的向日葵将有助于抗性向日葵品种。

用于检测基因表达水平的生物学技术包括:半rt - pcr、Northern blot、RNase保护试验、基因芯片、RNA测序和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。qRT-PCR被认为是同时测量许多不同样本中基因转录本相对水平最可靠的技术，因为它的效率和灵敏度[1那2]．与常规方法相比，QRT-PCR是可用于检测所选基因的低拷贝数mRNA的唯一方法[3.]．然而，通过该方法获得的结果的准确性取决于使用合适的参考基因进行准确的靶转录标准化，这可以控制潜在的实验误差[4.]．

QRT-PCR已被用于病原体检测，如细菌，病毒和真菌和植物组织和土壤中的基因表达分析[5.那6.]．在许多真菌中，由于缺乏再生和转化方案，工程师的可能性受到限制，QRT-PCR已成为基因表达研究的频繁首选。研究真菌生物学的一般分子策略是评估基因表达水平，试图将特定基因的转录水平与真菌反应的转录水平相关，并适应环境条件[7.那8.那9.]．此外，p . helianthi转录组数据为QRT-PCR实验提供了一种强大的基因选择和随后引物设计的强大工具。然而，使用QRT-PCR技术必须依赖于参考基因评估的系统过程，以包括在归一化步骤中。

最近，植物真菌病原体中的参考基因验证研究数量增加了柄锈菌小麦锈病[10]，镰刀小麦枯萎病中的Sp. [11]，aspergillus.sp。黑色模具[12] 和Magnaporthesp。在稻瘟病[13]．研究表明，参考基因的表达稳定性在物种之间变化，并且该表达也可以在组织类型，发育阶段和实验情况下变化[14.那15.那16.那17.]．因此，必须在不同的生长阶段筛选适当的组成型表达的对照基因以用作实时PCR的内部对照。

由于基因组操纵中的内在困难p . helianthi，我们专注于使用QRT-PCR的基因表达分析。用于基因表达标准化的有效内源性对照基因的鉴定将有助于进一步研究p . helianthi转录水平上与宿主的发展和相互作用。我们鉴定了11个内参基因的稳定性p . helianthi．基于Excel的软件用于评估候选参考基因的稳定性。这提供了对11个推定参考基因的广泛验证，该基因可以应用于与该真菌有关的未来基因表达研究。

铁锈病原体隔离和向日葵

比赛330和737Puccinia Helianthi.，及向日葵(Helianthus Annuus.L.）品种Heidapian（糖果开放授粉品种）和7350（糖果近交系）被选中。Heidapian表现出对比赛330和7350的易感性，易于比赛737，这两种组合组合都是组成的。

接种

将储存的330和737小种尿孢子接种于2周龄的感病植株上，繁殖出新鲜的尿孢子。15天后，用羊皮纸拂叶，从锈迹斑斑的叶片上收集新鲜的uredinio孢子，部分孢子置于−80℃保存，其余孢子用于接种向日葵植株。

向日葵品种Heidapian和7350的种子在1％次氯酸钠中消毒，并在每锅（14×11cm）的五种种子（14×11cm）含有巴氏菌土壤（每种品种的总5罐）中植物。种族分别涂抹在v2阶段幼苗上，浓度为1×10^6.孢子·毫升^{- 1}．接种苗在20±1℃露珠室(相对湿度90 ~ 100%)黑暗中培养24 h后转入20±1℃温室，光周期16 h(相对湿度60 ~ 70%)。接种后5、10、15 d，分别取样3片叶片，在−86°C的液氮中保存。对两个品种的健康向日葵叶片取样，检测引物特异性。

