两种NCA1同种型以互斥的方式与过氧化氢酶相互作用，以减少其在水稻中的活性

背景

NCA1 (NO CATALASE ACTIVITY 1)是最近在拟南芥作为伴侣蛋白，通过维持过氧化氢酶(CAT)的折叠来调节其活性。该基因主要存在于高等植物中;一些植物，如拟南芥，只包含一个NCA1而其他一些基因，如大米，则有两个拷贝。目前尚不清楚这两种异构体是否以及如何在那些含有两个拷贝的植物物种中发挥调节CAT活性的作用。

结果

在本研究中，我们首先注意到NCA1a和NCA1b水稻植物非常相似。随后的BIFC和酵母三杂交实验证明了NCA1A和NCA1B均显示互斥，而不是同时与猫的相互作用。对于进一步的功能分析，nca1a和nca1b利用CRISPR/Cas9可产生水稻的单突变体或双突变体。对这些突变体在正常和盐胁迫条件下的分析发现，与野生型相比，这些突变体均为野生型nca1a或nca1b单突变体的表型和CAT活性无差异，双突变体的CAT活性一直很低(约5%)，表型严重。

结论

这些结果表明，NCA1a和NCA1b与CAT存在互斥互作，以功能冗余的方式调控CAT活性。

过氧化氢酶(CAT)是一种含血红素的酶，主要催化H₂O₂生产H₂O, O₂在植物1]．CAT通常由质量为50-70 kDa的多肽组成，这些多肽被组织成四聚体，每个单体带有一个血红素辅基[2]．目前已知的所有植物，包括单子叶植物和双子叶植物，如烟草，拟南芥，玉米，南瓜和水稻都含有三种CAT基因[1]．三个基因拟南芥，命名为CAT1,Cat₂,CAT3.，编码三个对应的蛋白质，由492个氨基酸组成，氨基酸序列之间相似性很高。在水稻基因组中确定的这三个基因被命名为目前,CATB和CATC分别为(3.]．基因结构和功能的比较发现，OSCATA对应于ATCAT3，OSCATB至ATCAT1，以及OSCAT2 [4]．

AtCAT1主要表现在花粉和种子中，而AtCAT2主要表达在光合活性组织和AtCAT3在血管组织和衰老叶中[4]．已知过氧化氢酶存在于过氧化物酶体中，尽管有证据表明在不同的细胞器中检测到过氧化氢酶活性[4]．而AtCAT3淘汰赛只略微减少了猫活动;删除AtCAT2减少80%的活动量;相反，当删除时AtCAT1对猫活动没有影响[4，5]．未观察到明显的表型CAT1或CAT3 -贬义拟南芥,而cat2突变体显示许多过程中的缺陷，包括光抑制和发病机制，水杨酸依赖性过敏反应响应状病变形成[6，自噬依赖性细胞死亡[7，以及在生物和非生物逆境(包括冷、热和干旱)中基因表达的改变[5，8]．在水稻中，这三种亚型在过氧化氢酶活性中的作用尚不清楚。我们最近的研究结果表明，CATC占水稻叶片CAT活性的大部分[9]，它的敲除突变体表现出细胞死亡表型，类似于cat2突变体的拟南芥［10]．

