花发育相关长链非编码rna的全基因组发现与表征gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

长非编码rna (lncrna)是长度超过200bp的转录本，不编码蛋白质。迄今为止，已有报道称lncrna通过调控功能在发育过程中起着至关重要的作用。但是，它们的特征、表达继承模式和功能gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba相当不明。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本研究揭示了‘青嘉2号’单株雌蕊与‘大玉’多株雌蕊发育过程的具体特征。我们发现10月初是雌蕊分化的关键时期。两种雌蕊的表皮具有相似性。我们还通过RNA-seq in进一步研究了一个完整的雌蕊发育lncRNA谱gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．2572个独特的lncrna和24648个基因映射到gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba此外，预测了591个新的lncrna。独特的lncrna和新颖的lncrna都比mrna的长度短，lncrna的整体表达水平低于中的mrnagydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．在QJN2中发现186个已知lncrna, 1638个基因和89个新lncrna与DY显著差异表达，我们预测了421个已知差异表达lncrna (DEKLs)的靶基因和254个差异表达新lncrna (DENLs)的靶基因。153个miRNAs预测与100个dekl相互作用，112个miRNAs预测与55个denl相互作用。进一步的DEKLs分析表明，lncRNAgydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba下调靶蛋白pe- mir172d，上调靶蛋白pe- mir172dgydF4y2BaAP2gydF4y2Ba,分别。同时，tcon_00032517的另一个lncRNA诱导细胞分裂素负调控基因gydF4y2BaA-ARRgydF4y2Ba在DY中通过抑制其靶miRNA pe- mir160a /b表达gydF4y2BaP2gydF4y2Ba玉米素(ZT)处理显著上调了其在花蕾中的表达。我们的实验表明gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Batcon_00032517和tcon_00032517可能参与了多雌蕊的形成gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究首次对参与雌蕊分化和花发育的lncrna进行了表征，为阐明lncrna及其靶标在水稻雌蕊分化和花发育中的作用提供了新的指示gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

“中心原则”表明，遗传信息从DNA到mRNA，再到蛋白质的单向方向移动。然而，不同类型的具有不同大小和结构的非编码rna (ncRNA)已经被描述过，这使得这一权威理论在某些条件下不足够[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．ncrna主要由真核转录组产生。根据ncrna的长度，ncrna可分为小ncrna(小于200 bp)和长ncrna (lncRNAs) [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．lncrna被定义为长度超过200 bp的非蛋白编码rna [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．lncrna可以起源于外显子、内含子、基因内、基因间、启动子区域、3 ' -和5 ' - UTR、增强子序列，这些增强子序列在意义或反义方向上转录[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．与蛋白质编码rna和其他类型的ncrna不同，lncrna的功能因其序列或结构的不同而复杂和模糊。然而，通过测序对哺乳动物lncRNA的识别和功能分析已经做了大量的工作，但lncRNA的功能和机制仍有待阐明[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在植物中，只有少数lncrna被鉴定和功能研究，包括gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］gydF4y2Ba,玉米gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,番茄gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),gydF4y2Ba木薯耐gydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．lncrna在表观遗传、转录和转录后水平上具有普遍且强大的调控基因表达的功能。然而，已有研究表明lncrna在植物生物学过程中起着至关重要的调节作用，包括基因沉默、应激反应、花期调控、花和花粉发育[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCOLDAIRgydF4y2Ba，两个lncrnagydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，作为花的抑制因子，已被定性为gydF4y2Ba开花轨迹CgydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．根据应力表达谱，发现22个lncrna与非生物胁迫反应相关gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．通过对17个lncrna、840个mrna和全基因组中已知的mirna的联合分析，我们探索了由lncrna介导的玉米中广泛存在的竞争性内源性rna (competitive内生rna, ceRNAs)，结果显示7个新的lncrna作为前瞻性功能ceRNA [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．基于来自35个不同二倍体草莓花和果实组织的RNA-seq数据集，从3862个位点中鉴定出5884个lncrna，并强调了它们对果实和花朵发育的潜在影响[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．在gydF4y2BaLncRNA1459gydF4y2Ba突变体、乙烯和类胡萝卜素生物合成相关基因在番茄中明显下调[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

lncrna具有海绵microRNA (miRNAs)的潜力，并调节mRNA的表达[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．一些lncrna含有miRNA结合位点，这些位点作为内源性靶标模拟物与miRNA结合，并将其抑制浓缩在靶标上[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在水稻中，lncRNA osa-eTM160减弱了osa-miR160对gydF4y2Baosa-ARF18gydF4y2Ba在花药发育的早期阶段，信使rna通过目标拟态方式，从而帮助调节种子大小和结块[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．新发现表明lncrna也可以通过两种方式引导基因表达gydF4y2Ba顺式gydF4y2Ba作用于(邻近基因)或在gydF4y2Ba反式-gydF4y2Ba作用于(遥远的基因)在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，计算分析预测939势gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调节和965电位gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-调控ga响应lncrna的靶基因。这些潜在的靶基因参与影响木材生长和特性的各种生物过程[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba木薯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-调控网络分析表明，大量lncrna与次生代谢物生物合成、蔗糖代谢和激素信号转导通路相关[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物激素是小信号分子，对植物生长、分化和发育的大多数方面都至关重要。细胞分裂素在调节植物发育和生长中起着重要的作用。在烟草中，内源性细胞分裂素水平的降低导致分生组织活性的降低[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在玉米中，细胞分裂素可以决定小花发育过程中雌蕊细胞的命运[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．细胞分裂素调节基因表达，比如gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba对细胞分裂素的反应上调gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．生长素是一种远距离信号激素，在整个植物水平上调节生长。生长素含量的差异控制许多发育过程，包括分生组织的模式。生长素主要位于花原基起始位点，激活生长素响应因子MONOPTEROS/ARF5，直接激活leaf转录触发花命运[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．赤霉素(GAs)参与控制开花，调控发育过程，也部分控制花同源基因的表达[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