样品制备

为每个种族和各种组合建立了五种治疗（TR）。一组包括330种比赛的尿针织孢子，8小时的孢子孢子，带有330（TR2），5 d接种Heidapian叶子，带有330（TR3），10 d接种Heidapian叶，其中有330（TR4）和15 d接种Heidapian叶子，330（TR5）。另一组包括urediniospores的比赛737（TR6），8小时牙釉质孢子，血液孢子与运动血液管737（TR7），5d接种7350叶，10 d接种7350叶，737（TR9）和15D接种7350叶，737（TR10）。

为了获得发芽的孢子，600毫升含有新鲜尿针的灭菌水，最终浓度为20毫克Urediniospores·L.^{- 1}被添加到一个90 × 45厘米的板上。15°C黑暗孵育8 h后，收集萌发的尿孢子，高速离心后用吸墨纸吸干，立即浸泡于液氮中，−80°C保存。所有处理重复三次。

RNA分离来自防锈株和受感染的植物材料

从包括Urediniospores的不同样品中分离出总RNA，每个种族的发芽孢子，接种的向日葵叶，在接种后（330 / Heidapian和737/7350）使用rneasy植物迷你套件（qiagen cat。没有．7.4.9.04) following the manufacturer’s instructions. The concentration and purity of isolated RNA was measured with a UV spectrophotometer (NanoDrop ND-1000). The mean ratio value of A260/280 for all RNA samples was 2.0–2.1, A_260/230 ≈ 2.0 reflecting high purity and protein absence. RNA integrity was verified by performing 1.5% agarose gel electrophoresis. To guarantee the quality necessary for expression analysis all samples presented a 28S/18S rRNA ratio ≥ 1.7.

DNase治疗和cDNA合成

在制造商的说明之后，在RNA酶抑制剂（重组RNASIN®RNase抑制剂，Promega）存在下，用RQ1 rnase--rnase（promega）处理来自每个样品的总RNA（25μg）。根据制造商的建议，使用M-MLV逆转录酶（猫，No.28025-013; Invitrogen; Invitrogen），处理过的RNA被逆转录。在1.5％琼脂糖凝胶上分离总RNA扩增后获得的cDNA，以验证完整性和产品尺寸。用UV分光光度计（NanoDrop Nd-1000）进行cDNA定量。

实时定量rt - pcr

在此基础上，筛选出11个内参基因p . helianthi转录组数据，包括β-肌动蛋白（ACTB），伸长因子1（EF1），伸长因子2（EF2），伸长系数3（EF3），核糖体蛋白S24（RPS24)、核糖体蛋白S5 (RPS5），α-小管蛋白（tuba.），β-​​小管蛋白（tub），泛素缀合酶（UBC.)、E2泛素结合酶(Ubce2.），络合剂（UBQ.）.基因序列储存在GenBank（表1）.

所有引物均采用Primer 5软件设计(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/）通过Invitrogen合成。底漆设计的标准如下：引物长度为20-22bp，GC含量为45-55％，熔融温度（Tm）的范围为55-60℃和100-150bp的扩增长度。

为了验证他们的特殊性p . helianthi，我们使用常见的PCR在向日葵中进行试验（cDNA来自品种Heidapian和7350）。只保留对QRT-PCR没有向向日葵扩增的内政基因的引物（表2）.

QRT-PCR在96个孔板中进行，每个样品/基因为20μL总反应体积，如下：10μLCOWERSYBR®GreenPCR母料混合物（2×）（PE应用生物系统，USA），0.5μL正向引物（终浓度2.5μm），0.5μl反向引物（终浓度2.5μm），1μl（10ng）的稀释cDNA，无核酸酶水8μl。以下QRT-PCR程序用于7900 HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems，USA）：在95°C的95°C，10 s的40个放大循环为10 s，在95°C，1min退火60°C，在60°C下延长1分钟。将熔融曲线分析从60℃〜95℃进行，以验证引物特异性。每个样品的三个生物学重复与每个孔的两个技术重复一起进行。每个引物对也包括两个阴性对照，其中CDNA被核酸酶不含水代替。使用ABI Prism 7900 HT软件工具（应用生物系统）进行分析实时数据。通过使用汇总cDNA的串行稀释液的标准曲线法评价每个引物对的扩增效率，并且使用相对表达软件工具（REST）进行计算[18.]．所有引物对呈现引物效率的放大效率80-110％，R²价值0.98-0.99满足QRT-PCR的要求。通过2％的扩增子分离测试原料的原始产品（W./V.）在QRT-PCR运行结束时琼脂糖凝胶电泳。

统计数据分析

我们应用了三种数学算法，改性[19.]，rangfinder [20.]及BestKeeper [21.[评价候选参考基因的表达稳定性。

使用Genorm评估最佳参考基因p . helianthi，将CT值转化为相对表达水平，然后根据手册计算。该程序决定了与所有其他测试候选基因的参考基因的成对变化，并将基因表达稳定性测量M定义为特定基因和所有其他对照基因之间的平均对变化。具有最稳定表达的基因具有最低的M值。逐步排除具有最高M值的基因根据其表达稳定性排列测试的基因，导致剩下两种最稳定的基因的组合。在归一化因子之间计算成对变化（Vn / n + 1）以确定归一化所需的参考基因的最佳数量。截止阈值被设定为v = 0.15，下面不需要包含另外的参考基因，如Vandesompele等人所提出的。[19.]．

从三种算法获得的稳定性排名的结果集成，根据相应排名的几何平均值产生综合排名。考虑到PCR效率，CT值转化为原始相对量。

底漆特异性和效率检查

用所有测试的引物从锈病cDNA扩增获得靶片段。然而ACTB引物也在未感染的叶片中发出微弱信号(结果未显示)。其他的引物对都没有在未感染的叶子中产生扩增子，证实了没有p . helianthi在这些控件。因此，这对引物不能作为Real time PCR研究锈病基因表达的内参基因。

剩余十对引物的扩增产物的熔化曲线表明，获得了预期尺寸的单一扩增产物。对于非模板控制，没有扩增或高CT值（> 35ct），减去逆转录酶（-RT）和仅宿主控制。这表明试剂没有污染，因为没有GDNA的扩增，没有植物cDNA的非特异性扩增。所有十个内政基因引物使用五倍稀释CDNA的引物效率的计算给R² > 0.99 and 87–102% efficiency (E) values (Table2）.

候选内参基因的表达水平

对于每个候选基因，CT值可以用来比较基因表达水平。CT值的变异系数反映了基因表达的稳定性，CT值越高，基因表达量越低，反之亦然。因为他们的表达水平RPS5那tuba.,tub在Urediniospores，发芽孢子和接种叶片非常低（结果未显示），三个内部候选基因（RPS5那tuba.,tub)被排除在后续分析之外。其余7个内参基因在不同样本中的表达水平存在一定的差异。在这其中,EF2和RPS24有最高的表达，而Ubce2.和UBQ.具有较低的表达（图。1）.这些候选基因在不同样本中表达缺乏规律性和稳定性。

余下的7个参考基因候选(EF1那EF2那EF3那RPS24那UBC.那Ubce2.,UBQ.）进行进一步分析。纯病原体中的表达和在Planta.不能直接比较，因为真菌的起始浓度或真菌RNA的数量不能相等，但可以比较不同基因之间的表达差异。RT-PCR分析了侵染后5、10和15日龄叶片的RNA，结果表明，6个候选内参基因在所有样品中表达水平相近，而5日龄叶片的内参基因表达水平相近RPS24与尿孢子和萌发孢子相比，以及与其他内参候选基因相比，该基因的mRNA表达明显上调(CT值较低)。2）.因此我们放弃了这个基因作为管家基因的候选基因。为了获得候选基因的统计评价，我们进行了另一个统计测试，根据表达稳定性对其余基因进行排名。选取感染10天和15天的叶片进行内参基因候选表达分析在Planta.，因为侵染后10天和15天叶片中表达的基因CT值相似，且侵染叶片中的病原菌数量远高于侵染叶片5天时的数量。

geNorm对实时RT-PCR数据进行统计分析

对所有被选为内参基因候选基因的表达的初步研究(EF1那EF2那EF3那UBC.那Ubce2.和UBQ.），在四种不同的生长阶段（Urediniospores，发芽的孢子，在感染后10和15天内进行）进行。

通过对孢子和芽管，基因的分析UBC.和EF2估计具有0.114的最低M值，因此稳定性最高，而且Ubce2.给出了最高的m值（最低稳定性）（表3.）.对感染叶片(10 d和15 d)进行分析，结果相似UBC.和EF2具有0.174的最低m值（最高稳定性）（表4.）.从孢子和萌发的孢子中得到的V值为0.098(表3.受感染的叶子）和0.102（表4.)，利用两个表达最稳定的基因，UBC.和EF2，作为参考基因足以在该表达分析中进行可靠的数据标准化p . helianthi．

BESTKEYER的实时RT-PCR数据统计分析

基于不同生长阶段表达的六个基因的描述性统计在表格中呈现5.和6.．BestKeeper将每个基因的CT范围表示为CT向几何平均CT的极值，并给出其标准差，从而对每个内参候选基因的表达稳定性进行评估(表)5.和6.（分别，最小）[x折叠]和SD [±x折叠]）。

在孢子和发芽的孢子，EF3具有2.11±0.45的最低CV±SD值，被鉴定为最稳定的基因。EF2（2.84±0.54）和UBC.(2.80±0.61)分别排在稳定内参基因的第二位和第三位5.）.这些基因稳定性被排名为EF3>EF2>UBC.>EF1>UBQ.>Ubce2.．Ubce2.SD大于1被认为是不可接受的，应该被排除在外。

在Planta.那UBC.具有0.63±0.16的最低CV±SD值，被鉴定为最稳定的基因。EF2（0.74±0.17）和Ubce2.（0.81±0.20）作为正常化的第二和第三稳定参考基因排名（表6.）.这些基因稳定性被排名为UBC.>EF2>Ubce2.>EF1>EF3>UBQ.．

利用NormFinder对实时RT-PCR数据进行统计分析

基于常常法探测，孢子和胚胎管中的稳定性是（从最稳定到最小稳定）ubc > ef2 > ef1 > ef3 > ubq > ubce2(表7.）.UBC.样品中具有最稳定的表达模式。恩序机还确定了两种基因的最佳组合的稳定值，为0.002UBC.和EF2．

感染叶片的稳定性是（从最稳定的最稳定的）ubc > ef2 > ef1 > ef3 > ubc > ubce2 > ubq．两个基因的最佳组合的值EF1和EF2，为0.005(表8.）.

内参基因的综合稳定性分析

我们确定了六种选定参考基因的表达稳定性p . helianthi．11个内参基因在p . helianthi感染生长阶段。在孢子和发芽的孢子中，使用Genorm获得的结果和常常法术表明这两种参考基因UBC.和EF2稳定在p . helianthi．BestKeeper的结果显示EF3是最稳定的，然后是EF2和UBC.．在三个方案结合后，澄清了如何UBQ.和Ubce2.与其他相比，基因被排名为最不稳定的转录物。此外，所有参考基因的分析在一起表示UBC.和EF2基因是最稳定的9.和10）.在染病叶片中，geNorm和BestKeeper的结果相似，说明两者都是UBC.和EF2被列为最稳定的成绩单。同样，NormFinder显示了这一点EF2是最稳定的。

这三个程序的孢子和感染叶片的综合分析表明UBC.和EF2是最稳定的基因。

关于验证在基因表达实验中使用的一组参考基因验证的少量p . helianthi．研究时应检查内参基因的特异性p . helianthi向日葵的交互。因此，除了检测引物对锈病cDNA扩增的特异性外，还检测了这些引物对向日葵cDNA的扩增。的ACTB利用实时PCR技术研究锈病基因在向日葵中的表达，可以在未侵染的叶片中获得扩增子。然而ACTB引物仍然可以用于实时PCR研究，以体外研究生锈基因表达。

当我们采用分析软件筛选某些物种的适当参考基因时，样品选择影响的试验结果。因此，在分析时，应考虑来自不同生长阶段和条件的样本。自从p . helianthi不能在体外再现，我们选择病原体样品和在不同生长阶段接种的向日葵叶片以进行参考基因选择。

使用CT方法的比较，我们分析了乌雷迪尼孢子，发芽孢子和5,10和15D感染叶片中每个内脏基因的基因表达。所有样品中cDNA的总量相同，衍生出2μg总RNA，但不同样品中的生锈病原体量大大差异很大。五天后接种后处于原发性感染阶段，因此叶片样品仅含有少量的菌丝和胰岛素，没有明显的症状。虽然接种后10 d的叶样品有更多的病原体菌丝体，具有明显的症状，并且在接种后，真菌产生了大量的尿液，覆盖整个叶子，表明与5 d感染的叶样品相比显着增加了严重程度。基因RPS24不适合作为候选，因为它在侵染叶中表达量高于孢子。基因表达水平RPS5那tuba.那tub在所有样品中非常低，因此，这三种基因不适合作为候选内部参考基因p . helianthi了。然而，β-微管蛋白被推荐为高毒性植物病原体标准化的最佳选择Lasiodiplodia theobromae.[22.]．

病原菌在侵染过程中生物量变化较大在Planta.这提出了需要一种适当的方法，以进一步规范化植物总植物和真菌cDNA池中的真菌cDNA比例[23.]．检测接种后叶片中不同基因的表达，表明随着叶子中病原体生物质的增加，基因表达EF1那UBQ.那UBC.那EF3那Ubce2.那EF2显着增加。这六个内政基因的表达与向日葵生锈的宏观变化规则一致，基本上将条件达到内部参考基因。这些基因在10和15d受感染的叶片的表达相似。因此，在相互作用的条件下选择10和15 D感染的叶片用于基因表达分析（在Planta.）.选择尿孢子和萌发孢子进行离体分析。维埃拉等[23.]研究了七种参考基因的表达，即甘氨醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH.)，EF-1，β-微管蛋白，细胞色素C氧化酶亚单位III（Cyt III)、细胞色素b (CYT B.)，HV00099和40s核糖体蛋白（40s_rib.） 在Hemileia Vastatrix.，咖啡叶锈病的因果因子，体外（发芽尿针孢子和孕妇）和在Planta.（渗透后真菌生长阶段）。使用Genorm和Normfinder工具评估基因稳定性。CYT B.那40s_rib.,HV00099是体外最稳定的基因40s_rib.那GADPH.,Cyt III是最稳定的在Planta.．对于组合的数据集（体外和在Planta.)，40s_rib.那GADPH.,HV00099被选为最稳定。

Dankai等人。[24.报道，actin基因是选定的四种内脏基因中最稳定的表达，即β-肌动蛋白，甘油蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，β-微管蛋白和18s rRNA，并推荐用作基因表达分析的内源性控制所有增长形式Talaromyces Marneffei.通过正常和应力条件下的QRT-PCR。它们的结果表明，它仍然无法满足QRT-PCR标准化分析的要求（M值> 1.5）。

有趣的是，已经广泛用作QRT-PCR的内部ContOL的actin转录物不是在广泛的参考基因选择之后的最佳选择。kummasook等。[25.]在菌丝体中报告给酵母相转变Penicillium Marneffei.在将温育温度从25℃至37℃移位后，肌动蛋白转录物最初即时上调，但随后略微下降，并且在进一步生长或在胁迫条件下没有变化。这表明肌动蛋白表达在不同条件下不稳定。Tao等人。[26.]报道，F-actin封蛋白α亚基（FACPA.)及液泡蛋白分选蛋白(迪卡）是在所有二态转移阶段和两种不同菌株中比β-肌动蛋白更稳定的最佳参考基因对。p . marneffei并且推荐使用QRT-PCR作为该病原真菌中基因表达分析的内源性控制。

理想的参考基因应在各种实验条件下的所有样品中以恒定水平表达[27.]．随着qRT-PCR技术的不断完善，对合适内参基因的验证研究也越来越多。许多研究倾向于使用多个内参基因，并使用管家基因相对表达值的几何平均值进行归一化，这样可以避免对基因表达数据的误读[28.]．

基于大规模转录组测序数据的QRT-PCR的内部基因是相对较新有效的策略[29.那30.那31.]．Cankorur-Cetinkaya等人选择并鉴定了一组新的内部基因[29.]，这些基因已成功应用于丝状真菌的qRT-PCR [32.]， 植物 [30.]和动物[31.那33.]．

几种数学方法（计算算法）可具有最低变化和生物样品的高稳定性的合适的参考基因。这四种最常用的方法是常规，改性，BESTKEYPER和比较DELTA CT。这些方法都不能为选择使用的参考基因以及如何识别它来提供完全令人满意的解决方案。这也可能影响QRT-PCR结果的解释。为了确保基因表达分析的可靠性，我们基于所使用的算法的结果对参考基因进行全面评估。

目前的研究是第一次系统评估潜在内参基因作为正常化因子的表现p . helianthi表达研究。选自11个基因，用于基因表达稳定性分析的RNA-SEQ数据。从三种算法（Genorm，BestKeeper和Normfinder）的所产生的排名的基础上，我们获得了合适的组合（UBC.和EF2的内参基因p . helianthi．本研究结果为其他锈病病原菌与寄主相互作用中的基因表达研究提供了有益的参考。

这是第一次进行系统勘探的研究p . helianthi为了验证尿素孢子，胚胎管和不同发育阶段的受感染叶片的QRT-PCR标准化的候选参考基因。评估了11家船务基因。UBC.和EF2利用geNorm、BestKeeper和NormFinder 3种计算机算法对不同发育阶段(纯病原菌或与寄主互作)的内控基因进行了鉴定。这些结果为可靠的qRT-PCR数据归一化提供了有用的信息p . helianthi基因表达研究。

40s_rib.：

40s核糖体蛋白

ACTB：

β-肌动蛋白

CYT B.：

细胞色素B.

Cyt III：

细胞色素C氧化酶亚单位III

迪卡：

真空蛋白质分选蛋白

EF1：

伸长因子1

EF2：

伸长因子2.

EF3：

伸长因子3.

FACPA.：

F-actin封蛋白α亚基

GADPH.：

甘油醛-3-磷酸脱氢酶

QRT-PCR：

定量实时聚合酶链反应

RPS24：

核糖体蛋白S24

RPS5：

核糖体蛋白S5

tuba.：

α微管蛋白

tub：

β微管蛋白

UBC.：

泛素缀合酶

Ubce2.：

E2 ubiquitin-conjugating酶

UBQ.：

络合剂

作者非常感谢s.s. Navi博士提供的写作帮助和关键修改。

资金

本研究由国家自然科学基金(31760509)资助。

可用性数据和材料

在当前研究期间分析的数据集可以从相应的作者获得合理的请求。

从属关系

1. 内蒙古农业大学农学院，呼和浩特010019

   杨松，燕王，丹丹郭和兰静

贡献

YS参与了数据分析，并帮助起草了手稿。YW参与了研究的设计和协调。DG帮助收集样本和提取RNA, LJ构思研究，进行实验，并主要起草手稿。所有作者阅读并批准了最终文本。

相应的作者

对应到兰静．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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