植物猫是一种植物植物不可或缺的关键抗氧化酶，以应对不良环境应激，因此了解催化剂是如何调节的尤为重要。在其转录层面的规范得到了广泛研究，并且涉及许多因素参与调节，例如昼夜节律，反应性氧物种（ROS），衰老和ABA信号传导[11，12，13，14]．CAT也可以在蛋白质水平上进行调控。在拟南芥，LSD1（病变模拟疾病1），一种锌手指蛋白，通过与胞质溶胶中的猫蛋白相互作用来改变他们的活动[15，16]．HSP17.6CII，过氧化血小热休克蛋白和伴侣，显示出在过氧化物酶体中与CAT2相互作用，并增加猫活动[17]．此外，CAT3活性可能通过CPK8的蛋白磷酸化调控，以响应干旱胁迫[18]．钙调蛋白(19]，核苷二磷酸激酶1 [20.，盐过敏感2 (SOS2) [21]和三基因阻断蛋白1 [22]也被报道能够与CAT相互作用。但是这些相互作用蛋白如何调节CAT仍然不为人所知。NCA1 (NO CATALASE ACTIVITY 1)是最近在拟南芥NCA1作为一种伴侣蛋白，可以将过氧化氢酶折叠成一个功能结构，NCA1 n端环指结构域的锌离子结合对CAT2的完整功能至关重要，而NCA1 C端四三肽重复结构域介导了与CAT2的相互作用[5，7]．更有趣的是，NCA1与细胞溶溶胶中的猫相互作用，而猫功能在过氧化物酶机中进行[5]．有些植物只含有一个NCA1基因，而有些植物的基因组中有两个同源基因。这两种含有双拷贝的植物中，两种亚型在调控CAT活性方面的作用是相同的还是不同的，以及它们如何实现这一功能仍有待研究。

水稻作为单子叶模式植物，具有两个NCA1基因，因此在水稻中解决上述问题尤为有趣。本研究对水稻两种NCA1亚型的功能和机制进行了比较研究。结果表明，NCA1a和NCA1b与CAT存在互斥互作，在水稻中以功能冗余的方式调控其活性。

NCA1基因主要存在于高等植物中

NCA1首先在拟南芥，只有一个基因在其基因组中[7),而两NCA1基因在水稻基因组中被鉴定，因此命名为OsNCA1a(Os01g0104100)和操作系统NCA1b（OS02G0795300），这两个mRNA序列和这三个多肽NCA1基因高度相似(附加文件1表S1)。为了研究OsNCA1a和OsNCA1b的进化，以OsNCA1a和OsNCA1b的全长蛋白序列为输入，构建了系统发育树。研究发现，有些物种有一个NCA1基因，有些有两个。大多数携带NCA1基因的生物都是高等植物(附加文件)2图S1)。未发现NCA1同源基因HOMO SAPIENS.，Musmusculus.，黑腹果蝇，caenorhabditis.，酿酒酵母，大肠杆菌，Zosteramarina，Spirodelapolyrhiza，泥炭藓，Ostreococcuslucimarinus.，Oropetium.，Micromonaspusilla，Marchantiapaleacea，杜氏，Coccomyxasubellipsoidea．

时空表达模式和亚细胞定位

OsNCA1a和OsNCA1b在不同器官中均有明显的表达，其中叶片的表达量最高。1a).除了子叶的转录水平较低外，水稻叶片在不同生育时期的转录水平相似(图2)。1b).人们还注意到，这两个基因表现出非常相似的表达模式，这表明了一种可能性OsNCA1a和OsNCA1b可能已冗余功能。检查两种蛋白质的亚细胞定位，C末端和N末端GFP标记OsNCA1a和OsNCA1b并转染到水稻原生质体中。共聚焦显微镜观察显示，OsNCA1a和OsNCA1b均定位于胞质(图)。1c)，与AtNCA1的位置一致拟南芥［5]．

OsNCA1a和OsNCA1b同样可以激活CAT

只有一个NCA1基因存在于此中拟南芥，它通过维持CAT的折叠来调节CAT的活性[5]，而米饭中有两个同源物（附加文件2图S1)。从转录分析(图。1)暗示了两者NCA1基因在水稻中可能具有相似的功能，这两种亚型是否能够同样或不同地激活CAT仍然是下一个有趣的问题。如图所示。2一个,当OsCATC单独表达于大肠杆菌， CAT活性较低，比活性约为120 μmol H₂O₂最小值⁻¹ mg⁻¹蛋白质;当OsNCA1a或OsNCA1b发生了OsCATC，猫活动增加了160多个折叠，高达20,000μmolH₂O₂最小值⁻¹ mg⁻¹蛋白质。这一结果清楚地表明，OsNCA1a和OsNCA1b都能同等地激活水稻中的CAT。与此同时，人们注意到，当OsCATC单独表达时，大多数CAT蛋白以不溶性蛋白的形式包含在包涵体中(图。2b);当OsNCA1a或OsNCA1b发生了OsCATC，更多的CAT蛋白以可溶性蛋白的形式分布在上清液中(图。2b）。该结果意味着osnca1a和osnca1b都可以帮助猫满足正确的折叠，基于蛋白质具有正确折叠的蛋白质将变得更加可溶，并出现在上清液中大肠杆菌， 反之亦然 [23]．

OsNCA1a和OsNCA1b与CAT相互排斥

首先，利用水稻原生质体瞬时表达系统进行了BiFC实验。如图所示。3.a，两种NCA1亚型都能与CAT相互作用，而NCA1a和NCA1b之间没有相互作用。下一个问题是，这两种异构体是同时作用，还是相互作用，与CAT实现功能。为了回答这个问题，我们进行了酵母三杂交试验。结果表明,NCA1a和NCA1b不能与NCA1a或NCA1b(酵母转化与pBridgeBD-NCA1a pGADT7-NCA1a / pGADT7-NCA1b不能长在SD-MWLHA媒体),这表明NCA1a或NCA1b单分子之一是激活的猫(图的函数形式。3.b)。此外,结果也表明,猫只有一个绑定域NCA1与一个分子相互作用,不能作为多个NCA1脚手架蛋白分子的记者在酵母三辆混合动力系统(酵母基因表达改变与pBridgeBD-CATC pGADT7-NCA1a / SD-MWLHA pGADT7-NCA1b会增长pBridgeBD-NCA1a + MCSII-CATC和pGADT7-NCA1a / pGADT7-NCA1b转化的酵母不能在SD-MWLHA培养基上生长;通过CAT活性测定验证MCSII位点CATC的表达)(图。3.B和c）。因此，可以进一步推断出猫以1：1的分子比以NCA1A或NCA1B相互作用，以支持先前的结果[5]．

表型和CAT活性nca1a / nca1b.单双突变体

为了进一步揭示其生理功能NCA1a和NCA1b在水稻中，它们的单一和双突变体由CRISPR / CAS9产生。每个SGRNA靶向区域的序列对准显示，分别获得三种类型的突变体，其中NCA1a或NCA1b或者两者都发生突变(图。4）.在正常情况下nca1a或nca1b与野生型相比，单个突变体在整个生长过程中没有任何表型差异nca1a / nca1b.双突变体在整个生长过程中，叶片表现出明显的病变甚至白化症状(图2)。5一种）。当双突变体在高co下生长₂（3500 ppm），抑制了光素，因此₂O₂生产，减少病变表型（图。5b)，尽管在双突变体中CAT活性仍下降95%以上，但在空气和高CO之间没有显著差异₂条件(图。5c和d)。因此，病变表型nca1a / nca1b.双突变体可能是由累积的光致炮H导致的₂O₂．

盐度压力对的影响nca1a / nca1b.单双突变体

只有一个NCA1基因存在于此中拟南芥它的突变已经被证明是对盐度过敏[5]．在这里，我们测试了盐度压力的影响nca1a / nca1b.水稻单敲除和双敲除突变体。首先，表型观察表明，在盐胁迫下，单个突变体与WT没有明显差异，但双突变体的损伤程度比WT更严重(图2)。6a).活性检测结果显示，双突变体在WT植株中仍然只有5%的CAT活性，与正常条件下的结果相似(数据未显示)，而单个突变体的活性与WT植株没有显著差异(图2)。6b）。

过氧化氢酶(CAT)是生物体内一种重要的抗氧化酶。通常在植物基因组中存在3个CAT基因，包括拟南芥，米饭，烟草，玉米，南瓜等[1]．除了清除H₂O₂， CAT在植物的生长发育和逆境响应中起着重要的作用[1]．在拟南芥的淘汰赛CAT2.导致过氧化氢酶活性损失80%，对盐度、强光和低温敏感，但对LiCl和羟基脲(HU)耐受性强[5，24，25]．水稻CATC占过氧化氢酶活性的绝大部分，主要分布在水稻叶片中[9]．由于CAT蛋白在植物中含量丰富，过表达CAT基因在正常情况下不会显著增加植物过氧化氢酶活性，也不会影响植物的生长和对逆境的响应。然而，也有少数研究表明，将细菌过氧化氢酶引入植物中，可提高植物过氧化氢酶活性，提高植物对氧化胁迫、NaCl和强光的抗性[1]．尽管这种酶很重要，但它的调节机制，特别是在蛋白质水平上，还不清楚。NCA1蛋白最近被鉴定出来，它被证明是一种伴侣蛋白，通过帮助CAT正确折叠来激活CAT [5，7]．NCA1基因存在于高等植物中，有些物种有一个基因，有些有两个副本2图S1)。根据系统发育树，似乎没有常规模式进行分类和进化。在调节猫活动中，两种含两种含有植物种类函数的同种型是否冗余或不同地冗余或不同地尚未知道该功能。作为单象间模型植物，米哈尔斯二NCA1因此，在水稻上解决上述问题是特别有趣的。首先，我们的时空表达模式分析，结合生化研究，表明OsNCA1a和OsNCA1b在激活CAT方面的作用是相同的(图)。1；无花果。2）.

随后的BiFC和酵母三杂交实验证实，OsNCA1a和OsNCA1b在胞质中与CAT相互排斥(图)。3.；无花果。4）.CAT是一种过氧化物酶体基质蛋白，新生过氧化物酶体蛋白在细胞质自由多聚体上翻译[9，所以OsNCA1a和OsNCA1b可以调控细胞质中CAT活性，这与Li等(2015)的研究结果一致[5]．此外，他们还检测到胞质中新生的CAT与NCA1相互作用，并以1:1的比例形成复合物。我们的酵母三杂交结果仍然表明，在水稻中CAT与NCA1a或NCA1b以1:1的分子比例相互作用。目前尚不清楚CAT与NCA1如何相互作用。以往的研究表明，TPR结构域作为蛋白质相互作用支架，形成不同的蛋白质复合物[26]．

Li et al.(2015)也有报道拟南芥NCA1缺陷对盐胁迫高度敏感[5]．我们最初也想象过，在那些含有两种植物的物种中NCA1基因，这两个NCA1基因可能在某些情况下同时需要，很可能是在不利条件下。但是,通过使用nca1a / nca1b.单一和双敲除突变体，揭示了在正常和盐度胁迫条件下冗余的两个基因函数（图。5；无花果。6）.这种功能冗余的基因在生物体中经常被注意到。例如，Blanvillain et al.(2008)指出了两个XPO1 (EXPORTIN1)基因在拟南芥,即,XPO1a和XPO1b，被证明在调节母体到胚胎的转变方面具有功能冗余[31]．在肿瘤坏死因子受体相关因子(traf13, Tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF)中鉴定到两个蛋白MUSE 13和MUSE14拟南芥，作为多余的免疫调节因子[32，33]．尚未理解为什么这种冗余基因/蛋白质自然存在，但我们相信这两个NCA1基因/蛋白质可能在某些尚未确定的情况下同时需要，基于之前的报告，CAT活性可以被各种胁迫调控，包括干旱、寒冷、H₂O₂、甲基紫精(MV)、强光或热冲击。

我们的研究发现，水稻中存在两种NCA1亚型(NCA1a和NCA1b)，它们与CAT相互排斥，并对CAT活性进行功能冗余调控。进一步证明，CAT与NCA1a或NCA1b以1:1的分子比例相互作用。虽然冗余基因/蛋白质在生物体中普遍存在，但我们的研究发现，这两个同源蛋白以互斥的方式相互作用实现其功能。我们认为这两个NCA1基因/蛋白可能在某些特定的环境下同时被需要，基于之前的报道，CAT活性可以被包括干旱、寒冷、H₂O₂、MV、强光或热冲击[27，28，29，30.]．

植物材料和生长条件

米 （栽培稻l）CV。中华11（粳草组）我们的实验室保存用于产生nca1a / nca1b.单、双敲除突变体并进行功能分析。在温室条件下，预先发芽的种子在Kimura B完全营养液中生长[34]．生长室中每一种处理的条件在每个图的图例中都有说明。

质粒建设

的完整的orfOsNCA1a(Os01g0104100)和OsNCA1b(Os02g0795300)通过RT-PCR从水稻叶片中克隆得到CATC(Os03g0131200)克隆自之前描述的表达载体[9]，然后是的orfOsNCA1a，OsNCA1b,OsCATC是亚克隆到pBridge和pGADT7酵母三种杂交测定载体（Biosciences Clontech，Palo Alto，USA）。用于表达重组蛋白大肠杆菌,OsNCA1a / b序列被插入pET28a向量的BamH我和Xho我的网站和OsCATC序列插入pETDuet-1第一个mcs之间生态R我和欣第三维网站。对于亚细胞定位，的orfOsNCA1a，OsNCA1b被引入到Pyl322-Di.，在CAMV35S启动子的控制下。的Pyl322-Di.华南农业大学生命科学学院刘耀光博士提供。对于构造BiFC向量，的orfOsNCA1a，OsNCA1b和OsCATC插入了pSAT6-cEYFP-C1（CYFP）矢量或PSAT6-NEYFP-C1(NYFP)向量[36]．用于PCR的引物列于附加文件3.表S2。

亚细胞定位与双分子荧光互补(BiFC)

如先前描述的张等人，分离出水稻原生质体。（2011）[35]．亚细胞定位，10 μgPyl322-Di.-OsNCA1a / OsNCA1b将-GFP构建物通过peg介导转染到100 μL原生质体中，然后将原生质体在25°C暗培养16-24 h。

对于BiFC，的向量pSAT6-cEYFP-C1（CYFP）;向量的PSAT6-NEYFP-C1(NYFP);CYFP-CATC + NYFP-NCA1A / NCA1B：CATC融合eYFP在c航站楼和nca1a / nca1b.和eYFP然后将N-末端共转染到水稻原生质体中;CYFP-NCA1a + NYFP-NCA1b：NCA1a融合eYFP在c航站楼和NCA1b和eYFPn端转染水稻原生质体;CYFP-CATC + NYFP：CATC融合eYFP在c航站楼和NYFP作为空白载体转染水稻原生质体。5μg (NYFP-标记的结构物和5 μgCYFP-标记的构建物通过peg介导共转染到100 μL原生质体中。然后原生质体在25°C暗培养12 h [35，36]．最后使用Zeiss LSCM 780系统捕获共聚焦图像。

RNA分离和QRT-PCR

用Trizol试剂(Life Technologies, USA)从水稻叶片中提取总RNA，用RNase free- dnase (Amersham, USA)处理。用NanoDrop-1000 (NanoDrop, USA)检测纯化的RNA的质量和数量。用日本丰保株式会社ReverTra Ace合成第一链cDNA。设计特异性引物对进行qRT-PCRNCA1使用NCBI Primer-Blast评估基因，以及这些引物的特异性（附加文件3.表S2）。QRT-PCR在10μl反应混合物中进行，由5μl2×Sybr Green PCR主混合物（每种引物的Toyobo，Japan），0.2μm和2μl适当的稀释cDNA中。根据制造商的说明，通过DNA发动机Opticon2实时PCR检测系统和Opticon Monitor软件（Bio-Rad，USA）测量每个基因的转录水平。数据被标准化为OS的扩增actin1.基因（OS03G0718100）。呈现定量实时PCR数据的方法是比较C._T方法(2^——ΔΔC_T方法)。

重组蛋白的表达大肠杆菌和他们的净化

的pET28a-OsNCA1a，pET28a-OsNCA1b，pETDuet1-NhisCATC,pETDuet1-NhisCATC-OsNCA1质粒转化为大肠杆菌在含卡那霉素或氨苄西林的Luria-Bertani (LB)平板上进行筛选，然后进行菌落PCR。用1 mM的异丙基硫代-β- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG)在16℃过夜诱导蛋白表达。重组蛋白经镍柱纯化，按生产工艺流程进行。所得蛋白用SDS-PAGE进行分离。

酶测定和蛋白质测定

在含有50 mM PBS (pH 7.4)， 25 mM H的反应混合物中，用紫外分光光度计20测量CAT活性₂O₂在30°C。消费h₂O₂在240 nm处检测CAT活性，利用H₂O₂43.6米的⁻¹厘米⁻¹［37]．蛋白质含量测定用考马斯亮蓝G250 [38]．

一代nca1 / nca2CRISPR/Cas9单敲除和双敲除突变体

的nca1a / nca1b.根据Ma et al.(2015)，使用CRISPR/Cas9方法生成单、双突变体[39]．首先，两个sgrna分别靶向OsNCA1在不同的位置被克隆pYLsgRNA-OsU6a和pYLsgRNA-OsU6b，则向量pYLCRISPR / Cas9 pubi-H包含两个U6-GRNA单位OsNCA1a / OsNCA1b通过农杆菌(Agrobacteria tumefaciens，菌株EHA105)构建转化水稻。分别获得8个独立的品系来检测CRISPR/Cas9的功能。从转基因植物中提取基因组DNA，利用设计靶位侧翼的引物对进行PCR扩增。对扩增子进行测序，并对每个sgRNA靶向区域进行序列比对，发现3个独立突变体(NCA1A，NCA1B和NCA1A / NCA1B)是可靠的，单靶基因和双靶基因功能缺失(图。4b）。

酵母三杂交试验

根据标准方法进行酵母培养和三种杂交程序[40]．在酵母中，三 - 杂交测定细胞用双顺声矢量转化细胞pBridge和pGADT7(美国帕洛阿尔托生物科技公司)。pBridge包含两个不同的多克隆位点，以允许BD (DNA结合域)融合和第三种蛋白的表达。当pBridge与pGADT7广告（DNA活化域）融合载体可以建立依赖于第三种蛋白质的表达的“三杂交”系统。合适的共同转型双相障碍和广告构造(广告-NCA1a，广告-NCA1b，双相障碍-CATCBD -NCA1a，双相障碍-NCA1b)进入酵母Y2Hgold细胞(Biosciences Clontech, Palo Alto, USA)。在不含蛋氨酸/色氨酸/亮氨酸(SD-MWL)或蛋氨酸/色氨酸/亮氨酸/组氨酸/丙氨酸(SD-MWLHA)的选择性退出培养基上检测诱饵(BD)和猎物(AD)载体转化的酵母，以检测三者之间的相互作用。在每一种情况下，都要测试带有空向量的控件的结构的自我激活。

统计分析

使用Duncan在5％的多个范围测试进行统计分析（P< 0.05)置信水平。数据处理系统软件[41]。用于数据统计分析。

BiFC:

双分子荧光互补

猫:

催化剂

IPTG:

Isopropyl-thio -β-D-1-thiogalactopyranoside

NCA1:

没有过氧化氢酶活性1

存在:

实时定量聚合酶链反应

不适用。

资金

广州市科技计划项目(no . 201607020006);亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室项目(no . SKLCUSA-b201714);国家自然科学基金项目(no . 31770256,31600193);华南农业大学研究生留学项目(2017LHPY010)。

数据和材料的可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文[及其补充信息文件]中。

作者指出

1. 刘建哲、崔丽丽、谢宗旺等人对这部作品贡献巨大。

从属关系

1. 中国华南农业大学生命科学学院，广州510642，中国广东省亚热带农业学院亚热带农业学院亚热带农业学院的遗产和利用国家重点实验室

   刘建哲，崔丽丽，谢宗旺，张志生，刘伊，彭新祥

贡献

LJZ进行实验，整理原始数据。CLL准备蛋白质样品用于分析，种植水稻。XZW进行胁迫处理并进行qRT-PCR分析。ZZS和LEE撰写了手稿。PXX撰写并编辑了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到新乡彭．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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