梅花(gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba摘要。的重要成员gydF4y2Ba蔷薇科gydF4y2Ba是一种水果和观赏作物，起源于7000多年前的中国[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba是最珍贵的加工水果之一，具有重要的经济价值，用于保存和酒精饮料工业。一般来说,在gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba一个完美的花保持正常的雌蕊发育导致单果形成。然而,gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba也有一些品种有两个或两个以上的雌蕊，这导致多果，而其他不育导致产量下降和果实质量低。此外，多雌蕊形成的分子机制尚不清楚。为了筛选出潜在的调节雌蕊数量的lncrna，我们系统地研究了lncrna在植物中的表达分析gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba全基因组规模的花蕾。此外，这些研究也有助于加深我们对水稻雌蕊分化和花发育过程中lncrna的认识gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

QJN2和DY中关键雌蕊分化阶段和相似表皮的鉴定gydF4y2Ba

根据石蜡切片结果，观察了QJN2和DY的雌蕊分化发育过程(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．9月下旬，雌蕊原体处于分化前期(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)和萼片，花瓣和雄蕊已经出现。10月上旬，雌蕊原基进入分化早期，开始发育。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab) 10月下旬至11月，雌蕊原体处于分化阶段，细胞分裂较强。在这个阶段也可以观察到雌蕊，如QJN2的一个鼓包，DY的两个鼓包，并且在这个阶段雄蕊已经形成(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac - d)。12月初，雌蕊原体进入分化后期，形成胚珠(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).在DY品种中观察到相同的雌蕊分化过程(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf j)。因此，我们发现10月初是雌蕊分化的关键时期。gydF4y2Ba

扫描电子显微镜(SEM)用于获得雌蕊表皮细胞的形状。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．通过比较QJN2和DY两种雌蕊的柱头、尖针中部和基部，我们发现两种雌蕊的细胞形状相似。柱头有紧密细胞，基部有柱头乳头。凸形细胞在后期伸长并形成柱头毛。gydF4y2Ba

RNA-seq数据分析，lncrna的鉴定和表征gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba

为了筛选出调控雌蕊数量的潜在lncrna，我们对QJN2和DY的花蕾在分化早期进行了全转录组链特异性RNA测序，包括3个生物重复(QJN2 1、QJN2 2、QJN2 3、DY 1、DY 2和DY 3)。从6个样本中获得了超过700,000,000个原始序列reads，其中清洁reads超过88%(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．大约70、72、73、80、77和73%的清洁读是映射读，64、66、67、74、71和67%分别是6个库中的唯一映射读gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这些读数平均分布在8条染色体上gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba(附加文件2)。一组unique reads被映射到基因间区(24.26%/23.47%/19.94%/9.86%/11.96%/14.44%，QJN2 1/QJN2 2/QJN2 3/DY 1/DY 2/DY 3)、外显子区(63.84%/65.95%/70.16%/85.68%/81.91%/77.84%，QJN2 1/QJN2 2/QJN2 3/DY 1/DY 2/DY 3)和内含子区(11.90%/10.58%/9.90%/4.46%/6.13%/7.72%，QJN2 1/QJN2 2/QJN2 3/DY 1/DY 2/DY 3)和内含子区(11.90%/10.58%/9.90%/4.46%/6.13%/7.72%)，如附加文件2b所示。用Pearson相关系数来反映三个生物复制之间的相关程度。结果表明，每个雌蕊类型样品的3个生物复制均具有较高的相关性，其中QJN2的Pearson相关系数为0.994 ~ 1,DY为0.748 ~ 0.932gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

所有RNA-seq数据集都被映射到gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba使用大礼帽的基因组。共鉴定出24648个已知基因和2572个已知lncrna。根据长度(排除长度小于200 bp的转录本)和编码势(去除大于0的编码势)定义为新lncrna，对剩余的reads进行过滤。最终，591个新的lncrna被鉴定出来gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．mRNA和lncRNA表达的多维标度(MDS)图显示QJN2和DY在一维上分离(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和b)。已知lncRNA的长度范围为200 ~ 8360 bp，新lncRNA的长度范围为200 ~ 5193 bp。已知lncRNA的平均长度为1314 bp，中位数为1751 bp，而已知lncRNA的平均长度为682 bp，中位数为799 bp。蛋白质编码mrna的长度平均为1727 bp，中位数为2164 bp(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).因此，lncrna的平均长度比mRNA短。然后，我们使用reads per kilobase of transcript per million fragments mapped (RPKM)来估计每个转录本的表达水平，发现QJN2和DY的转录本表达水平相似。然而，lncrna的整体表达水平低于mrna(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad).新lncrna的保守性分析显示，352个新lncrna(59.56%)在其他基因组中保守。大部分都被映射到gydF4y2Ba李属gydF4y2Ba,包括gydF4y2Ba李属鸟结核gydF4y2Ba，gydF4y2Ba碧桃gydF4y2Ba，gydF4y2Ba李属armeniacagydF4y2Ba，gydF4y2Ba李属pedunculatagydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．lncrna的特征gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba与其他植物的研究结果一致。gydF4y2Ba

差异表达基因和lncrna的鉴定gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba

共鉴定出24,648个表达基因，并将其定位于gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba基因组。QJN2和DY样本的差异表达基因有1638个(DEGs, log的绝对值)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFold change > 1, q-value < 0.001)，其中上调基因1040个，下调基因598个(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．GO用于评价DEGs函数的分类。deg被分为21个官能团(gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05为阈值)，包括10个分子功能，4个细胞成分和7个生物过程(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).基于KEGG数据库的通路分析结果显示，DEGs被分为27个通路(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Bab, 6).代谢途径包括最大的DEGs (ko01100, 155个基因)。植物激素信号转导是第四个重要的富集途径。18个植物激素信号转导的基因和42个植物激素生物合成的基因可能是花发育的关键因素gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在本研究中，我们确定了一套相对全面的gydF4y2Ba李属却已gydF4y2BalncRNAs。由于RNA-Seq，所有转录本的组装、注释和过滤分析都被完成。从所有6个库中总共获得了3163个lncrna，其中包括2572个已知lncrna(注释在gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba591个新的lncrna(新预测的除外)gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba基因组)。与DY样品相比，在QJN2的芽中鉴定出186个已知的显著差异表达(DEKLs) lncrna，其中上调lncrna 15个，下调lncrna 171个(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．我们还发现有5种lncrna是dy特异性表达的lncrna。因此，lncrna的功能有待进一步研究。gydF4y2Ba

表达分析还发现，与DY相比，QJN2的芽中有89个新的lncrna差异表达，其中69个上调，20个下调(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．其中6个在DY花蕾中单独表达，2个在QJN2花蕾中单独表达，81个分别在两个花蕾中共同表达(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．基于Rfam数据库(12.0版本)，我们发现了54个新的lncrna映射到25个家族(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．此外，我们发现这些新的lncrna有可能作为miRNA和snoRNA的前体，如miRNA、MIR390、MIR396、MIR535、MIR156和snoRNA、snor36a、snoR44_J54和snoRD43。gydF4y2Ba

与花发育相关的lncrna可能通过与miRNAs和基因的相互作用发挥作用gydF4y2Ba

采用MIRANDA、PITA和RNAHYBRID三种不同的计算方法预测了QJN2和DY之间所有DEKLs和denl的潜在靶miRNAs，结果通过三种方法预测了100个DEKLs中的153个靶miRNAs，如附加文件所示gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．进一步分析发现，miRNA-lncRNA相互作用对共有473对。为了探索lncrna的表达与其潜在靶mirna的关系，我们选择了6对miRNA-lncRNA，并通过qRT-PCR检测了它们的表达。lncrna的表达与其潜在的靶mirna呈负相关(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

此外，我们预测了DEKLs的靶基因，共分为378个gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-目标基因和43gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-目标基因(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．例如，多蛋白连接因子1c (MBF1c)是gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba—target基因的gydF4y2BaXR_001678293.1gydF4y2Ba类顶蛋白(TPL)是最常见的蛋白质gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-靶基因(XR_001677462.1, XR_001678577.1, XR_001678578.1, XR_513648.2, XR_513660.2和XR_515023.2)。在这些潜在的目标基因中，240gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控靶基因和19gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-调控的靶基因表现出转录水平的变化(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。为了分析dekl的表达与其潜在靶deg表达模式之间的关系，我们比较了QJN2和DY之间DEKL-DEG的表达趋势，共发现27对DEKL-DEG对。其中22对DEKL-DEG(81.48%)呈现相同趋势，5对DEKL-DEG(18.52%)呈现相反趋势。为gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba—target基因,lncRNAgydF4y2BaXR_513962.2gydF4y2Ba-gydF4y2BaXM_016793708.1gydF4y2Ba(LOC103330068)和gydF4y2BaXR_001677259.1gydF4y2Ba-gydF4y2BaXM_008222091.1gydF4y2Ba(LOC103320411)拥有同样的趋势，但gydF4y2BaXR_514210.2gydF4y2Ba-gydF4y2BaXM_008236161.2gydF4y2Ba(LOC103333339)则相反。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).此外，lncRNAgydF4y2BaXR_001677731.1gydF4y2Ba拥有这两种趋势，例如，gydF4y2BaXR_001677731.1gydF4y2Ba-gydF4y2BaXM_008231505.1gydF4y2Ba(LOC103329075)表现出相同的趋势gydF4y2BaXR_001677731.1gydF4y2Ba-gydF4y2BaXM_008231419.2gydF4y2Ba(LOC103328991)则相反。为gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-靶基因，三对DEKL-DEG表现出相同的趋势(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab). DEKLs与其潜在靶基因之间不同的表达关系表明lncrna的调控机制多种多样。gydF4y2Ba

我们还预测了与denl相互作用的靶基因和miRNAs。共有72个denl拥有221个gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-靶基因，19个denl拥有33个gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-目标基因(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．其中，tcon_00036642和tcon_00037216拥有gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-靶基因agamouss -like MADS-box蛋白AGL65。为了分析DENLs的表达与其潜在靶标DEGs的表达模式之间的关系，我们比较了它们的表达趋势(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).共发现18对DENL-DEG对。其中，15对DEKL-DEG(83.33%)潜在靶基因与lncRNA表达趋势一致，3对DENL-DEG(16.67%)表达趋势相反。我们预测了QJN2和DY之间所有89个DENLs的潜在靶miRNAs，只有55个DENLs拥有靶miRNAs，构成了237个lncRNA-miRNA相互作用，如附加文件所示gydF4y2Ba10gydF4y2Ba．denl与靶miRNAs和基因之间的关系有待进一步研究。gydF4y2Ba

除了lncRNA与miRNAs和基因相互作用的结果外，我们还发现16个DEKLs和8个DENLs仅靶向miRNAs, 70个DEKLs和29个DENLs仅靶向基因。这一结果表明，大多数lncrna具有靶mirna和基因的多重调控功能，但少数lncrna具有单一功能。此外，单个lncRNA可以靶向多个基因或mirna。gydF4y2Ba

之间的负面关系gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba、ppe-miR172d和gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba

根据目标mirna的结果，我们发现了一个lncRNA-miRNA相互作用对gydF4y2BaXR_514690.2 -gydF4y2Bappe-miR172d。有证据表明miR172对其靶基因有负调控作用gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba调节花的发育。根据我们的基因表达结果gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba、ppe-miR172d和gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba，我们发现两者呈负相关gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba和pe- mir172d，以及pe- mir172d和gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．的表达gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba在花发育阶段DY与QJN2相比逐渐降低。在分化前和分化早期，gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba表达上调，而pe- mir172d表达下调。gydF4y2Ba

QJN2和DY花蕾中植物激素差异含量的测定gydF4y2Ba

植物激素在花的发育和分生组织活性中起着重要作用。因此，我们采用UPLC测定植物激素含量，包括细胞分裂素(ZT，玉米素)，生长素(IAA，吲哚乙酸)和GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，结果如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa.分化前期QJN2与DY花蕾间IAA、ZT含量无显著差异。DY花蕾中IAA含量在分化早期显著增加，而QJN2含量则显著降低。在分化后期，QJN2和DY均较分化前期显著升高，且QJN2高于DY，在分化前期，QJN2和DY ZT含量均最低，分化前期均升高。DY中ZT含量在分化早期迅速上升，而QJN2中ZT含量在分化后期迅速上升。与IAA和ZT不同，GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba分化前期含量显著高于其他两个阶段。在分化前期和分化后期，GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaDY的含量显著高于QJN2。进一步分析了ZT与gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba表达式(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).通过ZT处理(1 mmol/L)，使gydF4y2BaAP2gydF4y2Bady12 h后花蕾表达显著上调，而QJN2 24 h后花蕾表达显著上调。在雌蕊发育分化初期，ZT含量最高，随生育期的增加而增加gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba基于lncRNA- mirna的分析，我们发现了miR160a/b的新的lncRNA TCON_00032517靶点，和gydF4y2BaA-ARRgydF4y2Ba受pe- mir160a /b负调控。的衰减gydF4y2BaA-ARRgydF4y2Ba细胞分裂素信号的负调控会引起花器官的不确定性gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba．基因表达分析与调控过程一致(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

实时定量RT-PCR分析gydF4y2Ba

为了确认RNA-seq的一致性，我们随机选取11个基因和12个lncrna进行qRT-PCR分析(图5)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．不同类型雌蕊样品中各DEG和DEKL的表达与RNA-seq测序数据的丰度比较。通过qRT-PCR分析计算基因与lncrna的相对表达量。结果表明，RNA-seq与qRT-PCR具有良好的重复性。gydF4y2Ba

李属却已gydF4y2Ba对花发育的lncrna特征和DEKLs进行了鉴定gydF4y2Ba

转录组学测序的快速发展简化了植物中数千个lncrna的识别，但它们在雌蕊发育中的作用仍不清楚。为了识别差异表达基因和lncRNAs，我们对单雌蕊cv QJN2和多雌蕊cv DY进行了转录组比较分析，共鉴定出24,648个已知基因和2572个已知lncRNAs。桃深层RNA-Seq结果显示，大部分新转录区域(66.2%)为lncrna [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．通过我们严格的lncRNAs鉴定过程，共鉴定出591个新的lncRNAs转录本。然而，在我们的研究中发现的这些lncrna与在其他植物中发现的lncrna具有相似的特征。大多数lncrna在物种间的序列保守性低于蛋白质编码基因。在高粱和玉米中，只有25%的lncrna是保守的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．通过对5个单子叶种和5个双子叶种的lncrna全基因组分析，发现lncrna在亚种和种内具有较高的序列保守性，而在种间的保守性较差[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．在我们的研究中，对新lncrna的保守性分析显示，352个新lncrna(59.56%)在其他基因组中保守，包括gydF4y2Ba李属gydF4y2Ba(53.30%)和种间(6.26%)。结果表明，新的lncrnagydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba种内的保守性高于种间的。由于序列保守性和同源性是生物功能的指标，因此，了解保守性较低的lncRNA的功能将具有挑战性。在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba， lncrna的平均长度是蛋白质编码转录物的一半，lncrna的平均表达水平比mRNA低5倍[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．基于80个个体的rna序列gydF4y2Ba芒草lutarioripariusgydF4y2Ba， lncrna的长度也明显短于mrna [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．我们的研究表明，已知lncrna的长度平均为1314 bp，而新lncrna的长度平均为683 bp。与这些lncrna相比，平均长度为1728 bp的mrna。因此，无论是已知的lncrna还是新发现的lncrna，其长度都比蛋白质编码转录本短。此外，这些lncrna的表达水平低于细胞中的mrnagydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．然而，lncrna的表达在植物中表现出较高的细胞或组织类型特异性表达[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．此外，lncrna可以通过多种机制调节基因表达。它们可以作为miRNA诱饵，通过隔离miRNA激活基因表达[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．类似于水稻，棉花和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba的比例gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Balncrna被预测为mirna靶标。此外，lncrna可以通过调控靶基因gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba代理。因此，我们的研究结果暗示了lncrna、靶mirna和靶基因之间存在着重要的功能模式关系。因此，我们的研究结果为进一步的研究提供了丰富的信息。gydF4y2Ba

的表达式分析gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba与QJN2相比，我们在DY样品中鉴定出186个DEKLs(7.23%)和89个DENLs(15.06%)，提示lncrna在调控花发育中起重要作用。在这些DEKLs中，我们发现gydF4y2BaRLP12gydF4y2BaRLPs在许多植物中都存在，与植物的生长发育和抗病有关。两个gydF4y2BaAtRLPsgydF4y2Ba（gydF4y2BaAtRLP2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtRLP12gydF4y2Ba)，具有最大的序列相似性gydF4y2BaCLV2gydF4y2Ba，被发现有能力拯救gydF4y2Baclv2gydF4y2Ba在控制下表达的突变表型gydF4y2BaCLV2gydF4y2Ba启动子。功能丧失的gydF4y2Ba图表gydF4y2Ba导致均质干细胞提前积累，导致分生组织增大，花器官数目增加，叶状结构改变[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在芽和花分生组织中gydF4y2Ba本人gydF4y2Ba基因是干细胞鉴定的必修课，而gydF4y2BaCLAVATAgydF4y2Ba（gydF4y2Ba图表gydF4y2Ba）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba基因刺激器官启动。的gydF4y2Ba图表gydF4y2Ba基因抑制gydF4y2Ba本人gydF4y2Ba在转录水平上gydF4y2Ba本人gydF4y2Ba表达足以诱导分生组织细胞识别[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．肌球蛋白是在肌动蛋白丝旁运动的真核分子马达。目前的信息表明高等植物肌凝蛋白在细胞质流、细胞生长和植物身高中的作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在根尖分生组织中，细胞分裂受阻，细胞板错位。AMS是一种基本环-螺旋环(bHLH)毡层特异性转录因子，已被证明影响高等植物中脂质运输、黄酮醇积累、甲基修饰和花粉壁形成相关基因的表达[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．细胞壁降解与几种水解酶活性的增加有关，如聚半乳糖醛酸酶。细胞壁降解已观察到在整个发育过程中发生，有助于伸长、生长和花粉管生长等过程。gydF4y2Ba甜蜜的gydF4y2Ba基因，新发现的在花粉发育中起关键作用的植物基因家族[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与花发育相关的lncrna与miRNAs和mRNAs形成调控网络gydF4y2Ba

lncrna可能调控基因表达gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba——或者gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba代理(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用lncrna已被报道可控制位于其转录位点附近的基因表达[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-作用lncrna调节独立位点的基因表达[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba, lncRNAgydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCOLDAIRgydF4y2Ba被报道抑制了表达gydF4y2Ba开花轨迹CgydF4y2Ba影响开花[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们发现了378个gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-目标基因和43gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba通过分析QJN2和DY之间的DEKLs，根据潜在靶基因和lncRNA的表达，共发现27对DEKL-DEG。其中22对DEKL-DEG(81.48%)呈现相同趋势，5对DEKL-DEG(18.52%)呈现相反趋势。DEKLs及其潜在靶基因之间的不同表达关系表明lncrna的调控机制多种多样。大多数lncrna的功能未知，lncrna的潜在靶基因需要实验确认。gydF4y2Ba

在分析lncRNA潜在靶基因时，我们发现MBF1c是gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba—target基因的gydF4y2BaXR_001678293.1gydF4y2Ba．MBF1c是一种极其保守的转录辅激活因子，受多种过程调控，如芽内皮细胞分化、激素调节的脂质代谢、生物和非生物应激[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．25 DEKLs自己gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-靶基因，由43个lncrna -基因关系组成。其中，我们发现了6个DEKLsgydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-靶向TPL, DY上调，说明AP2作为转录抑制因子的功能源于TPL与AP2 dna结合域的融合。这些TPL-AP2融合挽救了花的缺陷gydF4y2Baap2-2gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．AP2直接结合到调控的第二内含子上gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba和员工都gydF4y2BaTPLgydF4y2Ba和组蛋白去乙酰化酶HDA19，这可能解释了gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba通过gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．我们还预测了与denl相互作用的靶基因。72个denl拥有221个gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-靶基因，19个denl拥有33个gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba—target基因。在这些DENLs中,gydF4y2BaTCONS_00036642gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTCONS_00037216gydF4y2Ba拥有gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-靶基因agamouss -like MADS-box蛋白AGL65。AGL65是植物花粉发育所必需的[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

新的研究结果提出lncrna可能与包括mirna在内的其他非编码rna相互作用，并通过相互作用调节其调控作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．mirna是植物发育的重要因子，通常通过介导靶mrna的切割或抑制其转译来负向调控基因表达。在我们的研究中，我们获得了710个lncRNA-miRNA相互作用，包括473个DEKL-miRNA相互作用和237个DENL-miRNA相互作用。少数报道表明了microRNA(如miR172家族)在花分生组织终止控制中的重要性。miR172调节干细胞命运，描述干细胞的内部边界gydF4y2BaPISTILLATAgydF4y2Ba而且gydF4y2BaAPETALA3gydF4y2Ba表达域gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物分生组织(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba， miR172负调控其靶基因，如gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．miR172水平降低的突变体，以及gydF4y2Bamir172d-1gydF4y2Ba，在一些基因背景中表现出潜在的不确定性。miR172通过下调靶细胞来促进干细胞的终止gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba，反过来又会抑制gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba．过度的gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba（gydF4y2Ba35 s: AP2gydF4y2Ba)在野生型结果的孤立的微妙表型缺陷中，而过表达mir172抗性版本的AP2 (gydF4y2Ba35个年代gydF4y2Ba：gydF4y2BaAP2m1/3gydF4y2Ba)通过花中心完全不确定的分生组织，导致完全丧失确定性[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在我们的研究中，我们发现了三种lncrna，gydF4y2BaXR_513294.1gydF4y2Ba(但一个个LOC103319808, 1.65),gydF4y2BaXR_514692.2gydF4y2Ba(UPF0481蛋白At3g47200-like, 1.36)和gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba(UPF0481蛋白At3g47200-like, 1.38)均在DY中上调，靶向miR172。通过表达分析pe- mir172d, lncRNAgydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba，我们发现ppe-miR172d和lncRNAgydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba为负相关，ppe-miR172d与gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba也负监管。较高水平的lncRNAgydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba可能导致miR172水平较低，而miR172水平较高gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba，这可能导致低gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba基因表达，再高gydF4y2Ba本人gydF4y2Ba表达可能导致DY花不确定。gydF4y2Ba

miR169家族在花的决定性上可能与miR172家族有冲突的影响[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．miR169家族降低了gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba在牵牛花和金鱼花中，可能有同样的作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．miR169水平的下降抵消了miR172水平的下降gydF4y2Bahen1gydF4y2Ba而且gydF4y2Badcl1 / cafgydF4y2Ba并解释了他们适度的不确定性表型。在本研究中，我们预测了15个DEKLs和4个DENLs与miR169相互作用，包括gydF4y2BaXR_513468.1gydF4y2Ba(-葡萄糖苷酶12-like，−7.63)，gydF4y2BaXR_001678028.1gydF4y2Ba(uncharactertyloc107881413，−2.35)，gydF4y2BaXR_514358.2gydF4y2Ba(但一个个LOC103335841, 3.73),gydF4y2BaXR_514769.2gydF4y2Ba(热休克70 kDa蛋白样，1.60)，gydF4y2BaXR_514692.2gydF4y2Ba(UPF0481蛋白At3g47200-like, 1.36)，gydF4y2BaXR_514708.1gydF4y2Ba(60S核糖体蛋白L18a-like, 1.22)，gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba(UPF0481蛋白At3g47200-like, 1.38)，gydF4y2BaXR_001678297.1gydF4y2Ba(肌球蛋白-11,1.06)，tcon_00004613 (3.14)，gydF4y2BaTCONS_00043298gydF4y2Ba(2.75),gydF4y2BaTCONS_00023005gydF4y2Ba(2.23),gydF4y2BaTCONS_00005046gydF4y2Ba(2.10)。从以上结果中，我们检测到pe- mir169a /b/c和pe- mir169e -5p与QJN2与DY呈负相关。gydF4y2Ba

miRNA319对植物的开花、细胞生长和发育至关重要。miR319a及其靶基因的作用gydF4y2BaTCPgydF4y2Ba雌蕊发育过程中的调节在吗gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．我们发现了一个lncRNAgydF4y2BaXR_514769.2gydF4y2Ba(热休克70 kDa蛋白样，1.60)和gydF4y2BaXR_001677969.1gydF4y2Ba(可能是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶IRE, 1.18)在DEKL中。另外，与QJN2相比，DY中pe- mir319a和b均下调。因此，雌蕊相关基因通过与miR319a负向相互作用可能促进lncRNAsgydF4y2BaXR_514769.2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaXR_001677969.1gydF4y2Ba．的gydF4y2Ba35 s: MIR396agydF4y2Ba植株表现出弯曲的，不融合的心皮或单心皮雌蕊[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．在我们的研究结果中，我们发现了lncRNAgydF4y2BaXR_513949.2gydF4y2Ba(未特征蛋白At4g28440-like, 3.67)在DY中表达上调。gydF4y2BaXR_513949.2gydF4y2Ba与QJN2相比，DY中ppp - mir396a /b和ppp - mir396b靶蛋白表达下调。gydF4y2Ba

植物激素在花发育中的作用gydF4y2Ba

植物激素是一种小信号分子，对植物生长、分化和发育的各个方面都至关重要。在KEGG途径分析中，植物激素信号转导是第四个重要富集途径。在植物激素信号转导过程中有18个DEGs，在植物激素生物合成过程中有42个DEGs，包括生长素、GAs、细胞分裂素等。我们的结果还表明，lncrna与植物激素有关，并调节花的发育。gydF4y2Ba

植物细胞分裂素在调节植物发育和生长中起着至关重要的作用。在烟草中，内源性细胞分裂素水平的降低导致分生组织活性的降低[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba的表达,gydF4y2BaAtCKX3gydF4y2Ba由于细胞分裂素的分解，花的数量减少，花分生组织的原始形成率降低[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．植物中的一个多步磷酸中继途径是介导的细胞分裂素信号转导。甲型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba反应调节因子(A-ARRs)是主要的细胞分裂素反应基因，主要是细胞分裂素信号的负调控因子[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．细胞分裂素调节基因表达已被广泛研究，包括gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba对细胞分裂素的反应上调[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．在我们的学习中，降低表达gydF4y2BaA-ARR(类orr9双组分响应调节器)gydF4y2BaUPLC结果表明，在分化早期，DY中ZT含量高于QJN2雌蕊。的基因表达gydF4y2Ba美联社gydF4y2Ba2例对ZT处理呈上调反应。ZT含量越低，QJN2花分生组织活性越低，花器官数量越少。顺便说一下,gydF4y2BaA-ARRgydF4y2Ba被抑制gydF4y2BaPro35S: miR160cgydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．我们发现了一个下调的DENLs tcon_00032517靶点与pe- mir160a /b，和gydF4y2BaA-ARRgydF4y2Ba我们的结果表明，lncrna通过影响ZT含量和靶mirna的信号转导来调控雌蕊发育。gydF4y2Ba

生长素是在整个植物水平上调节生长的远距离信号。局部生长素含量变化的差异控制许多发育过程，包括分生组织的模式。生长素突变体显示花器官识别缺陷[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．在我们的研究中，在分化早期，DY雌蕊中IAA的内源激素含量高于QJN2雌蕊。此外，有报道称miR160抑制生长素转录因子(ARFs)的表达[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．这些以pe- mir160a /b为靶点的lncrna表达下调会通过下调抑制生长素功能gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba导致DY花器官不确定性的基因。gydF4y2Ba

GAs在植物中参与控制开花和调节花的发育，并部分控制花同源基因的表达[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba通过对照和春化样本的比较转录组分析，共鉴定出300个差异表达基因和254个差异表达lncrna。通过对差异表达基因和lncRNAs的共定位网络分析，将相关基因定位到植物激素信号转导通路上，增加GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba内容(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．此外，在杨树中对ga响应lncrna进行了全基因组识别，410个lncrna显示基因表达对GAs响应的变化[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．在我们的研究结果中，GA含量的增加和稻草人样蛋白28的上调会促进GA信号，协助DY花分生组织的细胞分裂。gydF4y2Ba

在本研究中，我们定义了一个综合的雌蕊发育lncRNA谱gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．进一步揭示了两种心皮类型之间雌蕊发育过程的保守性和特异性。在QJN2中，有186个已知lncrna和89个新lncrna的表达与DY存在显著差异，我们预测了421个DEKLs靶基因和254个DENLs靶基因。153个miRNAs预测与100个dekl相互作用，112个miRNAs预测与55个denl相互作用。进一步的DEKLs分析表明，lncRNAgydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Ba下调靶蛋白pe- mir172d，上调靶蛋白pe- mir172dgydF4y2BaAP2gydF4y2Ba,分别。同时，tcon_00032517的另一个lncRNA诱导细胞分裂素负调控基因gydF4y2BaA-ARRgydF4y2Ba在DY中通过抑制其靶miRNA pe- mir160a /b表达gydF4y2BaP2gydF4y2BaZT处理显著上调了其在花蕾中的表达。我们的实验表明gydF4y2BaXR_514690.2gydF4y2Batcon_00032517和tcon_00032517可能参与了多雌蕊的形成gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba．(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

植物材料收集gydF4y2Ba

在这项研究中,gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Bacv“青佳2号”(QJN2，单雌蕊)和“大玉”(DY，多雌蕊)在位于江苏南京的日本杏国家田间基因库中生长。从9月20日至12月27日每周收集样品进行不同的测定。所有采集的花蕾立即冷冻在液氮中，然后保存在- 80°C备用。gydF4y2Ba

石蜡切片gydF4y2Ba

了解植物雌蕊发育和分化过程gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba，用石蜡法观察了QJN2和DY两个品种不同时期花芽的纵剖面[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．采样时间为9月20日至12月27日，间隔一周。采集的花蕾立即用FAA固定，进行石蜡切片。gydF4y2Ba

植物雌蕊表皮细胞形态的扫描电镜gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba

利用扫描电镜观察了不同类型雌蕊表面结构的变化。制备12月20日分化后期样品的方法是在硅片上沉积一滴稀释的乙醇悬浮液，然后在1.0 kV的扫描电镜(日本日立SU8010)下以各种放大倍率进行检测。gydF4y2Ba

RNA提取，文库构建，测序gydF4y2Ba

根据石蜡切片结果，利用早期分化芽(雌蕊形成的重要阶段)进行RNA提取和文库构建。每收集一个样本分别进行3个生物重复进行高通量rna测序。在早期分化阶段使用Trizol试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)按照制造商的协议从花芽中分离总RNA。在RNA纯化过程中，使用RNase-Free dna酶集(Qiagen, Valencia, CA, USA)进行额外的柱上dna酶消化。RNA浓度采用NanoDrop ND-1000分光光度法(NanoDrop Technologies, Rockland, DE, USA)检测，质量控制采用Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, USA)测定。根据《RNA样品制备指南》，使用合格的RNA构建链特异性RNA seq文库。随后按照广州瑞博生物有限公司的标准程序进行文库构建和Illumina测序。使用震中核糖核酸-零rRNA去除试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)构建链文库，单独去除rRNA。在Illumina HiSeq 3000仪器上对链特异性文库进行测序，产生150 bp的对端reads。库分别命名为QJN2 1、QJN2 2、QJN2 3、DY 1、DY 2和DY 3。 The sequencing data have been submitted to the NCBI Sequence Read Archive (SRA accession number: QJN2 1: SRR7007150, QJN2 2: SRR7027384, QJN2 3: SRR7012247, DY 1: SRR7006118, DY 2: SRR7006119, DY 3: SRR7006910).

阅读映射和转录组组装gydF4y2Ba

RNA-Seq后，获得原始读数并进行预处理。去掉了短且低质量读的适配器，修剪了N个碱基数量超过10%的读。之后，所有的干净读取都被映射到gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba基因组(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=prunus%20mumegydF4y2Ba)使用TopHat (v2.0.12)，允许两次读取不匹配，两个不同但相邻的外显子合并为一个外显子[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．袖扣用于组装映射的读数。使用ANNOVAR软件对映射读数进行分析和注释。gydF4y2Ba

独特的lncRNA鉴定和新颖的lncRNA预测gydF4y2Ba

基于映射的结果，我们将已知的lncrna识别为来自gydF4y2Ba李属却已gydF4y2Ba而根据lncRNA的特性，从转录组组合的转录本中预测新的lncRNA [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．lncRNA鉴定管路流程图如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．新lncrna的长度小于200 bp, ORF小于300，外显子数小于2的已知蛋白编码转录本和已知lncrna均被屏蔽。使用BioPerl(版本1.6.923)进行ORF分析，以找到所有可能的ORF。将转录本在Pfam和Swiss-Prot数据库中进行比对，以去除蛋白质编码域和编码蛋白。结合编码-非编码指数(CNCI，版本2)和编码潜力计算器(CPC，版本0.9-r2)对其非编码潜能进行预测。低于−1的截止分数用于选择具有非编码潜力的CPC转录本，而对于CNCI，我们选择具有负非编码预测的转录本。在本研究中，Rfam数据库(版本12.0)[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba以及blast软件(版本2.2.25)，用于新型lncrna的家族分析。本研究预测的所有新lncrna序列均为截断e值<1e-10的blast序列，且与其他基因组的序列一致性为> 20%，被定义为转化lncrna。gydF4y2Ba

deg, dekl和denl的分析gydF4y2Ba

基因和lncrna的表达水平通过袖链法按其各自的长度归一化计数来测量。RPKM用于表示归一化表达式值。采用一种严格的算法来识别不同样本之间的差异表达基因(DEGs)、差异表达的已知lncRNAs (DEKLs)和差异表达的新lncRNAs (DENLs) [gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．假设基因和lncrna存在显著差异表达，q值< 0.001，错误发现率(FDR) < 0.01，且在整个文库中序列计数的阈值相对变化为2倍。利用GO和通路富集分析进行DEGs分析。氧化石墨烯富集分析使用的是Blast2GO。富集途径分析使用KEGG(京都基因和基因组百科全书)数据库。gydF4y2Ba

DEKLs和DENLs的靶基因和miRNAs预测gydF4y2Ba

根据DEKLs和DENLs的调控作用预测其潜在靶基因，包括gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba—target。算法搜索潜在的可能性gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-通过基因组浏览器和基因组注释，目标基因基本上接近lncRNA(在上游或下游10 kb窗口内)。算法，搜索潜在的gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba基于mRNA序列互补和RNA双能预测，评估lncRNA结合对整个mRNA分子的影响。首先，BLAST用于选择lncRNA对应的靶序列(E-value <1e-5，同一性≥95%)。然后，利用RNAplex (G <−20)软件分析两个序列之间对应的能量，进行附加筛选和选择电位gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba代理的目标基因。为了预测不同表达的lncrna的功能，我们对靶基因进行GO富集分析，认为Q < 0.05的GO项显著富集。gydF4y2Ba

采用MIRANDA、PITA和RNAHYBRID三种不同的计算方法来识别DY和QJN2之间的DEKLs和DENLs潜在靶miRNAs。只有所有三种方法确定的目标才得到进一步审议。gydF4y2Ba

miRNA的分离及qRT-PCR表达分析gydF4y2Ba

根据Wang等人的研究，同样的RNA-seq样本也被用于分离低分子量rna。[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．采用茎环qRT-PCR法检测miRNAs，所有引物见附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．qRT-PCR如前所述进行。反应在95°C孵育3分钟，然后在94°C孵育20秒，62°C孵育20秒，72°C孵育40秒，循环40次。5S被用作个别样本的内部控制。对于每个生物重复，进行三个技术重复。gydF4y2Ba

UPLC法测定植物激素含量gydF4y2Ba

通过RNA-seq结果，我们发现植物激素信号转导是第四个重要的富集途径。植物激素在花的发育和分生组织活性中起着重要作用。因此，我们选择了包括GA在内的候选激素gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba分别在分化前期、分化前期和分化后期分别检测QJN2和DY的花蕾中含量。按照Chen和Yang描述的方法进行激素的提取、纯化和定量分析[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba使用超高效液相色谱(UPLC)进行轻微修改。用液氮冷冻的1 g花蕾磨成细粉，然后浸入5 ml 80%预冷甲醇(4:1，gydF4y2BavgydF4y2Ba/v，−20°C)。之后，用5ml预冷甲醇冲洗研钵和研杵，将混合物收集在50ml管中。混合物在4℃暗室提取12小时，然后在4℃10000rpm离心15分钟。上清收集在一个新的50毫升管和沉淀物浸入5毫升80%预冷甲醇再次通过前面所述。将上清混合，加入交联聚乙烯吡咯烷酮0.2 g, 4℃暗室震荡1 h。之后，混合物在4℃下以10000转/分离心15分钟。收集上清液，用Sep-Pak C18柱过滤，以减少杂质。滤液冷冻干燥36 h以上得到粉末。然后，用1毫升预冷甲醇溶剂化粉末。用0.45 Millipore过滤器(有机系统)过滤上清液，保存在- 20°C，直到UPLC定量植物激素。gydF4y2Ba

UPLC (ACQUITY UPLC H-Class Core System, Waters, Inc.， USA)配备T3色谱柱(3 μm粒径，100 mm × 2.1 mm, Waters, USA)进行分离。流动相为水:乙酸(99.5:0.5)为溶剂A，甲醇为溶剂C。流速为0.35 ml/min，柱温为30℃。在Waters体系中注入量为2 μl。获得色谱图，激素在256nm的紫外吸收吸收。在此条件下，植物激素的保留时间为ZT 3.6 min, GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba5.3分钟，IAA 6.1分钟。每个样品接种三次进行生物复制。gydF4y2Ba

ZT处理影响AP2基因的表达gydF4y2Ba

用1 mmol/L ZT水培处理枝条，分别于0 h、12 h、24 h、48 h采集花芽。以0 h处理为对照。按照制造商的协议，使用Trizol试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)从花蕾中分离总RNA。gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba基因表达采用qRT-PCR方法进行鉴定。gydF4y2Ba

实时定量RT-PCR分析gydF4y2Ba

采用qRT-PCR方法确定候选基因及lncrna表达。同样的RNA样本被用于qRT-PCR和RNA-seq实验。此外，我们提取用于检测表达的RNA和miRNA。使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen, San Diego, CA)合成第一链cDNA，使用总RNA。使用Beacon Designer 7软件(Premier Biosoft, Palo Alto CA)设计基因特异性引物渲染基因序列，见附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．管家基因特异性引物(gydF4y2BaRP二世gydF4y2Ba)用来标准化反应[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．qRT-PCR使用ABI 7300实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和SYBR Green实时PCR Master Mix (toyoobo, Osaka, Japan)进行。实验采用上述方法进行[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．每个生物复制执行三个技术复制。用2计算基因和lncrna的相对表达量gydF4y2Ba^{-gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCTgydF4y2Ba}方法。gydF4y2Ba

龙头:gydF4y2Ba

内源性rna竞争gydF4y2Ba

CNCI:gydF4y2Ba

Coding-Non-Coding指数gydF4y2Ba

中国共产党:gydF4y2Ba

编码潜在的计算器gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

DEKLs:gydF4y2Ba

差异表达的已知lncrnagydF4y2Ba

DNELs:gydF4y2Ba

差异表达的新型lncrnagydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书gydF4y2Ba

LncRNAs:gydF4y2Ba

长非编码rnagydF4y2Ba

RPKM:gydF4y2Ba

每千碱基转录本每百万映射片段的读取gydF4y2Ba

扫描电镜:gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

感谢果树生物技术实验室所有研究人员对本研究的贡献。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究主要得到国家重点研究发展计划项目(2018YFD1000107)、国家自然科学基金项目(31500571、31772282)、中国博士后科学基金项目(2018 M640497)、江苏省博士后科学研究基金项目(2018K216C)和江苏省“人才六峰工程”项目(NY068)的资料收集、数据分析和实验支持。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究描述的测序数据已提交到NCBI序列读取档案(SRA登录号:QJN2 1: SRR7007150, QJN2 2: SRR7027384, QJN2 3: SRR7012247, DY 1: SRR7006118, DY 2: SRR7006119, DY 3: SRR7006910)。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 吴欣欣和史婷对这项工作贡献相同。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 南京农业大学园艺学院，江苏南京210095gydF4y2Ba

   吴欣欣，史婷，沙希德·伊克巴尔，张勇，高志宏gydF4y2Ba

2. 江苏省园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京210095gydF4y2Ba

   鑫鑫吴gydF4y2Ba

3. 深圳大学生命科学与海洋学院，广东省植物表观遗传学重点实验室，广东深圳518060gydF4y2Ba

   林刘gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

ZG构思并设计了该研究。XW和TS进行了实验，分析了数据，并撰写了手稿。SI、YZ、LL参与数据分析并撰写稿件。所有作者都阅读并认可了稿件的最终格式。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaZhihong高gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用署名4.0国际许可协议发布(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否有更改。创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条提供的资料。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba