三种新型萜烯合酶基因的鉴定和功能表征参与化学防御和非生物胁迫gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

众所周知，芳香族精油是从香椿的心材中提取的gydF4y2Ba檀香gydF4y2BaL.经济价值广泛。然而，对于植物环境相互作用期间以信号的形式，对萜类化合物响应于各种不良环境应力而言，少于萜烯酸的作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，α-檀香烯、gydF4y2BaepigydF4y2Ba-β-酸盐，β-酸盐，α-Santalol，β-Santalol，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-α-贝加马汀，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-法尼烯和β-双abolene在成熟叶片中发现gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba树。通过挖掘公开的RNA-seq数据，我们鉴定了40多个候选萜类合成酶(TPS) unigenes，并对三种cdna编码的酶进行了表征:一种单萜类合成酶主要催化α-松油醇的形成，两种多功能倍半萜类合成酶，其中一种产生(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-α-贝替烯和Sesquisabinene作为主要产品，另一种催化（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-β-法呢，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-NEROLIDOL和（gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba主要产品为法尼醇。代谢产物特征和基因表达研究证实，檀香醇含量与心材中檀香烯合成酶(SaSSY)转录本密切相关，而SaSSY是檀香醇生物合成的关键酶。然而，三个新的SaTPS基因的表达差异显著gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba在精油生产的心材。在不同组织中检测到抗氧化酶，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，过氧化物酶和抗坏血酸酯的活性增加。gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba施用1 mM茉莉酸甲酯(MeJA)和1 mM水杨酸(SA)，或4°C、38°C和高光强。MeJA和SA显著诱导表达gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在树叶。gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在不利的温度和光照胁迫下，不同组织间转录本的激活存在差异。相比之下，几乎所有gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba不同于gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

对檀香中1种叶绿体单tps酶和2种胞质倍半tps酶进行了生物化学表征。我们的研究结果表明，这三个新的SaTPS基因在生物攻击和非生物胁迫的防御反应中的生态重要性gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Terpenoids构成了所有生物体中存在的最大和最多样化的化学化合物。特别是，开花植物在生长和发育中具有异常大量的三萜类萜类化合物，包括激素，电子转移系统的组分，蛋白质修饰的试剂，膜流动性，抗氧化剂等的决定簇[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．不同的植物谱系也合成了数百种不同和专业的植物萜类化合物。传统上，专用的三萜类化合物用作天然味道和香气化合物，对人类具有有益的影响，作为促进健康化合物。此外，萜素素的生态功能越来越受到关注[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

所有植物萜类化合物都是由两个简单的五碳结构块组成，二磷酸异戊烯酯及其异构体二甲基烯丙基二磷酸，它们都来自胞质中的甲戊酸途径或质体中的甲基赤藓醇磷酸途径[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．C5前体的缩合导致戊基二磷酸，天竺葵二磷酸（GPP），法呢胺二磷酸（FPP）和二烷基甲烷基二磷酸（GGPP）的形成，随后将通过萜烯合成酶（TPS）转化为单萜，倍氏萜烯和二萜（TPS）．Terpenoid生物合成发生在特定组织中或植物中的特定发育阶段发生，例如树脂管道和腺毛状体[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

近几十年来，在萜类生物合成相关基因和酶的鉴定和功能表征方面取得了重大进展[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．许多单tps和倍半tps基因已经从几种植物中报道过，包括拟南芥(gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),小道消息(gydF4y2Bavitis ViniferagydF4y2Ba）[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]， 番茄 （gydF4y2BaSolanum lycopersicum.gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，杨树（gydF4y2BaPopulus Trichocarpa.gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，云杉（gydF4y2BaPicea.gydF4y2BaSPP。）[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba艾蒿gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]和柑橘(gydF4y2Ba素类gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．许多tps的一个不同寻常的特点是，它们能够从单个底物中产生结构和立体化学上不同的萜类化合物[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．根据序列相关性、功能评估和基因结构，将TPS基因家族分为8个亚家族，分别命名为TPS-a至TPS-h [gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．类I包含TPS-C（Copalyl Diphospate Synthase），TPS-E（gydF4y2BaentgydF4y2Ba-Kaurene合成酶），TPS-F（其他DI-TPS）和TPS-H（特定Lycopod-Code）;II类由TPS-D组成，它是裸体特异性的;III类包括高血管植物特异性TPS-A，TPS-B（环状单TPS和Hemi-TPS）和TPS-G（无环Mono-TPS）。gydF4y2Ba

植物产生许多萜类代谢物，用于适应不利的环境，包括生物和非生物应激[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．挥发性萜类化合物诱导性地发出响应植物食草动物或病原体攻击，不仅直接作为防御性的植物抗毒素用于阻止有害的攻击者也间接吸引的病原体和草食动物[天敌gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．研究表明，植物激素茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)作为防御信号在生物攻击中起重要作用[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．因此，外源应用JA和SA可以用作生物应力模拟，用于研究植物之间相互作用的机制和生物应力的机制[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，并增加特定器官在特定器官中生产植物三萜的生产，以生产专门的萜件[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．例如，在苦艾(gydF4y2Ba青蒿gydF4y2Ba），JA可以诱使gydF4y2BaAaMYC2gydF4y2Ba青蒿素生物合成过程中编码多功能细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)和青蒿醛delta-11(13)还原酶的两个基因启动子内直接结合g -box样基序的基本螺旋-环-螺旋型转录因子的基因编码[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba黄花蒿gydF4y2Ba，SA增强紫穗槐-4,11-二烯合成酶的表达水平和青蒿素产量增加[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．在agarwood (gydF4y2BaAquilaria sinensis.gydF4y2Ba），外源应用在细胞悬浮培养物中α茉莉酸甲酯（Meja），愈伤组织和植物茎诱导倍二萜化合物的生物合成和积累，尤其是δ-屈糖[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外，一些生物萜烯的发射可以通过温度和光等环境因素诱导。高温首先被认为是一种能够在斜线松树中诱导挥发性萜类化合物的一种非生物胁迫（gydF4y2BaPinus elliottii.gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．此外，在温度，光，干旱和盐胁迫下观察到从叶，花和其他叶片和草本植物中升高的各种萜烯挥发物（包括单口和酪蛋白）的升高，包括单口，花和草本植物。gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．Terpenes的生产也被臭氧，紫外-B射线和γ射线诱导，氧化应力是氧化应力的[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．一种常见的生物化学机制，所述生化机制解释了外源应力诱导的挥发性萜类化合物的发射声称，植物具有合成氧化损伤的萜类化合物的能力，导致活性氧（ROS）升高（ROS）[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

从檀香的精油中鉴定了超过150萜类化合物（gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba）心材（HW）[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．主要成分是α-和β-甲醇，但是一些次要化合物也存在，包括α-酸盐，β-酸甲戊二醇烯，α-贝钨烯和其他化合物。近年来，负责沙兰罗酚生物合成的关键基因已经在功能上表征，包括桑巴伦合酶（Sassy）[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba， SaCYP736A167和SaCYP76AF39V1 [gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］．另外5个tps，即SamonoTPS1, SasesquiTPS1, Sasesquisabinene合成酶(SaSQS1和SaSQS2)， Sabisabolene合成酶(SaBS)，也已被鉴定[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．Kulheim et al.(2014)试图通过在1岁以下幼苗叶片上施用0.01%的MeJA来提高檀香精油产量[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．他们的发现表明，在幼苗的叶片和幼苗的叶片和茎中，仅略微诱导了编码羟甲基谷族CoA还原酶（HMCR）和法呢基二磷酸合酶（FPP）的两种基因的表达水平。我们以前的研究gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba表明六个gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba编码(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-β-ocimene/α-farnesene合酶、檀香烯/佛手藤烯合酶1 (SS/BS)、橙花醇合酶1-like、月桂烯合酶、香叶醇芳樟醇合酶和SamonoTPS1在响应低温胁迫(4°C)时差异表达[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．然而，对于响应各种不良环境应力而言，对TPS的贡献很少gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在该研究中，在序列读取归档（SRC）上沉积的叶，茎和根的转录组数据进行[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba已融合以确定檀香TPS基因家族的表达成员。其中，三个gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba基因，指定为gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，被隔离和功能表征。表达模式和角色gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba比较研究了SaSSY和SaSSY对MeJA、SA和不利温度和光的响应。本研究为揭示萜类化合物在生物和非生物胁迫下的生物合成调控机制奠定了基础gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

四种组织中挥发物含量和组成的差异gydF4y2Ba

了解分配模式和组件的差异gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba利用气相色谱-质谱联用技术，对成熟乔木的幼叶(YL)、边材(SW)和枝叶(HW)以及未成熟乔木的未成熟乔木(IW)的戊烷提取物进行了分析。挥发油含量在四种组织间存在显著差异。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，在HW中检测到的挥发物最丰富(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba模拟)。在这四种组织中检测到倍半萜主要成分α-和β-檀香醇，倍半萜主要成分α-和β-檀香烯和β-檀香醇gydF4y2BaepigydF4y2Ba-β-檀香烯在YL和HW中被鉴定，而在IW和SW中未被鉴定。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba练习额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。奇怪的是，微量的α-和β-檀香烯，gydF4y2BaepigydF4y2Ba-β-檀香烯和α-檀香醇(分别为峰1、峰3、峰5和峰8)在YL中所占比例几乎相同。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae)。其中前三种化合物的分布与HW中的分布相匹配。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah，峰值1,3和5）。而且， （gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-α-贝加马汀，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba-β-法尔尼烯和β-双abolenegydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．在IH中观察到与SW和HW中的酪蛋白萜醇的几乎相同的分布（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf, g和i，峰值8-15)，表明檀香油的积累发生在茎发育的早期，随着檀香树年龄的增长，HW生物合成的檀香油更多。gydF4y2Ba

新萜类合成酶的鉴定gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba

我们结合了从NCBI下载的转录组集，包括在方法中描述的来自叶、茎和根的转录组。DgydF4y2Bae新生gydF4y2Ba从这三个组织中获得了164,548个unigenes(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2)。许多unigenes被鉴定为gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba基因，包括38个核心萜烯合成酶基因和9个三萜特异合成酶基因(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3)。其中，有6个非基因序列与之完全一致gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba提交给ncbi [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．三个unigenes包含编码tss的全长ORFs，命名为gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．为了确认使用Trinity汇编器产生的组装的未完成性能准确，我们设计了围绕预测的开始和unigenes的预测开始和停止密码子来退火的引物，以放大预测的三个ORFgydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba基因(图S2)。随后对这些核苷酸的测序表明，它们完全符合unigene组装的预测。gydF4y2Ba

三种SATPS的序列和系统发育分析gydF4y2Ba

编码的三种预测蛋白gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba预测了564至604次氨基酸的范围gydF4y2BaPI.gydF4y2BaS分别为6.01,5.02和5.03（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，SATPS1至3含有精氨酸 - 色氨酸基序，R（R）X8W，其在大多数单次TPS和N-末端附近的一些SESQUI-TPS中保存。高度保守的天冬氨酸富含的主题（DDXXD）和NSE / DTE主题，对于螯合二价阳离子至关重要，通常是MGgydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba，在C终端域中[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，出现在这三个satps中。单核苷酸和倍核苷酸之间的一个显著的结构特征是n端质体过境肽序列的存在。利用信号序列分析程序ChloroP (gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/chlorop.gydF4y2Ba），预测了用于SATPS1的44个氨基酸的推定的N-末端体层肽（TP）序列，表明它很可能是单型TPS。但是，SATPS2和SATPS3不含塑体TP序列，表明它们是SESQUI-TPSS（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。gydF4y2Ba

基于檀香TPS的推导氨基酸和其他植物物种的系统发育树表明所有gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba除SasesquiTPS和sesquitps外，tps均聚在TPS-b演化枝中gydF4y2BaS. Spicatum.gydF4y2Ba(SspicsesquiTPS)和gydF4y2BaS. AustrocaleDonicum.gydF4y2Ba（SaustsesquiTPS）（图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S5），其中大多数高原甲二烯合酶居住[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．对SATPS1的最相似的TPS序列是（ - ） - α-Terpineol合成酶的序列gydF4y2BaV. ViniferagydF4y2Ba具有63％的身份（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S6) (Martin and Bohlmann, 2004)。SaTPS2与SaSSY、SspicSSY和SaustSSY聚类最接近，bootstrap为100% (Jones et al.， 2011)，其氨基酸序列与SaspiSSY同源性最高(72%)。SaTPS3形成了一个由几个先前特征的tss组成的分支gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba种，包括SaMonoTPS, SaSQS1, SaSQS2, SaBS, SspicBS和Sspicsesquisabinene [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．生物信息学和系统发育分析表明，SaTPS2和SaTPS3可能在生产精油的参与gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

表达式三个gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba基因不同于gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba

的组织特异性表达gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba采用qRT-PCR检测YL、IW、SW和HW 4个关键组织的基因。转录丰度gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba基因表现出相似的表达模式，其中YL表达量最高(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2BaIW的表达是YL、SW和HW的3倍。相比之下,gydF4y2BaSassy.gydF4y2BaSW和HW分别在100倍和250倍。此外，这些表达水平的比较gydF4y2BaSaTPSsgydF4y2Ba在特定组织表明，gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba表达量高于gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和sagydF4y2BaTPS2.gydF4y2Ba在四个相应的组织中（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。值得注意的是gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba转录本显示相对增加200和1200倍gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在SW和HW中。这些结果表明gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba可能在HW精油的积累中发挥作用gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在萜类化合物的形成中起次要作用gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2BaHW。gydF4y2Ba

卫星定位系统的亚细胞定位gydF4y2Ba

为阐明SaTPS1 ~ 3的功能，对各个satpsyfp(黄色荧光蛋白)融合蛋白的亚细胞定位提供了初步的证据。基于系统发育学和生物信息学的TPSs分类分析表明，具有n端质体过境肽序列的SaTPS1-YFP定位于叶绿体中，而SaTPS2-YFP和SaTPS3-YFP则分布于整个胞质(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．根据亚细胞定位结果，SaTPS1可能参与质体中单萜的合成，而SaTPS2和SaTPS3可能参与胞质中倍半萜的合成。gydF4y2Ba

酶的功能表征编码的酶gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba

将所有cdna亚克隆到pET28a载体中，并成功表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用Ni-NTA琼脂糖亲和柱纯化Rosetta 2 (DE3)感受态细胞和重组蛋白(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S5）。我们发现这种没有过境肽序列的cDNA可以改善表达gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．在体外酶活性测试之后，gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba被证实编码了催化Mono-TPS酶，催化大多数α-萜烯醇（45.7％），而西替石（14.9％），烯丙（11.7％）和牛甲烯（10.8％）以及少数次次单体萜烯，也用GPP生产为基材和MggydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba，气相色谱-质谱分析检测(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。尽管当MggydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba被锰取代gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba结果表明，3种主要化合物——芳樟醇(35.8%)、α-松油醇(25.7%)和香叶醇(12.9%)的生成水平均降低了5倍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。SaTPS1以FPP为底物与Mg反应未见萜类产物gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba或锰gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。该酶被称为α-萜品醇合酶，因为它是主要的单萜类产品，并且由于其对金属离子，Mg的偏好gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

GC-MS分析SATPS2催化的反应产物用FPP作为晶片的底物作为晶片gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba鉴定出至少15个倍半萜，gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-α-冰毛蛋白（24.8％）和蛋黄（33.0％）作为两种主要产物，β-双烯酮（9.0％），γ-双硼烯异构体（7.9％）和次要化合物，7-gydF4y2BaepigydF4y2Ba-sesquithujene，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-β-法呢烯，α-Zingiberene，以及其他相对比例的其他比例小于5％（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一种;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。类似的产品型材包含主要化合物（gydF4y2BaEgydF4y2Ba当Mg时，检测到 - α-贝替烯（22.4％）和辛辛烯（35.6％）（35.6％）gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba被锰取代gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba，但总体收益率相对较低(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S7，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。用GPP孵育SATPS2作为基材和MggydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba离子导致九种单波通的产生（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。最丰富的化合物是LILLOOL（64.9％）。同样，用mn测定gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba而不是mg.gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba结果显示，几乎观察到相同的化合物，但总收率降低了5倍(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S8，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。总之，这些结果表明，SATPS2是多功能Sesqui-TPS生产专业（gydF4y2BaEgydF4y2Ba） - α-冰醇和塞曲在胞浆中的胞嘧啶。gydF4y2Ba

SATPS3分别将FPP和GPP基材转换为Sesqui和单萜产品。当用FPP和MG测定时gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba，重组SaTPS3催化合成了7种化合物，包括(gydF4y2BaEgydF4y2Ba) - - -β法呢烯(20.7%)、(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-NEROLIDOL（29.8％）和（gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba)-法尼醇(21.3%)为主要产物，γ-双abolene的比例也很高(13.8%)(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba一个额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。在Mn的存在下gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba， SaTPS3重组酶无活性，说明SaTPS3对Mg有一定的偏好gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba在与FPP的反应中。用GPP孵育SATPS3后形成的反应产物的分析表明，主要产物LINALOOL（44.8-53.3％）用Mg形成gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba或锰gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba在相当大的产量（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab,额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S9，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。对于在本研究中测试的三种SATPS，从而制备的提取物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba以缺失cDNA插入片段的PET28a和热变性酶制剂为对照，未观察到萜烯产物。在所有病例中，表达蛋白与GGPP孵育后均未产生可检测的产物。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2BaGPP纯化SaTPS1的值为9.08±1.26 μMgydF4y2BaKgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba价值为0.0171（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S10)。SaTPS2和SaTPS3酶不仅可以接受底物FPP，还可以接受单萜前体GPP，如上所述。SaTPS2的酶动力学性质表明，与FPP和GPP的催化作用相似gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba和gydF4y2BaKgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba．的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2BaFPP对SaTPS3的重组值为16.29±1.48 μM，略高于GPP。的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba使用FPP比GPP相对较低，表明与GPP孵育时，该SESQU-TPS催化的效率更高。gydF4y2Ba

多重应激处理下升高的抗氧化酶活性gydF4y2Ba

植物激素JA和SA通过提高ROS水平在调节防御信号网络中起着关键作用[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba］．此外，Terpenes缓解非生物应激的机制表明，通过与不饱和异戊二烯，单萜和筛分萜烯反应可以淬灭有害的ROS的一般抗氧化机制[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，超氧化物歧化酶(SOD)的活性是OgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba到HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在存在升高的ROS水平下，在所有处理下显着增加，除了暴露于4°C，38°C和高光强度的叶片（约250μmolmgydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba})(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa).过氧化氢酶(CAT)在抗氧化系统中起重要作用，因为它能使植物消除HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过将HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba进入O.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO（Miller等人，2008）。CAT活性强这两个诱发剂升高。当三个组织暴露于温度和光的应力，CAT活性被上调，作为一个轻微唯一的例外降低了叶片响应于高的光强度（图gydF4y2Ba9gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

类似地，过氧化物酶（POD），其排毒H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在植物细胞的叶绿体和细胞溶质中，也构成了主H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-细胞内的清除系统[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba］．各处理POD活性均增加，根系POD活性是叶片的2倍。gydF4y2Ba9gydF4y2Bac).相反，叶片中SOD和CAT活性相对高于茎和根，且不受处理或未处理的影响，说明不同组织中SOD、CAT和POD的内源活性存在差异。抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)通过清除HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在不同的细胞隔间[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba9gydF4y2BaD，MEJA，SA，冷，热和高光强化处理下的大多数组织中，APX活性显着增加。因此，SOD，CAT，POD和APX活动的增加表明gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba苗外应力响应，保护细胞膜免受氧化应激，这表明这些酶耐受玩角色激发剂和环境压力gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．此外，不同的逆境胁迫对抗氧化酶活性的影响也因组织而异。gydF4y2Ba

激活gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba基因表达响应MEJA和SAgydF4y2Ba

探讨三个人的反应gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba基因在诱导子以及高温和高光强度处理下，转录水平为gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba采用qRT-PCR检测。gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在对两个激发子的反应中表现出相似的表达模式。如图所示。gydF4y2Ba10.gydF4y2Baa和b，外源MeJA和SA显著诱导表达gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba与对照相比，24小时的叶片中的基因分别超过170-130倍，分别增加。gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在施用MEJA后，转录物在茎和根部也显着增加。gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba与相应的对照相比，在叶片，茎和根中被激活，茎，茎和根部，其含量约为5-，3-和4倍（图。gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba相比之下,c)。gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2BaSA在叶片中的表达显著上调，而在茎和根中的表达则显著降低。此外，积累gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba转录物类似于gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba在meja和sa治疗下的叶子。然而，两个外源激素导致减少gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba与对照相比，根中的表达（图。gydF4y2Ba10.gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

不利的温度和高光诱导差分积累gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba

SaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba与对照相比，在4℃和38℃下抑制表达水平，但在根中被显着激活（图。gydF4y2Ba10.gydF4y2BaE-g)，表明叶片的氧化损伤比茎和根严重。当暴露在强光下时，gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba转录本在茎和根中的表达量高于叶gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba，茎部增加了25倍。的水平gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba在4°C、38°C和高光强胁迫下，根中转录本最高，分别比对照增加约2倍、6倍和8倍。相反,gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba与对照相比，转录物仅在4℃下在4℃下增加约2倍。在所有其他情况下，表达水平gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba在检查的所有组织中，在某种程度上被下调（图。gydF4y2Ba10.gydF4y2BaH）。gydF4y2Ba

候选人gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba由RNA-seqgydF4y2Ba

下一代测序已经成为从非模式植物物种中发现新基因、酶和分子标记的一个有前景的平台。近年来，转录组学方法被广泛应用于萜类代谢基因的挖掘gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba．研究主要集中在SALPS，包括Samonotps，Sassquitps，Sassy，Saussy，Sspiss，Sasqs1，Sasqs2，Ssps，Saubs，Sspib和Sspitps4的克隆和表征gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．celdon等人(2016)[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba找到了30多个gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba从HW-特定转录的转录物。在本研究中，一组gydF4y2BaSaTPSsgydF4y2Ba基于来自叶，茎和根部的转录组数据的组合鉴定，暗示gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba可能有一个中等大小的gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba基因家族根据其他贪眼TPS的分类[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．目前，基因组组装数据gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba可用[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]，我们迫切希望获得注释的基因组，以便评估tss的确切大小gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2BaTPS的家庭。此外，还检测到一些针对不同组织的tss(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S3)，推断satps可能在不同的组织中发挥不同的作用。gydF4y2Ba

檀香醇含量与gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba成绩单在心材gydF4y2Ba

主要研究了红木心材总挥发油的主要成分gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba是α-和β-santalol，有助于超过80％的相对内容[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．SaSSY是α-和β-檀香醇生物合成的关键酶[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．我们的研究结果与之前的研究一致，即檀香精油在茎HW中积累，其次在茎SW中积累[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．但是，α-和β-桑巴罗和gydF4y2BaepigydF4y2Ba-β-檀香烯在SW中未检测到，很可能是由于检测不到或含量低。据我们所知，由α-和β-檀香烯组成的微量挥发物，gydF4y2BaepigydF4y2Ba-β-檀香烯、α-和β-檀香醇等化合物gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba在本研究中首次报道。倍半萜的分布模式与西南和西半球相似(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这些结果为揭示挥发性物质的时空分布机制奠定了基础gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．此外，高表达水平gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba在...之后gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba确认檀香醇含量与gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba记录级别(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

相比之下,gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba基因在叶片中表达量较高(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和s4a）和痕量的量（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-α-贝加马汀，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-β-法呢烯和成熟的叶片中的β-二丙烯gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba还检测到树木，表明SATPS2和SATPS3可以将FPP转换为这些倍半萜烯，其在体外酶测定中与FPP孵育时属于主要产品（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一种，gydF4y2Ba8gydF4y2Baa和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。此外，在叶提取物中未鉴定出催化的主要α-萜品醇，推断它可能很容易挥发，或者可能需要外部刺激，仍然需要探索的方面。gydF4y2Ba

SaTPS1gydF4y2Ba可能是副同源基因gydF4y2BaSamonotps1.gydF4y2Ba

琼斯等人的研究。（2008）[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]的研究表明，SamonoTPS1是一种单萜合成酶，与GPP共培养时产生8种化合物的混合物，其中α-松油醇(38.7%)和柠檬烯(35.3%)为两种主要产物。在被子植物中，α-松油醇合酶来自gydF4y2BaV. ViniferagydF4y2Ba报道为单萜合成酶，可产生14种化合物，包括主单萜、α-松油醇(50.1%)、1,8-桉油醇(11.8%)、β-蒎烯(8.5%)等[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba］．Gao et al. (2018) [gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]报道了FHTPS2在花的gydF4y2Ba小苍兰gydF4y2Ba×gydF4y2BaHybrida.gydF4y2Ba主要转化成GPPα萜品醇（78.7％）和其他一些单萜，如1,8-桉树脑（6.9％），d柠檬烯（3.9％），α蒎烯（3.2％）等。在我们的研究中，SaTPS1表现出较高的相似性，在与α萜品醇合酶序列在核苷酸水平gydF4y2BaV. ViniferagydF4y2Ba比Samonotps1，两者都具有N-末端体液过渡肽序列并密切相关（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S6）。我们的生化表征和亚细胞定位研究证实，SATPS1是单TPS，α-Terpineol合酶。集体，这些结果意味着gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba可能是一个副骨基因gydF4y2BaSamonotps1.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

tss的功能发生了分化gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba

SaSQS1和SaSQS2催化(gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba）-fpp到单一产品，sesquisabinene [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．Sspitps4催化了最丰富的蛋黄蛋白B（58％）的形成gydF4y2BaS. Spicatum.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．在本研究中，虽然系统进化树显示SaTPS2与SaSSY、SspicSSY和SaustSSY的关系比SaSQS1、SaSQS2和SspiTPS4更接近，但体外重组SaTPS2的酶学分析和亚细胞定位显示，SaTPS2的mRNAgydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba编码功能性SESQUI-TPS生产（gydF4y2BaEgydF4y2Baα-佛手烯(24.8%)和倍半isabine(33.0%)为主要产物。此外，重组SaBS和SauBS均可与FPP反应生成β-双abolene作为主要产物[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．SspiBS产生了β-双abolene和α-双abolol的混合物，以及微量的α-双abolene和法尼烯异构体[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．SaTPS2能合成相当数量的β-双abolene(9.0%)和γ-双abolene (1.6%)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S7)。一起携带，这些结果表明TPS的功能分歧gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba物种。还报告了萜类化合物生物合成的多样化gydF4y2Ba选用TPSgydF4y2Ba基因[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在被子植物中，只有玉米基因gydF4y2BaTPS1.gydF4y2Ba生产(gydF4y2BaEgydF4y2Ba) - - -β法呢烯(26%)、(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)-橙烯醇(29%)和(gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-Farnesol（45％）作为体外唯一的产品[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba］．在系统发育上，SaTPS3与其他TPSs是同源群gydF4y2Ba檀香gydF4y2BaTPS-b组的spp.(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．SaTPS3的功能类似于玉米中的TPS1，它催化三种主要化合物的形成，即(gydF4y2BaEgydF4y2Ba) - - -β法呢烯(20.7%)、(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-NEROLIDOL（29.8％）和（gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba）-Farnesol（21.3％）。然而，SATPS3另外合成γ-双代和丁烯，氨基氢丁烯和两种未定量的未检测到28％的相对量，表明SATPS3不是高度保守的高度保守的TPS。功能的多样性可能是单子叶植物和双旋肌中适应性选择的演变。gydF4y2Ba

SaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在化学防御中发挥重要作用gydF4y2Ba

近年来，JA-和SA和SA和SA和SA诱导的萜件生物合成的诱导角色也得到了广泛的证明，与真菌引发和机械伤害引起的攻击中的类似角色gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba］．例如，转录水平gydF4y2BaTPS1.gydF4y2Ba生产（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-β-法呢，（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-NEROLIDOL和（gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba） - 在玉米CV体外体外。B73在草药后升高，或用5μl埃及棉叶虫重新刺激或5μl的Volicisin治疗后升高gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba］．挥发性（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-α-贝加替烯是由草食病诱导的受伤叶片的良好特征的防御化合物[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba]和鲜花[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba] 的gydF4y2Ba烟草attenuata则gydF4y2BaJA介导的信号传导诱导。迄今为止，关于TPS在植物防御中产生的α-Terpineol的作用很少。在gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba，当叶面施用0.1%的MeJA后，HMCR和FPPS编码基因在幼苗的叶片和茎中表达量轻微增加[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，活性氧(ROS)抗氧化防御系统中酶活性的增加和酶活性的急剧积累gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba通过外源应用Meja和Sa在叶子中的转录物表明gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba对抗生物应力的防御伙伴。同样，升高的水平gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2BaMeJA在三个组织中诱导的转录本(图。gydF4y2Ba10.gydF4y2Bac)推断,gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba有类似的防守角色gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba．此外，Meja导致了增加gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba茎和根部的转录物（图。gydF4y2Ba10.gydF4y2BaA和B）。统称，这表明了本地和全身的防御反应都是通过外源应用MEJA引发的gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba幼苗。这结果与Koo等人报告的调查结果相同。（2009）[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba等人(2014)[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba]在葡萄树中，其中局部激活JA及其生物活性衍生物（即Meja）作为JA信号分子在整个植物中系统性地蔓延，并在遥远器官中诱导JA反应。通常，SA主要与生物营养和血管营养病原体的抵抗力相关，并触发系统性获得的阻力[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba］．外源SA导致下调的原因gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba基因治疗的根需要进一步探讨。同时，激活的表达gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba为进一步探讨植物中檀香醇的生物合成机制提供了线索gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

SaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在不同组织对非生物胁迫的反应中发挥作用gydF4y2Ba

环境因素发挥了治疗生物萜烯的排放的重要作用。一些萜烯挥发物的发射高度依赖于温度，光和氧化应激[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．在loblolly pine（gydF4y2BaPinus Taeda.gydF4y2Ba），高光强度和温度诱导发射（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-β-法呢和（gydF4y2BaEgydF4y2Ba) -α-bergamotene [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．我们之前的工作证明了这一点gydF4y2BaSass / BS.gydF4y2Ba和gydF4y2BaSamonotps1.gydF4y2Ba积累到高水平的根gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba响应4°C [gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．在那个研究中，完整的gydF4y2BaSass / BS.gydF4y2Ba被重新发现gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在这项研究中。在本研究中，表达水平gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba在暴露后12小时后的叶子和根部与我们以前的结果相似，其中减少了gydF4y2BaSaTPS2gydF4y2Ba叶片中有转录本，根中有显著上调。虽然不利的温度和光线抑制了表达gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba基因在叶片中，高温或低温均显著诱导叶片中gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba成绩单的根源。高光强引起了显著的海拔gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSaTPS3gydF4y2Ba茎和根部的转录物。这些趋势有两种可能的原因。首先是叶片直接暴露于不利的应力，并且比茎和根更快地响应这些应力。第二是在应力响应期间，在和地下组织之间存在资源分配存在差异。然而，这些结果意味着gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba具有保护檀香免受非生物胁迫的作用。相比之下，几乎全部下降gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba治疗组织中的转录物表明环境压力影响表达gydF4y2BaSassy.gydF4y2Ba,不像gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

通过对现有RNA-seq数据的挖掘，对3个新的萜类合成酶基因进行了生物化学表征。他们被证明是多功能的单倍和倍倍tps。TPS功能分化的发生导致了多种萜类化合物的形成gydF4y2Ba檀香gydF4y2Ba我们的工作证明了这一点gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba基因在化学防御和抵御温度和光胁迫方面发挥着重要作用。本研究为评估SaTPSs在直接或间接防御病原体攻击和调节环境胁迫中的作用提供了基础。我们目前正处于过度表达的过程中gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba作为檀香基因改良计划的一部分，该计划旨在增强檀香对白粉病等病原体的抵抗力。白粉病是一种严重感染疾病gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba树叶 [gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba］．此外，应更加注重挥发性萜素体的环境意义gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba精油，其存在于高度值芳香的HW中。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

植物材料和胁迫处理gydF4y2Ba

幼叶(YL)是从10岁的成熟叶片上收获的gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba生长在凉鞋种植园的树在南中国植物园。通过钻出相同的茎，单独收集来自SW和HW组织的木屑gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba从使用Hagloff木蛀虫地面30厘米树木。为了评估幼树成绩单积累，刨花从大约直径为3 cm的也获得了未成熟的三年生树（IW，未成熟的木）茎。Tissue samples from three individuals were pooled as one biological replicate for gene expression and GC-MS analysis of volatiles, snap frozen in liquid nitrogen and stored at − 80°C until further use.

文化gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba幼苗遵循我们以前的方法[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．用含0.1% Tween 80表面活性剂的1mm MeJA或SA溶液，以每株10ml的速率喷洒6个月龄幼苗的叶片。诱导期为24 h。对照植株用0.1% Tween 80溶液以相同剂量处理。处理后的植物分别放置在不同的温室中，以避免在相同生长条件下的交叉污染。在28°C/23°C(昼/夜)、14 h光周期、100 μmol mgydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}一周光合光子通量密度。然后将它们分别暴露于4℃和38℃12小时，作为低温或轻度热胁迫处理。正常条件下生长的植物转移到高的光强度（约250微摩尔米gydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba})或以正常光照作对照。每次处理完成后分别采收叶、茎、根，迅速用液氮冷冻，置于−80℃保存至使用。从3个个体收集的样本作为一个生物重复，并重复3次作为3个独立的生物重复。gydF4y2Ba

提取挥发物gydF4y2Ba

在CeleDon等人之后提取挥发性化合物。（2016）[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]具有微小变化的方法。简而言之，Yl，SW，HW和IW样品的空气干燥一周，用200mg与5ml戊烷的地面组织提取，尖刺gydF4y2BangydF4y2Ba- 癸烷作为内标（0.05μl/ ml），然后在室温下混合48小时的端盖。在2000年被离心样品gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下20分钟，将戊烷相转移到新的GC小瓶中。然后用干燥的氮气将1μl注入1μl以进行GC / MS分析，然后用干燥的氮流减少至50μl。使用三种生物学重复进行分析，每种生物重复都包含两个技术复制。gydF4y2Ba

萜类合成酶的鉴定gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba

原始读数在Bioproject ID中下载，Prjna327296用于叶子[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]， PRJNA297453和SRR1725543用于茎[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]，和用于PRJNA243306根[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba来自NCBI的SRA数据库。使用Trinity进行从头转录组组装[gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba］．最后，使用TGICL从所有ungene中生成一组非冗余ungene [gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba］．在TPS N-末端结构域（PF01397），TPS家族金属结合结构域（PF03936），异戊烯转移和角鲨烯氧化酶重复（PF00432），和异戊烯转移等（PF13243）从Pfam数据库下载（gydF4y2Bahttp://pfam.xfam.org/gydF4y2Ba)，并用作搜寻的诱饵gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba具有10的电子值阈值的转录组gydF4y2Ba^{- 5gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

RNA提取，基因分离，qRT-PCRgydF4y2Ba

根据Kolosova et al.(2004)提取总RNA [gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba和Jones等人(2011)[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．根据制造商的说明（Promega，Madison，Wi，USA），使用M-MLV逆转录酶反转两种微RNA的微量RNA。用于放大全长CDNA的特定引物在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S8。通过使用高保真铂Taq DNA聚合酶（Invitrogen）通过PCR扩增DNA分子，克隆到PMD18-T载体（Takara Bio Inc.，Dian，中国）并在北京基因组学院（BGI）进行测序。用于QRT-PCR分析的基因特异性寡核苷酸引物在附加文件中描述gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S8。如前所述进行QRT-PCR [gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ba

Dnaman8.0（Lynnon Biosoft，San Ramon，Ca，USA）使用多个对准，并且使用Mega 6.0的邻近加入（NJ）方法构建系统发育树[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

亚细胞定位gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba年代gydF4y2Ba

对于YFP融合构建体，编码区gydF4y2BaSaTPS1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba使用T4连接酶(Invitrogen)亚克隆到pSAT6-EYFP载体(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S8和S9）。所有构建体通过BGI的DNA测序验证。如前所述将融合构建体和M樱桃荧光蛋白转化为拟南芥叶片原生质体[gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba］．转化原生质体在22℃下培养16-24 h。使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP8 STED 3X, Wetzlar, Germany)观察YFP荧光。gydF4y2Ba

重组蛋白的异源表达和纯化gydF4y2Ba

plastidial targeting peptide的缺失可提高功能性单核- tpss的表达[gydF4y2Ba77.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78.gydF4y2Ba］．SaTPS1构建了两个结构体，一个包含过境肽，另一个不包含过境肽。的gydF4y2BaSaTPSgydF4y2Ba用末端的限制酶位点设计的引物获得的cDNA片段被克隆到PET-28a载体（Novagen）中以产生6his-satps（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S8和S9）。通过BGI的DNA测序验证了构建体。他的satps重组蛋白被诱导gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaRossetta 2（DE3）应变（Novagen）根据Srivastava等人的方法。［gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．用Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN）进行重组蛋白的纯化，并在JONES等人之后，在PD-10脱盐柱（GE Healthcare）上脱节洗脱的蛋白质。方法 [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．蛋白质的浓度是用Bradford法测定的[gydF4y2Ba79.gydF4y2Ba］．纯化的重组蛋白用10% SDS-PAGE分析。gydF4y2Ba

体外酶测定gydF4y2Ba

酶促反应在2ml螺旋盖气相色谱玻璃瓶中进行，最终体积为500 μl，包含10 μg重组TPS，反应缓冲液(25 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCl)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba或MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 5 mM二硫苏糖醇和5% (v/v)甘油)，50 μM底物(gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba）-FPP，GPP或GGPP（Sigma-Aldrich）。用500μl仔细覆盖反应混合物gydF4y2BangydF4y2Ba- 己烷（Sigma-Aldrich）并在30℃下孵育2小时。然后将小瓶剧烈涡旋1分钟以捕获挥发性产品。在2000年离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba和4℃30分钟，将上己烷层转移到新的2ml玻璃小瓶中，用于GC-MS分析。作为阴性对照，分别测定热灭活的重组蛋白和空载体。gydF4y2Ba

GC-MS分析gydF4y2Ba

色谱柱为HP-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，色谱柱为GCMS-QP2010 SE(岛津株式会社，日本京都)。注入器温度为230℃，采用无分流模式，无分流时间为1 min，以氦气为载气，流速为1.0 ml/min。GC温度为60°C，持续3分钟，斜率为4°C/min至230°C，并维持在230°C 20分钟。扫描范围:40-220gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba用于产品的体外酶分析和20-500gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba对于挥发物的化合物。通过与NIST2005（国家标准和技术研究所，Gaithersburg，MD，USA），NIST2005S，NIST2014，NIST2014和FFNSC1.3（自然味道和香水的味道和合成化合物版本1.3）GC-MS的库数据以及其保留指数的比较（RIS）。RI是基于一个gydF4y2BangydF4y2Ba烷烃(CgydF4y2Ba_8gydF4y2Ba-CgydF4y2Ba_40gydF4y2Ba)混合标准(Sigma-Aldrich)在相同的操作条件下。α-松油醇、芳樟醇、香叶醇、(gydF4y2BaEgydF4y2Ba）-β-法呢，（gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba）-NEROLIDOL和（gydF4y2BaE, EgydF4y2Ba）通过NMR进一步验证-Carnesol（图S11-28）。自没有gydF4y2Ba（e）gydF4y2Ba-α-贝加替烯和塞齐尼标准可商购获得[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]他们的验证被提交给Srivastava等人报告的验证。（2015）[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

稳态动力学gydF4y2Ba

的估计gydF4y2BaVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}和gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba通过使用Vardakou等人的方法，通过使用孔雀石绿磷酸盐测定试剂盒（Sigma-Aldrich，No.Mak307）来确定Satps1，SATPS2和SATPS3。（2014）[gydF4y2Ba81.gydF4y2Ba］．一微克含有不同浓度(0.5 μM至50 μM)底物FPP或GPP和Mg的蛋白质gydF4y2Ba^2+gydF4y2Ba在500μl25mMHEPES缓冲液中在30℃下反应10分钟。通过加入10μl5MHCl终止反应。如测定试剂盒手册中所述测定释放的游离磷酸盐。通过使用GraphPad Prism 7获得Michaelis-Menten方程的数据适合于Michaelis-Menten方程的非线性回归gydF4y2BaVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}和gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

抗氧化酶测定gydF4y2Ba

采用活性检测试剂盒(SOD、CAT、POD、APX产品编码BC0175、BC0200、BC0095、BC0220)分别检测未处理和处理后叶片、茎、根抗氧化酶活性，包括SOD (EC1.15.1.1)、CAT (EC1.11.1.6)、POD (EC1.11.1.7)和APX (EC1.11.1.11);中国,北京,Solarbio)。取100 mg植物组织，用研钵和杵在相应的提取缓冲液中粉碎，8000或13000离心收集上清液gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下20分钟。SOD活性在560nm处的光化学还原硝基蓝四唑的抑制的基础上确定的[gydF4y2Ba82.gydF4y2Ba］．CAT活性以1 nM的H表达gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在240nm处降解/分钟。一个单位的豆荚活性定义为470nm的一个单元/分钟的增加。APX活性以290nm表示为1μm抗坏血酸氧化/分钟。gydF4y2Ba

APX型:gydF4y2Ba

抗坏血酸过氧化物酶gydF4y2Ba

BS:gydF4y2Ba

Bisabolene合酶gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

CYP:gydF4y2Ba

细胞色素p450.gydF4y2Ba

FPP:gydF4y2Ba

法呢基二磷酸酯gydF4y2Ba

FPPS：gydF4y2Ba

通过二磷酸合酶gydF4y2Ba

GGPP:gydF4y2Ba

Geranylgeranyl二磷酸gydF4y2Ba

GPP：gydF4y2Ba

小烷基二磷酸gydF4y2Ba

HMCR：gydF4y2Ba

Hydroxymethylglutaryl辅酶a还原酶gydF4y2Ba

HW:gydF4y2Ba

心材gydF4y2Ba

IW：gydF4y2Ba

不成熟的木gydF4y2Ba

JA：gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

惩罚:gydF4y2Ba

茉莉酸甲酯gydF4y2Ba

荚：gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

ri：gydF4y2Ba

保留指数gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SA：gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

草皮：gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

SQS1:gydF4y2Ba

sesquisabinene合酶1gydF4y2Ba

SQS2:gydF4y2Ba

sesquisabinene合酶2gydF4y2Ba

SRC：gydF4y2Ba

顺序读取存档gydF4y2Ba

SS / BS：gydF4y2Ba

Santalene / Bergamotene合成酶1gydF4y2Ba

SSY:gydF4y2Ba

檀香萜合酶gydF4y2Ba

西南:gydF4y2Ba

Sapwood.gydF4y2Ba

Tp:gydF4y2Ba

过境肽gydF4y2Ba

TPS：gydF4y2Ba

萜烯合酶gydF4y2Ba

yfp：gydF4y2Ba

黄色荧光蛋白gydF4y2Ba

yl：gydF4y2Ba

年轻的叶gydF4y2Ba

作者感谢邓如芳博士和徐欣兰女士在使用共聚焦激光扫描显微镜方面的帮助。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究得到了中国天然科学基金（31870666和31470685），广州科技计划（201804014），广东特别支持计划（2017TQ04N303）和广东科技项目（2015B020231008）的财务支持。资助者在研究和收集，分析和解释的设计中没有作用，以及编写手稿。gydF4y2Ba

可用性数据和材料gydF4y2Ba

SaTPS1 3gydF4y2Ba基因序列在Genbank中沉积在Genbank中，注释数Mg280891，Mg280895和Mg280896。本研究中分析的所有数据都可以在此已发布的文章和其附加文件中找到。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 张新华和牛美云对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国科学院华南植物园，华南农业植物分子分析与遗传改良重点实验室，广州gydF4y2Ba

   记者张，梅云牛，月牙张云飞元，永夏佳，襄阳小，袁立，林芳，宋君曾与马国华gydF4y2Ba

2. 中国科学院大学，中国北京gydF4y2Ba

   梅云牛和悦亚张gydF4y2Ba

3. P. O. Box 7，Cho邮局，Ikenobe 3011-2，Kagawa-Ken，Miki，761-0799，日本gydF4y2Ba

   Jaime A. Teixeira da SilvagydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

实验由XZ、MN、JATS和GM设计。XZ和MN完成了大部分实验。YZ, YY, YJ, YX, YL, JATS和LF在资料收集和数据分析方面做出了很大的贡献。XZ和JATS撰写了手稿。SZ、JATS和GM对手稿进行了修改和编辑。所有作者阅读并批准了这篇论文。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba新华社张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

所有成熟的样品gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba收集了在南中国植物园（SCBG）的檀香种植园生长的树木，可收集非商业用途。gydF4y2Ba美国专辑gydF4y2Ba幼苗在SCBG温室栽培。不需要特别的许可证。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba