蛋白质分析表明，野生苋菜和栽培苋菜在胚胎发生后期丰富和贮藏蛋白质的积累上存在差异

背景

苋菜是一种天然抗拒各种类型的压力的植物，可产生优异的营养品质的种子，因此苋菜是一种用于食品生产的有希望的系统。苋菜野生亲属在气候变化中幸存下来，并在恶劣的条件下生长，但没有关于其种子的形态学和分子特征的研究。因此，我们进行了野生物种的详细形态和分子表征答:powellii和答:hybridus，并将其与培养的苋菜物种进行比较A.次沉晶杆菌（蜡质和非蜡质种子）和A. Cruentus。

结果

根据它们的极性性能分离种子蛋白，并在一维凝胶电泳（1-de）中分析，然后用纳米液相色谱法偶联至串联质谱（NLC-MS / MS）。共检测到34个差异累积的蛋白质带，成功鉴定了105个蛋白质。将晚期胚胎发生丰富的蛋白质被检测为物种特异性。优先观察到oleosins和油体相关蛋白质答:cruentus．颗粒结合的淀粉合酶I的不同亚型，以及一些7S和11S球蛋白的平行对数也被鉴定。对不同亚型11S球蛋白进行了硅结构分析，包括目前未报道的新型11S球蛋白。

结论

结果提供了大约11S种球蛋白和蛋白质在种子保护中的新信息，这可能在营养价值和苋菜物种中应激的适应性耐受性起到重要作用。

粮食安全受到两方面的威胁:人口增长(估计到2050年将达到93亿左右)，以及气候变化和土壤恶化造成的作物损失[1那2］．种子是作物生产、人类营养和粮食安全的中心[3.那4.，它们含有植物的全部基因补体，使其即使在长时间的逆境条件下也能生存[5.那6.］．那么重要的关注收集和保存种质的商业物种以及它们的野生亲戚,幸存下来的几个气候变化和遗传信息的有价值的资源可能是有用的作物育种发展的策略来解决当前和未来农业的挑战[1那3.那4.］．

正常的种子能够在去除细胞水分后存活下来，并能在干燥状态下保存很长一段时间。种子脱水耐性和休眠状态的维持与广泛的细胞保护、解毒和修复系统有关[6.那7.］．特定蛋白质如晚胚胎发生的蛋白质（Lea）蛋白，热休克蛋白（HSP）和种子储存蛋白（SSP）赋予种子干燥耐受性，使它们在干燥状态下保存它们的萌发能力和繁殖-term存储条件[8.那9.］．

建议Lea蛋白在种子干燥耐受中发挥重要作用[10[众所周知，他们众所周知，稳定膜，抵抗干燥的有害影响。此外，租赁能够在冷冻和干燥过程中预防蛋白质聚集并与干燥状态相互作用并稳定脂质体[11］．一些LEAs可以稳定糖杯[12]建议他们在寿命中发挥作用，这是保护遗传资源的关键因素，并确保适当的幼苗建立和作物产量[13］．另一方面，sps是人类膳食蛋白质的主要来源。sps除了作为营养库外，还可在种子形成过程中发挥特定的功能[7.那14并可能在种子寿命方面发挥关键作用[15］．sps在种子萌发和幼苗生长中起着基础性作用[16］．由于它们的丰度和高氧化倾向，SSPs被认为是一种强大的活性氧(ROS)清除系统，可以保护对胚胎存活重要的细胞成分[17那18］．

苋菜是一种非常重视阿兹特克，玛雅和印加文化的作物。然而，由于与异教仪式的联系，西班牙人禁止培养[19］．尽管如此，在过去的二十年中，关于苋菜营养和营养营养特征的报告增加，导致苋菜培养史上的新时代[20.］．苋菜作为人类营养作物的重要性是由于其蛋白质的高品质。苋菜种子蛋白质含有必需氨基酸的足够平衡[21]，值接近营养人类需求，特别是富含赖氨酸和蛋氨酸的值，分别缺乏谷物和豆类[20.那22］．此外，洛昔烷烃的含量，用于腹腔疾病的表现的SSP分数封入，可以忽略不计或实际为空[23］．属苋菜由约70个品种组成，按气候条件和地理位置来看，它们分布在不同的生境[24那25]，其中只有三种物种，答:caudatus那A. Cruentus，和A.次沉晶杆菌被培养为人类消费的粮食苋菜，最后两个是墨西哥的原产化[26］．这些物种最有可能的祖先或野生近亲是答:powellii和答:hybridus在墨西哥领土的恶劣条件下增长。苋菜的广泛自然变化提供了识别对种子营养，保护和长寿来说重要的标记，这将导致高生产率的品种发展。

本研究旨在研究野生植物种子的形态和分子特征答:powellii和答:hybridus并将它们与培养的苋菜物种进行比较A.次沉晶杆菌和A. Cruentus。种子表型分析通过显微镜观察和分子表征使用蛋白质组学工具（1 -DE和NLC-MS / MS）以及硅分析进行。

苋菜野生种呈现无蜡表型

观察了不同种苋菜种子的表型差异。野生种的种子是亮黑色的，而栽培种的种子是奶油色的(图。1)．答:powellii包含最小的种子而答:hybridus和答:cruentus是最大的。种子横切显示为野生种答:hybridus和答:powellii半透明的;栽培物种答:cruentus有不透明的种子A.次沉晶杆菌品种的区别是由于它们的半透明和不透明的特性(图。2一种）。种子碘染色突出了淀粉Perisperm内的结构（图。2b).野生物种和A.次沉晶杆菌CV Cristalina染色紫色 - 蓝色对应于具有高直链淀粉含量的非蜡质线，而不透明物种染色对应于具有低直链淀粉含量的蜡质线。通过SEM显微镜观察种子横截面（图。3.）表明其实答:hybridus那答:powellii,A.次沉晶杆菌crisstalina变种的外胚乳具有多面体结构，而变种的外胚乳具有多面体结构答:cruentus简历Amaranteca,A.次沉晶杆菌简历Nutrisol和A.次沉晶杆菌CV opaca没有显示苋菜淀粉颗粒的典型多面体结构。

蛋白质疏水性分数对蛋白质含量和电泳剖面的影响

为了实现更高的种子蛋白覆盖用于分析，使用基于蛋白质极性的连续方法进行提取[27］．结果表明,A.次沉晶杆菌CVS OPACA和NUTRISOL具有更多的亲水性蛋白质（图。4.)．但蛋白质总含量的差异主要体现在疏水蛋白组分的数量上，因此答:powellii的蛋白质含量最高(173.5毫克/克)，其次是A.次沉晶杆菌CV Cristalina和答:hybridus(分别为147.9和140.8 mg/g)。答:cruentus是具有最低总蛋白质含量的物种（108.8mg / g）。

亲水性组分的电泳图谱显示了从10 kDa以下到220 kDa以上的所有分离范围内的蛋白条带(图1)。5.一个，附加文件1:图S1)。在33、37和52 kDa处观察到最强烈的条带。疏水组分的谱带数量较少，主要有三组，一组在20 ~ 24 kDa之间，一组在32 ~ 35 kDa之间，最后一组在50 ~ 70 kDa之间形成了一个高度可变区域(图)。5.b，附加文件1:图S2)。在这部分中，物种间条带的存在或缺失(用黑色箭头标记)比亲水性部分更明显。直方图表示某些选定的蛋白条带积累的差异。

差异累积的蛋白质反映了苋菜物种之间的关系

从凝胶中切除差异积累的蛋白条带(图。5.）通过NLC-MS / MS成功识别（表1，附加文件2:表S1)。在大多数情况下，在一个条带中可以识别出多个蛋白质。根据基因本体(GO)生物过程注释对鉴定的蛋白进行分类。在亲水性组分中，差异积累的蛋白质与种子发育和萌发、碳水化合物代谢、胁迫和防御反应等功能有关(图1)。6.一种）。疏水性级分中的差分累积蛋白条带由与种子发育和萌发，碳水化合物代谢，氨基酸的生物合成，氨基酸的生物合成，以及鞘膜炎稳态有关的蛋白质代表（图。6.b)。

利用种子蛋白质含量信息和差异累积条带强度，进行主成分分析(PCA)和聚类分析(AHC)。PCA图显示，两个主成分占变异的63.34%(图3)。7.a).这两个主要成分将野生物种归为同一象限，答:cruentus位于一个象限附近A.次沉晶杆菌(Opaca和Cristalina)和栽培最多的物种A.次沉晶杆菌CV Nutrisol最远离其余的物种。AHC树枝图清楚地表明了答:powellii和答:cruentus有一个密切的关系以及答:hybridus和A.次沉晶杆菌CV Cristalina（图。7.b)。

Lea蛋白是特异性的

鉴定了晚期胚胎发生丰富的蛋白质（丝束）的不同副鸟（表1，附加文件1：表S2）。在频段3中，累积了A.次沉晶杆菌cv Cristalina检测到1个LEA (AHYPO_013747);在第4波段(累积在鲍利和克鲁图斯)检测到胚型DC-8样(AHYPO_000638)，并在6波段，观察到在答:hybridus和减少答:powellii，lea（ahypo_001171）被检测到。在带14中鉴定含有种子成熟蛋白（SMP）基序的两种Lea蛋白（AHYPO_006906和AHYPO_016810），野生物种中的积累减少。在乐队19和24中，来自答:cruentus和答:powellii仅鉴定出一个与LEA对应的蛋白AHYPO_008005和AHYPO_019862。这两个蛋白显示了LEA_5结构域，这是最亲水的LEAs之一[28］．有趣的是在任何差分累积的蛋白质乐队中未检测到先前表征的ACLEA蛋白（AHYPO_005092），这与野生和培养的苋菜种群在野生和培养中非常保守的观察结果一致[29］．

不同种间GBBSI和油体相关蛋白的差异积累

不同苋菜属植物的蛋白谱差异最大的是疏水部分，特别是在27、28和29波段(图。5.B，表格1)．在那些条带中，鉴定了颗粒结合淀粉合酶I（GBSSI，AHYPO_011500）的不同蛋白质ord。频段27仅在野生物种中积累（答:hybridus和答:powellii）以及A.次沉晶杆菌cv Cristalina，与观察到的这些物种被分类为非蜡型相关(图。2)．然而，频段28代表答:powellii和答:cruentusCV Amaranteca分别是非蜡质和蜡质表型。通过相反的频段29被检测到答:hybridus以及所有的A.次沉晶杆菌品种。如观察到的，只有较高分子量（带27）的GBSSI与非蜡状表型相关（图。2和3.），因此该蛋白质可以是功能性蜡质酶。

在第17波段，向上累积在答:cruentus，被鉴定为oleosin 5的两个副病毒（ahypo_013707和ahypo_015343）。观察到带12的累积答:hybridus和答:powellii，在该条带中鉴定出两个油体相关蛋白(OBAPs)的副对数。OBAP1 (AHYPO_009953)和OBAP2 (AHYPO_004342);而蛋白13带则在答:cruentus检测到另一个OBAP2。在条带12中也发现了一种vicillin亚型，这与Zhao等人的研究结果一致[30.在大豆油体提取过程中，甘氨酸和β-聚甘氨酸共纯化。

红苋菜球蛋白新杂子的鉴定

在不同的蛋白条带中检测到不同的7S和11S球蛋白的平行对数(见表)1）．含有β-筒或柴油结构结构域的规范7SB（AHYPO_006304），其用作营养储存器，在野生物种（带11）中，以及A.次沉晶杆菌简历。Nutrisol乐队(31)。在大肠杆菌中积累了含有抗菌肽结构域(AHYPO_006202)的青霉素答:hybridus（带33）和答:powellii和答:cruentus(带34)。同时含有cupin和vicilin结构域的7SD球蛋白(AHYPO_18839)在细胞中优先富集答:powellii和答:cruentus（带4到12和14）以及在A.次沉晶杆菌CV Cristalina和CV Nutrisol（带20,30和33）。在沉积和储存过程中，可以通过后翻译蛋白水解加工来解释该蛋白质在不同分子量中的存在[31］．

11S球蛋白Ah11SB (AHYPO_001411)在细胞内积累较少答:hybridus比在答:powellii(34分)但更多A.次沉晶杆菌cv Cristalina(第15组)。豆科蛋白(AHYPO_021282)以其不同寻常的高分子量被命名为Ah11SHMW答:hybridus和A.次沉晶杆菌（频段29）．通过在蛋白质组数据库中搜索，发现了名为AH11Spherich（AHYPO_006768）的第四个11S球蛋白，但在苋菜物种中没有差异累积。

用苋菜和来自属于柴油超家族的其他自宫内的成员构建的系统发育树，其特征在于β-桶结构域的存在[32，表明Ah11SA和Ah11SB非常接近，Ah11SHMW和AhPheRich更接近Beta寻常魅力垂直术，很明显，7S球蛋白在树上形成另一个分支（图。8.)．

在硅分子表征的苋菜11S球蛋白谬误

对苋菜11S球蛋白与典型和著名的大豆11S球蛋白进行了聚类分析(附加文件1：图S3）。所有球蛋白均具有高度保守的结构特征，作为由特定浅氨酰胺内肽酶切割的蛋白水解位点，其产生由二硫键连接的酸性和基本亚基，每个含有柴蛋白B.-barrel域（附加文件1:图S4)。然而，与典型的Ah11SA相比，在结构上存在一些差异(图。9.)．Ah11SB具有较大的酸性链和较短的碱性链。球蛋白命名为Ah11SPheRich，因为在初级结构水平上，与其他球蛋白(2.8 - 5.2%)相比，Phe(17.1%)的百分比较高(附加文件1：图S5）。Ah11shmw是高分子量的球蛋白，显示最大的酸性链（图。9.)．Ah11SHMW一级结构分析显示，在酸性亚基中有18个氨基酸残基片段重复9次(附加文件)1:图S6)。该片段在SMART和Pfam服务器中被鉴定为CTD结构域，参与转录本伸长过程和mRNA加工的调控，但目前尚无包含该结构域的11S球蛋白的报道，其生物学功能也未见报道。

在苋属植物中，只有典型的11S球蛋白(疏水组分中最丰富的蛋白质之一)通过x射线晶体学在结构水平上进行了表征，并将其命名为Ah11SA, PDB标识符3QAC [33(图。10a).通过同源建模得到所有苋菜11S球蛋白的三维结构，并与Ah11SA进行比较。模型给出了豆科蛋白单体的β-桶状结构域和α-螺旋结构域(图)。10与Ah11SA比较，Ah11SB、Ah11SHMW和Ah11SPheRich的RMSD值分别为0.382、0.777和0.820，表明这些蛋白具有结构同源性。模型中的黄色圆圈表示链内(IA)和链间(IE)二硫键。Ah11SHMW中的橙色非结构区域代表高度暴露的ctd样结构域。紫红色球蛋白结构的两个面(IA和IE)的疏水性和库仑表面如图所示。11．11S球蛋白疏水残基主要位于IA面中部(橙色区域)，但疏水表面在Ah11SPheRich等不同的疏水残基之间发生变化，这与其高的Phe含量有关。

苋菜因其农艺和营养特性而备受关注。然而，只有少数品种，从各种各样的可用，是栽培的种子生产。野生苋菜近亲在不同的环境下生存了数千年，例如盐碱地、高温、紫外线辐射和缺水[26］．因此，它们被认为是参与植物抗性的有用基因/蛋白质的重要储藏库[24那25］．然而，野生苋菜属植物的形态学和分子特征尚未见报道。

虽然答:powellii产生最小的种子，这是蛋白质含量最高的物种，而答:cruentus是一种栽培物种，是具有最低值的物种。因此，答:powellii代表了一个有趣的选择，作为一个信息来源，可用于提高栽培作物的蛋白质含量。在水稻品种(选用表明野生物种比驯化物种含有更高的蛋白质含量，这种差异归因于谷蛋白部分[34］．众所周知，苋菜中的谷蛋白是一种重要的种子贮藏蛋白组分，根据提取条件的不同，谷蛋白占种子总蛋白的23 - 42% [35］．在50 ~ 70 kDa的波段组以前已经检测到在栽培苋菜的品种中存在差异积累。因此，该蛋白质片段被建议作为鉴定苋菜种质的工具[36那37］．

在正常的种子中，LEA蛋白与脱水耐性和静止状态的维持有关。根据氨基酸序列和保守基序，LEAs可分为5 ~ 9个亚类[38］．某些LEAs的丰度与种子寿命之间有良好的相关性已被报道[5.那39］．通过在苋菜数据库中搜索，确定了具有特定主题的39 lea蛋白序列（附加文件1：表S2），但只发现其中一些中的一些累积在物种中差异累积。检测到胚胎DC-8和lea_5组优先积累答:powellii和答:cruentus．在胚胎发生期间检测到DC-8蛋白，并且在胚乳组织的细胞壁中检测到，但其功能仍然尚不清楚[40那41］．SEA_5和SMPS是与水胁迫耐受相关的蛋白质[42]， SMP在野生物种中积累较少(答:powelli和答:hybridus)，但优先积累的栽培物种，这是有趣的，因为答:cruentus含有lea_5和SMP蛋白质，是一个可以在严重的水赤字下生长的一种物种[25那26］．

OBAPs(13、31、32)和两条副反应蛋白(17)的含量较高答:cruentus．研究表明，obap参与油体的生物成因、稳定性、运移和动员[43］．油皂甙作为天然乳化剂，保护植物脂质储备免受氧化和水解，直至种子萌发和幼苗建立[44］．某些油酸的假定作用与控制脂质体的大小和维持其完整性有关[45］．据报道，这是一个答:芥OBAP1缺陷突变体的脂肪酸组成发生变化，发芽率降低，种子甘油三酯含量降低[46］．因此，OBAP1和OBAP2的差异积累可能与苋菜种间脂肪组成的数量和质量有关。这些观察结果与野生和栽培苋菜中脂肪酸和碳氢化合物(如角鲨烯)的相对丰度相关[47］．

GBSSI，又称蜡状蛋白，是一种葡萄糖基转移酶，是营养储存组织中唯一负责直链淀粉聚合物伸长的酶[48］．Park等人。[48]分析了蜡状苋菜的轨迹显示出外显子6的编码区中的无意义突变答:cruentus外显子10A.次沉晶杆菌过早结束翻译并引起完全丧失基因功能，导致蜡状表型。然后在带28和29中鉴定的GBSSI可以对应于非功能截短的酶。Ahuja等。[49据报道，在小麦开发期间，GBSSI大大影响了淀粉积累和葡聚糖链长度分布。众所周知，高直链淀粉含量可以通过形成含有脂质的包合物的抗性淀粉（RS）有助于抗性淀粉（RS）[50］．Zhou et al. [51]提出了一种机制，其中蔗糖合成酶III（SSIIIA）的缺陷和GBSSI的存在可能是RS积累的负责。

SSP在种子开发期间积累，以发芽和早期幼苗生长期间氨基酸来源，代表食品和饲料消耗的主要来源。球蛋白是双岩葡萄球菌植物中最丰富的SSP，并且基于7S或Vicilins的沉降系数和11s或豆类的沉降系数分为两组[31］．的A.次沉晶杆菌数据库中包含13个不同的7S球蛋白序列，成员分别属于三种不同的类型，并根据其结构域进行分类(附加文件)1：表S3）。其中只有三个在苋菜物种中累积。含有抗微生物结构域的7S在野生物种中是代表性的，以及答:cruentus，另一方面，典型的铜杯型更具有代表性A.次沉晶杆菌物种。

11S球蛋白或豆科蛋白是自然界中分布较广的类大豆蛋白，由多基因家族编码。大豆11S球蛋白或甘氨酸由五个不同的单体组成，每个单体由不同的基因编码[52］．在苋菜中，报告并表现了典型11S球蛋白[53］．在这里，我们检测到野生和培养的苋菜中的两个副蛋白酶差异累积（表1，附加文件2：表S1）。通过数据库搜索在AH11SHMWGlobulin中的数据库中识别的CTD样域具有一些特殊功能：所有这些重复都有保守的Ser和Tyr，可以通过磷酸化参与信号传导过程;他和Arg，带正电荷的氨基酸，这会根据pH变化影响蛋白质的溶解度和组装蛋白质;和两种亲，氨基酸称为二级结构断路器。该领域可能患有一些后期改变的修饰，并在种子中具有一些生物学活性，但应该在这个方向上进行进一步的工作。

最近，由于不同副对数的存在，以及其中一些副对数不仅是营养库，而且还参与种子发育或萌发过程中的其他功能，因此副对数的重要性有所增加[18］．报道了11S球蛋白的新功能，其中萌发过程中的萌发过程中，pH的变化诱导六甲醇解离及其释放，表明球蛋白作为激素稳态中的新型球员[54］．SSP的新作用已被报告为缓冲蛋白，免受氧化应激，这可能意味着种子长寿中的重要作用[7.那16那17］．

蛋白质的表面性质，主要是疏水性和电荷分布是非常重要的，因为它们决定了分子的物理化学功能[55］．苋菜豆科蛋白的三维结构模型与典型的11S球蛋白具有相似的特征，但它们具有一些特殊的特征，例如表面带电残基和疏水残基分布的变化，这可以赋予每个豆科蛋白不同的功能特性，比如溶解度或与其他分子形成相互作用的能力。这些红苋菜11S球蛋白之间的物理化学差异与两个主题有关，首先是作为稳定食品系统添加剂的应用，其次是对种子发育和萌发等生物过程的影响。

这是首次报道野生苋菜与栽培苋菜的分子特性。种子电泳图谱是检测野生和栽培物种中几种蛋白质积累差异的非常有力的工具。有趣的是，蛋白质积累曲线表明答:powellii有更紧密的联系吗答:cruentus．LEAs可能是种子抗性和防御性状的潜在靶点。OBAPs和oleosins可作为提高种子中角鲨烯含量的靶点。综上所述，野生苋菜种中存在许多新型的球蛋白和前体，因此，野生苋菜种是提高苋菜种子营养品质的重要遗传资源。在硅中检测到新的11S球蛋白的平行链，并对其结构进行了表征。尚需进一步了解苋菜种子中新发现的球蛋白的生物学功能。

植物材料

四个苋菜样品，两个黑色种子野生种:答:hybridus和答:powellii，和两种奶油种子栽培品种，答:cruentuscv Amaranteca和3A.次沉晶杆菌栽培品种：Cristalina，Opaca和营养素用于分析。由国家森林研究所，农业和畜牧业研究所（Inifap，Mexico）善意提供样品。

种子的形态和结构分析

用SteREO Discovery V8 (Carl Zeiss, Oberkoche, GE)软件获取种子的全株和横截面图像。利用来自纳米科学和纳米技术研究国家实验室(ipicyt)的ESEM模型Quanta 200 (FEI, Hillsboro, OR, USA)捕获苋花种子的扫描电子显微镜图像。用碘溶液(2% KI (W./V.），1％i₂(w/v) 30 s，蒸馏水洗1 min，立体镜观察。

从种子中提取总蛋白

根据Sauceo等人进行蛋白质提取。[29］．种子在液氮中冷冻，然后在研钵和杵中研磨。面粉以1:10 (w/v)的比例用己烷脱脂。面粉:正己烷混合物在4°C下以最大速度均质15分钟，然后在15,000×g下在4°C下用Beckman Avanti J-26S XPI离心机(Beckman, California, USA)离心30分钟。弃掉上清液，风干沉淀。用0.1 M 2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇从脱脂面粉中提取极性蛋白，pH为8.5，含10% (V./v)甘油和2 mM PMFS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在1:20 (w/v)比率。4℃涡旋搅拌15 min, 4℃17,000×g离心30 min。对于疏水蛋白的提取(包括非极性蛋白、膜蛋白和细胞壁蛋白)，亲水性部分产生的残渣被重悬在7 M尿素、2 M硫脲、2% (w/v) CHAPS、2% (v/v) Triton X-100的溶液中，混合并如上所述离心。用Bio-Rad, Hercules, CA, USA试剂盒测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准。所有的提取和测定都在三个重复中进行。将3个独立的生物学重复的蛋白质提取液应用于1D-SDS-PAGE，如下所示。

苋菜蛋白的电泳图谱

在不连续的Tris-glycine凝胶中，亲水性和疏水性蛋白组分的蛋白质提取物分别用4和13.5%的丙烯酰胺最终浓度进行堆积和溶解凝胶，并用一维sds - page分析。从每个样品中加载蛋白质提取物(50 μg)，在SE 600红宝石室(GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)中分离，10 mA/gel 1 h，然后25 mA/gel 4 h。电泳后，用0.05%考马斯亮蓝R-250 (USB Corporation, Cleveland, OH, USA)在含10%乙酸的40%甲醇溶液中进行染色，并用不含染料的相同溶液进行染色。凝胶在Gel Doc XR+ Imaging System设备(Bio Rad)中数字化，并用Quantity One软件v4.5 (Bio Rad)进行密度分析。

统计分析

采用Sigma Plot软件v12.3 (Systat software, Inc.， San Jose, CA, USA)采用Holm-Sidak检验对密度数据进行方差分析(ANOVA)P.< 0.05，差异有统计学意义。对至少一个物种选择具有统计上不同强度的谱带进行质谱分析。使用XLSTAT软件(Addinsoft, Paris, France)进行主成分分析(PCA)和聚类层次聚类(AHC)。

凝胶消化和质谱分析

根据Huerta-Ocampo等人的描述，从1D-SDS-PAGE中去除差异积累的蛋白条带，去除、还原和烷基化[25］．用测序级胰蛋白酶（Promega，Madison，Wi，U.S.A.）在37℃下进行蛋白质消化过夜。纳米级LC分离胰蛋白酶肽的分离是用纳米常见的UPLC系统（水域，MILFORD，MA，USA）进行，配备了对称C18型预柱（5μm，20mm×180μm，水）和ABH130 C18（1.7μm，100 mm） × 100 μm, Waters) analytical column. The lock mass compound, [Glu1]-Fibrinopeptide B (Sigma-Aldrich), was delivered by the auxiliary pump of the nanoACQUITY UPLC System at 200 nL/min at a concentration of 100 fmol/mL to the reference sprayer of the Nano-Lock-Spray source of the mass spectrometer. Mass spectrometric analysis (LC-MS/MS) was carried out in a SYNAPT-HDMS Q-TOF (Waters). The spectrometer was operated in V-mode, and analyses were performed in positive mode ESI. The TOF analyzer was externally calibrated with [Glu1]-Fibrinopeptide B from m/z 50 to 2422. The data were lock-mass corrected post-acquisition using the doubly protonated monoisotopic ion of [Glu1]-Fibrinopeptide B. The reference sprayer was sampled every 30s. The RF applied to the quadrupole was adjusted such that ions fromm / z50-2000有效传播。获得MS和MS / MS光谱在低能量和升高的收购模式（MS）之间获得交替^E.)．

利用MS/MS数据集和数据库搜索进行蛋白鉴定

使用Protein Lynx Global Server v2.4 (Waters)使用MS/MS光谱数据集生成PKL文件。然后使用PKL文件和MASCOT搜索引擎v2.5 (Matrix Science, London, U.K.)对蛋白质进行鉴定A.次沉晶杆菌转录组和蛋白质组数据库v1.0(23,054个序列)可在https://phytozome.jgi.doe.gov/[56］．胰蛋白酶用作特定蛋白酶，允许一个错过的切割。前体和片段离子的质量耐受分别设定为50ppm和0.1da。将氨基甲酰亚胺甲基半胱氨酸设定为固定改性，并将蛋氨酸的氧化指定为可变改性。蛋白质鉴定标准包括至少两个MS / MS光谱，在99％的置信度水平下匹配，并且当检测到重要的吉祥物单独离子分数> 33时，认为鉴定是成功的，表明身份或广泛的同源性统计学意义P.< 0.01。只有肽匹配超过识别阈值FDR≤5%时才认为识别正确。为了估计每个条带中每个蛋白的相对丰度，使用指数修饰蛋白丰度指数(emPAI) [57］．BLAST算法用于同源性搜索Viridiplantae和拟南芥UNIPROTKB数据库的子集（https://www.uniprot.org/blast/)．

生物信息学分析

Weblogo的建造是使用73个11s球蛋白的序列，包括苋科酸，芸苔科，Chenopodiaceae，Cucurbitaceae，Favace，Pedaliaceae，Poaceae和Polygonaceae家族，从viridiplantae储存库（Choce）的子集下载（http://weblogo.berkeley.edu/, (58];https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/, (59])。搜索保守域是在不同的服务器和数据库中完成的，智能（http://smart.embl.de, (60]), PROSITE (http://prosite.expasy.org/, (61]),包含了(http://pfam.xfam.org, (62]），口译（http://www.ebi.ac.uk/interpro/, (63])和NCBI的CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=cdd, (64])。使用PROSITE MyDomains-Image Creator工具生成蛋白质域结构图像(https://prosite.expasy.org/mydomains/, (65])。使用默认设置的Clustal Omega进行多序列比对(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/, (66])。用Mega软件V7.0.21估计系统发育分析和百分比氨基酸组合物[67]，采用邻域连接法和1000个重复的bootstrap测试构建系统发生树，并用iTOL [68］．对于结构建模，蛋白质序列被提交到I-Tasser服务器（https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/i-tasser/, (69)， PDB文件可视化和分子图形使用UCSF Chimera包v1.11.2进行[70］．

1 d-sds-page:

一维十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳

AHC:

会凝聚的层次聚类

CDD：

保守域数据库

家伙:

3 - ((3-Cholamidopropyl) -dimetilamonio) -propanesulfonate

整体:

环境扫描电子显微镜

GBSSI:

颗粒结合淀粉合酶I

去：

基因本体论

i-tasser：

迭代穿线装配改进

kDa:

公斤道尔顿

李:

晚期胚胎发生丰富的蛋白质

兆:

分子进化遗传学分析

nLC-MS /女士:

纳米液相色谱-串联质谱

obap：

油脂相关蛋白

主成分分析:

主要成分Açanalysis.

PDB:

蛋白质数据银行

PFAM：

蛋白质的家庭

及:

phenylmethanesulfonyl氟化

普利斯特：

蛋白质结构域、家族和功能位点

拉尔夫-舒马赫:

抗性淀粉

智能:

简单的模块化建筑研究工具

SSIII:

蔗糖合酶3

SSPS：

种子贮藏蛋白质

EBV感谢CONACYT提供的298096奖学金。感谢OA Patrón-Soberano在微观技术方面的技术支持，MG Silva-Díaz在吉祥物服务器管理和数据库管理方面的支持。我们感谢A. De León-Rodríguez博士对手稿的评论和技术支持。

资金

这项工作得到了Conacyt Problemas Nacionales“Amaranto en la Soberania Alimentaria No. 248415”国家资助。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析或解释以及手稿的撰写中没有发挥作用。

可用性数据和材料

本研究中生成或分析的所有数据均包含在本文中(及其附加文件)。的m/Z.原始数据已被沉积在peptidlas中（ftp://PASS01220:LL2876hxw@ftp.peptideatlas.org/)．应要求对相应作者提供材料的要求。

从属关系

1. Instituto Potosino deInvestigiachiónCientíficaYTecnológica，A.c，78216，圣路易斯波托西，墨西哥

   Esaú Bojórquez-Velázquez, Alberto Barrera-Pacheco & Ana Paulina Barba de la Rosa

2. 墨西哥国家森林调查研究所Agrícolas y Pecuarias, 56250, Texcoco, Estado de México

   Eduardo Espitia-Rangel

3. 国家生物多样性实验室，CINVESTAV-Irapuato, 36821，瓜纳华托，墨西哥

   Alfredo Herrera-estrella

贡献

EBV进行了实验。EER已经收集了种子。ABP通过LC-MS/MS分析蛋白质。APB, EER, AHE构思了这项研究。APB和EER监督实验。EBV, APB和AHE撰写了这篇论文。所有的作者都看过并批准了手稿的最终版本。种子的图片(无花果。1那2,3.)。

相应的作者

对应于Ana Paulina Barba de la Rosa．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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重印和权限