CONTENMA细胞 - 壁多糖在芹菜中的发育变化（GydF4y2Ba芹菜graveolensGydF4y2BaL.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba)叶柄GydF4y2Ba

芹菜叶柄成熟厚角组织细胞初生壁增厚GydF4y2Ba

结果表明，芹菜叶柄中成熟的亚表皮厚角组织细胞的细胞壁可以描述为加厚的初生细胞壁。没有证据表明细胞停止伸长后细胞壁厚度增加。然而，在芹菜中获得的结果不一定适用于其他物种的角细胞。尽管如此，我们对芹菜的研究结果与Majumdar和Preston的发现是一致的[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba为牛防风的厚角组织细胞壁。GydF4y2Ba

Collenchyma细胞壁表位/多糖分布的时间变化GydF4y2Ba

我们的分析和免疫显微结果表明，丰度和多糖，特别是果胶多糖，发展过程中变化的精细结构。在家庭网关的甲基酯化度的降低被分析示出，并且是由LM19增加标签和由LM20标记下降是一致的。细胞伸长过程中果胶多糖类似的变化已经使用在eudicotyledon机关分析方法和免疫显微报道GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba主要含有实质细胞和表皮细胞与主壁。例如，在上胚轴细胞壁HG的甲基酯化的分析研究表明，更高程度的甲基酯化的，用细胞伸长率更高[相关联GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．详细的免疫荧光显微镜研究GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba茎中不同类型细胞在三个发育阶段的细胞壁显示出LM20标记的下降和成熟过程中LM19标记的增加，特别是在表皮细胞壁[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．在HG的甲基酯化的这种变化可能会影响相邻的HG分子的交联。具有在未甲基酯化可以形成钙离子交桥至少十个连续galacturonosyl残基，即所谓的“蛋箱”相邻结构HG分子[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，导致果胶酸钙连接区和更硬的细胞壁[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．Hgs的甲基酯化防止这些交叉桥的形成，允许相邻的Hg分子的相对运动，从而产生更柔韧的分子，优先膨胀细胞壁膨胀[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．家庭网关在高尔基体合成，然后经由高尔基体囊泡沉积到细胞壁。他们最初具有高度的甲基酯化的[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba，但甲基在细胞壁中逐渐被果胶甲基酯酶(PME)的作用清除。如上所述，这可能导致果胶酸钙连接区的形成，或多聚半乳糖醛酸酶降解非甲基酯化汞[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．在本研究中，我们发现细胞壁的总糖醛酸含量在发育过程中没有显著变化，说明非甲基酯化HG没有显著降解。固相核磁共振测定HG迁移率的降低与果胶酸钙结带的形成相一致。GydF4y2Ba

Our immunofluorescence and immunogold microscopy results indicate that the (1 → 5)-α-L.GydF4y2Ba-一种R.一种B.一世N.一种N.和（1 → 4)-β-D.GydF4y2Ba在厚角组织细胞壁发育过程中，RG-I的-半乳糖侧链也有一定比例的减少。这些结果也表明(1→5)-α-GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-一种R.一种B.一世N.一种N.S.一世D.E.CH一种一世N.S.P.R.E.dominated over (1 → 4)-β-D.GydF4y2Ba-半乳糖侧链贯穿整个开发过程。对完全伸长叶柄厚角组织细胞壁多糖的连锁分析表明(1→5)-α-的优势GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-阿拉伯烷基侧链[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．RG-I侧链比例的降低可能是由于新合成的RG-1上侧链的减少或这些侧链的部分酶降解所致。前人对其它真双子叶植物初生壁的研究表明，在细胞分裂过程中(1→5)-α-的比例较高GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-阿拉伯糖侧链相对于(1→4)-β-半乳糖侧链，而在伸长细胞中则发现相反。例如，免疫荧光显微镜研究显示(1→5)-α-GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-arabinan被LM6识别，位于胡萝卜(GydF4y2BaDaucus Carota.GydF4y2Ba）根尖[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba),GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba根(GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]，而(1→4)-β-GydF4y2BaD.GydF4y2Ba-半乳糖被LM5识别，定位于马铃薯伸长细胞的初生细胞壁(GydF4y2BaSolanum Tuberosum.GydF4y2Ba）Stolons [GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．在这些植物中，当细胞扩张停止或减缓时，LM6和/或LM5标记下降[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．(1→5)-α-的具体作用尚不清楚GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-一种R.一种B.一世N.一种N.和（1 → 4)-β-D.GydF4y2Ba- 在原发性细胞壁中的盐粘侧链，但它们的比例的调节可能会影响墙壁力学。已知两种类型的侧链是高度移动的，并且可能赋予果糖对果糖的水结合特性[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．此外，这些侧链中有一小部分是非共价连接到纤维素微纤维上[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．P.R.E.vious studies suggested that (1 → 5)-α-L.GydF4y2Ba-阿拉伯人有助于薄壁细胞壁的灵活性[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．因此，(1→5)-α-的比例较高GydF4y2BaL.GydF4y2Ba芹菜角组织壁发育早期-arabinan RG-I侧链有助于保持壁的弹性，有利于壁的扩张。GydF4y2Ba

从分析数据来看，芹菜角组织细胞壁中纤维素的比例在发育过程中增加。用LM15和LM11分别特异性检测木葡聚糖和杂氧聚糖的免疫荧光和免疫金显微镜也表明，这些多糖的比例在发育过程中有所增加。这种增加可能是由于这些多糖交联了纤维素微纤维，从而导致细胞壁更粘连、更硬。较低比例的纤维素，木葡聚糖和杂氧聚糖在早期的发展可能导致更灵活的壁有利于细胞伸长。尽管甘露糖的比例显著增加的单糖组成细胞壁从第一阶段到第四阶段,免疫荧光显微镜显示在第二阶段最标签,但是标签是薄弱的发展阶段,很难确定heteromannan发生的变化。GydF4y2Ba

厚角细胞壁表位/多糖的时空分布GydF4y2Ba

与LM19和LM20免疫显微镜显示没有在芹菜厚角壁相反HG果胶多糖的层状分布到组织化学研究的证据使用钌红和碱性羟胺氯化铁染色[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．然而，免疫元片显微照片在ColloChyma壁中显示了交替的电子朗讯和致密的薄片（例如，图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba），其可能由以不同角度定向的纤维素微纤维引起（参见图1GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.与LM19一样的另一种单克隆抗体Jim5还识别出非 - 甲基酯化的Hgs，也含有低甲基酯，也标记在番茄叶虫中的Collenchyma细胞壁，但是使用免疫荧光显微镜的未发现层状分布[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．总的来说，虽然LM19和LM20标记发生在整个芹菜角组织壁，但在免疫荧光和免疫金标记中，中层板层的标记是主要的，这与整个发育过程中高比例的HG存在一致。但在开发过程中甲基酯化程度降低。结果表明，在发展早期，甲基酯化将限制HG-Ca的形成GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}桥（见上文）在中间薄片和中间薄层结，从而允许相邻的年轻细胞相对于彼此滑动，促进细胞伸长[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]．在到期日（第4阶段），在LM20标签和增加在这些位置LM19标记的减少表明导致HG-钙的增强少得多的甲基酯化GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}桥梁，防止相邻电池之间的运动。GydF4y2Ba

不同于HG，使用免疫荧光和免疫金显微镜与LM5(1→4)-β-GydF4y2BaD.GydF4y2BaRG-1的-半乳糖侧链定位于芹菜角细胞的细胞壁，而不是在中间板层和中间板层连接处。相反，使用LM6(1→5)-α-GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-arabinan侧链在中间薄片和中间薄片结以及细胞壁的其余部分被发现了。T.HE.D.一世S.T.R.一世B.utions of both types of side chain did not change during cell elongation (Stages 2–3), but at maturity when elongation had ceased (Stage 4), there were no (1 → 4)-β-D.GydF4y2Ba-半乳糖侧链的LM5标记检测。然而，有些(1→5)-α-GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-arabinan侧链存在，但主要是在内壁区域如由LM6标记表示。与LM5厚角细胞壁的免疫荧光显微镜之前已经报道了番茄叶柄[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]和接骨木（GydF4y2BaSambucus nigra.GydF4y2Ba)干GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．在两个物种中，标记局限于内壁区域;但厚角细胞的发育阶段未见报道。GydF4y2Ba

利用木葡聚糖特异的LM15进行免疫荧光和免疫金显微镜观察，结果表明:在木葡聚糖发育早期(1-3阶段)，木葡聚糖主要局限于中间片层和中间片层连接;这在免疫金标记中表现得尤为明显。在一个未知的发育阶段，用免疫荧光显微镜观察厚角组织细胞壁的LM15，以前曾报道过番茄(GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba)，其标记主要在靠近中层薄片的壁中发现[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．早期使用免疫荧光显微镜的LM15研究[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]和另一种识别木葡聚糖的单克隆抗体CCRC-M86，使用免疫荧光和免疫金显微镜[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]，也表现出木葡聚糖被位于中间薄片在未成熟的番茄果实的果皮的薄壁组织细胞[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．这些观察结果表明木葡聚糖可能在厚角组织和薄壁组织细胞的细胞粘附中发挥作用[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]，可能通过与果胶多糖共价结合[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．在芹菜角组织细胞发育的后期(阶段4)，木葡聚糖在细胞壁中分布更广泛，可能参与维持这些较厚细胞壁的结构。GydF4y2Ba

与LM11，这是具体的杂木，免疫荧光显微镜检测标记只在开发后期，在免疫电镜显示其发生在芹菜厚角壁的增厚区域而不是通过中间层片。这表明杂木都与木葡聚糖比较厚角的墙壁不同的功能角色。杂木先前已经与LM10和LM11使用烟草的厚角细胞壁免疫荧光显微术（检测GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba） [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，它们分别位于牢房角落的内壁和外壁区域。在芹菜角组织壁中，用LM11标记，而用LM10没有标记，表明杂氧基被高度取代。然而，使用免疫荧光显微镜，需要较长的曝光时间来检测这种标记。在我们早期的研究中[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]的糖基连锁分析表明，从完全伸长的芹菜角组织细胞分离的细胞壁，杂氧基被取代约20%。免疫金显微镜发现，与阶段3相比，阶段4的角组织壁中杂氧聚糖的分布更广泛，表明它们与木葡聚糖一样，可能也有助于保持壁的完整性。GydF4y2Ba

厚角组织壁中的纤维素和同半乳囊藻在发育过程中变得不那么活跃GydF4y2Ba

弛豫时间常数TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba^CGydF4y2Ba和TGydF4y2Ba_1ρGydF4y2Ba^HGydF4y2Ba厚角组织壁中的纤维素在发育过程中变得更加坚硬。纤维素是初生细胞壁中最坚硬的组分，其硬度可受到自聚集和与其他细胞壁组分交联的影响[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]．在显影期间的木糖葡聚糖和杂氧基的比例增加可以伴有更多这些多糖与纤维素结合，并且可能考虑纤维素的一些增加的刚性。增加放松时间常数tGydF4y2Ba_1ρGydF4y2Ba^HGydF4y2Ba和TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba^CGydF4y2Ba占主导地位的HG的信号表示开发过程中家庭网关也变得更加刚性的，虽然比纤维素程度较轻。这可能是通过钙离子离子键的形成的结果，产生更刚性的果胶酸凝胶〔GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]．在TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba^CGydF4y2Ba甲酯的值和HG的乙酰基是也可能更刚性的果胶酸凝胶的形成的结果。在厚角的发展，TGydF4y2Ba_1ρGydF4y2Ba^HGydF4y2BaHG共振在101和69 ppm时的衰减从单指数变为双指数，表明HG微环境的异质性增强[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba在细胞壁中。相反，在TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba^CGydF4y2Ba在C-6（65,62ppm）的纤维素中的快速和缓慢组分可能反映位于纤维素微纤维表面和内部的纤维素分子的迁移率异质性，源自不同的构象[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba或与非纤维素壁多糖的相互作用[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]．我们没有研究RG-I侧链(1→5)-α-的迁移率的变化GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-一种R.一种B.一世N.一种N.和（1 → 4)-β-D.GydF4y2Ba厚角组织发育过程中-galactan，因为它们是非常灵活的，太移动要由CP / MAS可靠地计量。直接偏振已被发现是有效的，从这些移动侧链[采集信号GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba，但由于其与刚体和半刚体结构的信号重叠，不能用于弛豫时间的测量。GydF4y2Ba

我们的研究证实了芹菜角组织壁是唯一的初级细胞壁。通过对芹菜角组织发育4个阶段细胞壁的分析研究和免疫显微镜观察，发现在发育过程中，组成部分细胞壁多糖的比例、精细结构和位置都发生了变化。利用固体核磁共振波谱，我们还发现纤维素和HGs在发育过程中流动性下降，这与角组织细胞壁在伸长停止时变得更硬一致。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

芹菜 （GydF4y2Ba芹菜graveolensGydF4y2BaL.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba，'探戈'）从新西兰克拉克苗圃有限公司的一个未加热的玻璃厅种子生长（地理位置37°20'，174°88'e），并在六个月的增长后收获。将叶柄分离，洗涤并将其分为四个开发阶段的基于叶柄长度（从底座记录到第一宣传叶结）：第1阶段（2-5cm），2阶段（10-15cm），第3阶段（20-25 cm）和第4阶段（35-40厘米）。不同阶段的Collenchyma细胞具有不同的长度和壁厚。以前的研究表明，芹菜中的叶柄长度与Collenchyma细胞发育密切相关[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．在阶段1和2处的叶柄从束的内部区域获得，阶段3的叶柄是来自束的中间，并且在阶段4的叶柄来自束的外部区域。从整个叶柄（用于组成分析）或沿着叶柄中途取出副表皮癌股线（用于所有其他工作）。GydF4y2Ba

要确定是否厚角壁增厚持续细胞已停止伸长后发生，叶柄从另一品种，“三八”，在同一地点的品种“探戈”，但在室外种植四个月检查。这是假设的厚角细胞中表现相似的两个品种。叶柄检查几乎完全伸长，但仍延长。三种芹菜植物用（A，B，C）。On each plant, four petioles (petioles 1, 2, 3, 4, lengths 26–33 cm) were selected from the outer region of the bundle. On day 1, marks were made at intervals of 5 cm along the petioles with a waterproof, fine-tipped black marker pen. On the same day, a collenchyma strand was taken from the midway portion of petiole 1 from each plant and was processed (see below) to measure collenchyma cell length, width and wall thickness. The distances between the marks were recorded on days 5, 8, 11 and 16, and collenchyma strands were taken as before from petioles 2, 3, and 4 on days 8, 11 and 16, respectively. The lengths of petioles used to sample collenchyma strands continued to be measured after sampling.

长度和厚角细胞的宽度的测量GydF4y2Ba

用钳子小心地将四个不同发育阶段的厚角组织束(约5mm长)从中间沿叶柄分离，用甲苯胺蓝O溶液(0.1%，w/v)染色，并在亮视野显微镜下观察。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．使用Image J (NIH, New York, USA)的图像测量不同发育阶段的细胞长度和宽度。在两个品种的每个厚角组织中，检测了15-20个细胞。测定平均长度和宽度(±SD)。使用SPSS Statistics 22 (IBM Corporation, Armonk, NY)进行统计分析，采用单因素方差分析。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba≤0.05为有统计学意义。GydF4y2Ba

测量Collenchyma细胞壁厚度GydF4y2Ba

厚角组织束(长约5 mm)沿叶柄横切成短段(长1 ~ 2 mm)，用含有2.5% (w/v)戊二醛的100 mm磷酸钾缓冲液(pH 7.4)固定2 h，用相同的缓冲液洗涤，然后用1% (w/v) OsO水溶液固定GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba2 h。与缓冲,洗后段在一个水乙醇脱水系列(30、50、70、85、90,100%的两倍),渗透与丙酮5分钟,丙酮和环氧树脂的混合物采购812 (ProSciTech Thuringowa中央,昆士兰,澳大利亚)(1:1,v / v)为1 h和纯树脂24 h转子。将切片放入新鲜树脂中，在60℃下聚合48小时。横切面(70 nm厚)用超切片机(型号EM UC6，徕卡，维也纳，奥地利)用金刚石刀切割，收集在200目铜网格(ProSciTec)上，用2% (w/v)醋酸铀酰水溶液染色20分钟，柠檬酸铅[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba] for 4 min before being examined with a transmission electron microscope (Model Technai 12; FEI, Hillsboro, OR, USA) at an accelerating voltage of 120 kv. The resulting images were used to measure collenchyma cell-wall thickness. At each developmental stage of cultivar ‘Tango’, the maximum wall thickness of 10–12 collenchyma cells was measured. For cultivar ‘Triple Eight’, both maximum and minimum wall thickness of ~ 15 cells was measured in each collenchyma strand. Statistical analysis of the data was conducted as above.

细胞壁的分离和单糖组合物的测定GydF4y2Ba

如Melton和Smith所述，细胞壁被分离[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]加上修改[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．简言之，将来自不同长度的叶柄厚角链（阶段1-4;见上文）在缓冲液中进行匀浆，收集细胞壁上尼龙网，洗涤，透析，并冻干。CE.L.L.walls were hydrolyzed with 2 M trifluoroacetic acid (TFA) [53GydF4y2Ba那GydF4y2Ba54GydF4y2Ba或采用HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba，得到的中性单糖被还原、乙酰化，用毛细管气相色谱法分析。总糖醛酸用GydF4y2BamGydF4y2Ba羟基二苯方法[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba以d -半乳糖醛酸为标准品。所有测定均为三份。GydF4y2Ba

果胶多糖的甲基酯化度(DM)GydF4y2Ba

如通过McFeeters和阿姆斯特朗[所述测定果胶多糖的DMGydF4y2Ba57GydF4y2Ba]有修改。Briefly, freeze-dried cell walls (~ 3 mg) were saponified overnight at 4 °C in a mixture of 50 mM citric acid containing 1 M sodium chloride (25 μL), water (225 μL) and 1 M sodium hydroxide (20 μL). The slurry was neutralized with 82.5 mM citric acid (30 μL) followed by the addition of 25 mMN.GydF4y2Ba-丙醇(33.3 μL)为内标。离心(20,000×g, 5分钟)后，用SGE™BP20色谱柱(15 m长，0.32 mm i.d, 0.25 μm膜厚)(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)对等量(1 μL)的上清进行毛细管气相色谱分析。DM按甲醇(mol)/ UA (mol) × 100%计算。对重复样本进行了分析。GydF4y2Ba

细胞壁多糖的间接免疫荧光检测GydF4y2Ba

这是基本上完成的，如Zhang等人所述。[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]．T.R.一种N.S.verse segments (1–2 mm long) were cut midway along petioles at the four different stages of development, and fixed in 100 mM sodium PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) buffer (pH 7.2) containing 2% (w/v) paraformaldehyde and 0.1% (w/v) glutaraldehyde for 2 h at room temperature under vacuum. After washing with buffer only, the segments were dehydrated using an aqueous ethanol series (30, 50, 70, 85, 90, and 100% twice) for 15 mins at each concentration. They were then infiltrated for 1 h at room temperature with a 2:1 (v/v) mixture of ethanol and LR White resin (medium grade) (London Resin Co. Ltd., Basingstoke, UK) followed by a 1:2 (v/v) mixture of ethanol and resin for 1 h, and finally in pure resin for 18 h. They were then placed in gelatine capsules containing fresh resin and polymerized at 60 °C for 24 h.

横切面(200 nm厚)用金刚石刀在超微切片机上切割(见上文)，转移到聚l -赖氨酸涂层载玻片(Biolab Scientific, Auckland)，并在55°C下干燥30分钟。将非特异性结合位点置于含有140 mM NaCl (PBS)和5% (w/v)奶粉(MP-PBS)的10 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中室温孵育1 h。然后用PBS (4x)冲洗切片，70 rpm摇晃，然后用单克隆抗体(20 μL) (PlantProbes, Leeds, UK)在MP-PBS中孵育2小时。使用了以下单克隆抗体:特异性为(1→4)-β-的LM5GydF4y2BaD.GydF4y2Ba-galactans [GydF4y2Ba18GydF4y2Ba];L.M6, specific for (1 → 5)-α-L-arabinans [59GydF4y2Ba];LM19，专用于非或低甲基酯化汞[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba];LM20，具体为更高度甲基酯化HG [GydF4y2Ba60GydF4y2Ba];LM10，特异于未取代或低取代(1→4)-β-GydF4y2BaD.GydF4y2Ba-xylans [GydF4y2Ba61GydF4y2Ba];L.M11, specific for more highly substituted (1 → 4)-β-D.GydF4y2Ba-xylans [GydF4y2Ba61GydF4y2Ba];LM15，特定于木糖葡聚糖[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba];LM21，异甘露聚糖专用[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba]．LM19和LM20稀释1：5（V / V）中的MP-PBS在使用前，和其他初级抗体稀释1:10（V / V）中的MP-PBS。After washing with shaking in PBS (5x), the sections were incubated with the secondary antibody goat anti-rat (H + L) conjugated to Alexa Fluor® 546 (ThermoFisher Scientific) (20 μL, 1:200 dilution) in MP-PBS at room temperature for 1.5 h in the dark. After washing (with shaking) with PBS (5x), the sections were stained with 0.03% (w/v) Calcofluor White (Fluorescent Brighter 28 sodium salt, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) for 5 min in the dark, washed (with shaking) with PBS (3x) then water (2x), mounted in AF1 antifadent (Citifluor Ltd., London) and examined with a light microscope equipped for epifluorescence microscopy (Nikon Eclipse Ni-U microscope; Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA). The filter sets used were as follows: for Alexa Fluor® 546 fluorescence, the TRIC filter set (excitation filter BP 530–560 nm; chromatic beam splitter 570 nm, and emission filter BP 590–650 nm); for Calcofluor White fluorescence, the DAPI filter set (excitation filter BP 325–375 nm; chromatic beam splitter 400 nm, emission filter BP435–485 nm). Control experiments were done with the monoclonal antibody omitted. For each antibody, the same exposure time was used for all developmental stages.

For some experiments, sections were treated in one of the following two ways before non-specific binding sites were blocked: with 0.1 M Na_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba(pH为11.4)室温下2 h去除汞中的甲酯;0.1 M NaGydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba处理2 h后，用果胶酸裂解酶(10 μg/mL)处理GydF4y2BaCellvibrio Japonicus.GydF4y2Ba那Megazyme International, Bray, Ireland) in 50 mM N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS) buffer (pH 10) containing 2 mM CaCl_2GydF4y2Ba在室温下2小时去除汞[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．同时进行了0.1 M Na处理的对照试验GydF4y2Ba_2GydF4y2BaCO.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba接着CAPS缓冲液含氯化钙GydF4y2Ba_{2，GydF4y2Ba}但没有果胶酸裂解酶。GydF4y2Ba

细胞壁多糖的免疫间接检测显微镜GydF4y2Ba

这是基本上完成的，如Zhang等人所述。[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]．在200目镍网格(ProSciTech)上收集横切面(100nm厚)，其中一些横切面经过预处理，从汞中去除甲酯或如免疫荧光显微镜所述去除汞。切片被阻断，摇洗，用免疫荧光显微镜中描述的单克隆抗体孵育，但在4°C下过夜，然后用PBS(5倍)摇洗。切片与二抗山羊抗大鼠IgG (H + L)结合到15 nm直径的胶体金颗粒(电子显微镜科学，Hatfield, PA，美国)(在mpp -PBS中稀释1:10)室温孵育2小时，用PBS(5倍)和水(2倍)洗涤(摇匀)。切片用2% (w/v)醋酸铀酰水溶液染色20分钟，用水(6次)洗涤，干燥，如上所述用透射电镜检查。对照实验中省略单克隆抗体。GydF4y2Ba

固态GydF4y2Ba^13GydF4y2BaC核磁共振光谱学GydF4y2Ba

CP/MAS固体核磁共振谱是由Bootten等人描述的[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．使用80％（v / v）乙醇，在4mm直径的氧化锆转子中填充，将冷冻干燥的Cws再水水加入65％（w / w）的含水量，并用kel-f端盖保持。在Bruker魔法角旋转双调探针中，样品在4 kHz下旋转GydF4y2Ba^13GydF4y2Ba使用Bruker Avance III 500 MHz光谱仪在75兆赫兹进行C NMR波谱分析。CP/MAS实验中，90°质子制备脉冲为4.2 μs, CP接触时间为1 ms，数据采集时间为51 ms，重复序列前的恢复延迟为1 s。总共使用了12,000个瞬态。GydF4y2Ba

T.HE.R.E.L.一种xation experiments were conducted with 4 kHz MAS at room temperature. Proton T_1ρGydF4y2Ba根据Hediger等人进行。[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]，使用400 μs的接触时间，每次延时12,000次扫描。碳TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba如由托尔基亚[所述测量GydF4y2Ba63GydF4y2Ba]．弛豫延迟分别为20、10、100、300、500、1、2.5、5、10、20 s。每次延迟使用3800次累积。在OriginPro 8 (OriginLab, Northampton, MA, USA)中，用单指数或双指数函数拟合了相对峰值强度和松弛时间之间的衰减模式。GydF4y2Ba

帽子:GydF4y2Ba

N-环己基-3-氨基丙磺酸GydF4y2Ba

CP / MAS NMR:GydF4y2Ba

用魔法角旋转核磁共振交叉极化GydF4y2Ba

玫瑰:GydF4y2Ba

(4) - 2-Hydroxyethyl piperazine-1-ethanesulfonic酸GydF4y2Ba

HG：GydF4y2Ba

homogalacturonanGydF4y2Ba

PBS:GydF4y2Ba

含有140mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液（pH7.4）GydF4y2Ba

管道：GydF4y2Ba

1,4-哌嗪酸GydF4y2Ba

PME：GydF4y2Ba

果胶methylesterasesGydF4y2Ba

RG-I：GydF4y2Ba

鼠李我GydF4y2Ba

RG-II：GydF4y2Ba

rhamnogalacturonan二世GydF4y2Ba

T.GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba^CGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

旋转晶格松弛时间常数GydF4y2Ba^13GydF4y2BaCGydF4y2Ba

T.GydF4y2Ba_1ρGydF4y2Ba^HGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

质子的旋转架弛豫时间常数GydF4y2Ba

组织:GydF4y2Ba

三氟乙酸GydF4y2Ba

作者感谢Stan Clark提供的芹菜。艾德里安特纳博士和凯瑟琳女士的帮助下Hobbis显微镜,太太Sreeni Pathirana与单糖分析,博士Roswitha施罗德先生Roneel Prakash测量甲基酯化程度的汞、苗博士张immunomicroscopy和Kevin Chang先生与统计分析。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项研究是由奥克兰大学资助的。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

支持本文发现的补充文件列在附加文件部分(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S1，附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2，附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S3，附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S4，附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:图S5，附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：图S6，附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:图S7)。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 奥克兰大学化学科学学院，私人袋92019，奥克兰邮政中心，奥克兰，1142，新西兰GydF4y2Ba

   大辰，劳伦斯D. Melton＆Zoran ZujovicGydF4y2Ba

2. 奥克兰大学生物科学学院，私人袋92019，奥克兰邮政中心，奥克兰，1142，新西兰GydF4y2Ba

   菲利普·j·哈里斯GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

PJH，LDM和DC设计的项目。DC进行了大部分的实验和分析结果。ZZ和DC预制的固态NMR实验。所有作者均贡献稿件的写作和批准的最终版本。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba菲利普·j·哈里斯GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba