一种化学屏幕识别出两种新的小化合物gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba花粉管生长gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

在有性生殖过程中，花粉粒落在柱头上，重新浇水并产生花粉管，花粉管通过雌性传输道组织生长，允许两个精子细胞运送到胚珠并产生健康的种子。花粉管是一种通过尖端极化生长的单细胞，是研究花粉管生长动态、细胞壁沉积和胞内机制的良好模型。为了了解这一复杂的机制，我们使用了低通量化学筛选方法，以分离出新的尖端生长干扰物。还研究了一种单乳糖基二酰基甘油合酶的化学抑制剂galvestine-1的作用。目前的工作进一步描述了它们对花粉管尖端生长和细胞内动态的影响。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

根据干扰花粉管生长的能力，在258种化合物中分离出两种小化合物。结果表明，它们对烟草、番茄和植物离体花粉管的生长有干扰作用gydF4y2Ba拟南芥。gydF4y2Ba结果表明，这3种化合物均以剂量依赖的方式诱导花粉管膨大和花粉管长度缩短等异常表型。两种化合物处理后，花粉萌发率显著降低。它们还影响花粉管细胞壁物质的沉积。这些化合物降低了阴离子超氧化物的积累、肌动蛋白丝的紊乱和RIC4动力学，表明它们可能影响花花管尖端的囊泡运输。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些分子可能直接或间接地改变ROP1的活性，ROP1是花粉管生长和囊泡运输的关键调节因子，因此是进一步研究极化细胞生长过程中细胞动力学的良好工具。gydF4y2Ba

在有性生殖过程中，花粉粒落在柱头上，重新水化并产生花粉管，花粉管通过雌性传输道组织生长，使两个精子细胞能够适当地输送到胚珠[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在这个过程中，花粉管感知不同的信号，促进其生长，粘附和引导[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

花粉管是尖端生长最快的细胞之一。它们的生长速度可以达到58到400纳米秒gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，视乎物种而定[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．这意味着在顶端有一个非常有效的系统来传递和修饰膜和细胞壁材料，这与花粉管的振荡生长高度协调[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．振荡生长之后是细胞内钙的尖端高梯度。此外，钙是重要的第二信使，在花粉管伸长调控和引导中起关键作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．活性氧(ROS)也参与花粉管的起始、极化生长和伸长。尽管ROS具有毒性，但它作为第二信使存在于花粉管尖端[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．ROS的产生部分与RBOH(呼吸爆发氧化酶同源物)有关，RBOH是定位于质膜的NADP(H)氧化酶家族[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在花粉管生长过程中，主要由肌动蛋白微丝和微管组成的细胞骨架维持着花粉管内的细胞质运动，即所谓的“反向喷泉流”。微管参与雄性胚芽单位(MGU)的运动，而肌动蛋白微丝参与细胞器和囊泡运输以及花粉管生长[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．活细胞肌动蛋白标记物如Lifeact-EGFP的使用证实了花粉管生长过程中肌动蛋白索的参与和空间分布[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．在花粉管的柄部，肌动蛋白丝呈轴向排列，允许细胞器和囊泡运输到顶端。在顶端，肌动蛋白丝形成一个规则的结构，通常称为肌动蛋白条纹[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．肌动蛋白条纹可能通过将囊泡引导到花粉管尖端的特定融合位点，从而促进果胶在顶端细胞壁的分泌，并有助于花粉管的极化生长[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ROP (rhoa -related in Plant)是植物中rhoa - gtpases的一个独特亚家族，在这一过程的中心，已知它可以调节不同细胞类型的顶端生长和极性细胞扩张，特别是花粉特异性的ROP1，是花粉顶端生长的重要调节因子[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．ROP蛋白在gtp结合状态下与质膜结合时是活性的，在gtp结合状态下是活性的。鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)催化GDP与GTP交换释放，GTPase激活蛋白(gap)促进GTP水解，诱导ROP失活[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．ROP1定位于花花管尖端的质膜，并与两个下游靶点(含CRIB基基的rop相互作用蛋白(RIC3和RIC4))发生振荡相互作用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．这两种蛋白质具有两种不同的功能，并控制着ROP1下游的两种不同途径:分别是尖端聚焦钙梯度的形成和肌动蛋白条纹的组装[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

含有细胞壁物质的囊泡由反向喷泉流输送[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba与体细胞相比，花粉管具有特定的细胞壁组织。在胫部，它由富含β-葡聚糖(主要是胼胝质和少量纤维素)的内细胞壁层和由纤维素、半纤维素(主要是木葡聚糖)和果胶组成的外层，包括弱甲基化的均半乳糖醛酸(HG)和鼠李糖半乳糖醛酸-1 [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．胼胝质不仅存在于内细胞壁层，也存在于花栓中，这些花栓有规律地合成，使营养细胞在花花管伸长期间保持一定的体积[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．不同种间胼胝质塞沉积的模式和模式各不相同[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．在顶端，只有一个细胞壁层存在，富含甲基酯化HG鼠李糖半乳聚糖-1，阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)和木葡聚糖，同时含有少量纤维素[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

尽管花粉管在植物有性生殖过程中起着核心作用，导致大量健康种子的产生，但这种尖状生长细胞也代表了研究极化生长和细胞壁合成和重塑的非常好的模型[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多年来，人们使用不同的方法来了解花粉管生长和细胞壁重塑的复杂过程，包括功能基因组学、酶和药物治疗[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．最近，小化合物的化学筛选在植物细胞生物学中发现了重要的应用，主要与激素信号有关(如生长素、油菜素类固醇或独角金内酯)[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，以及植物与病原体的相互作用[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．然而，对花粉的研究很少。一种基于图像的自动筛选方法用于检测体外抑制花粉萌发或影响极性生长的化合物[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．花粉管也被用来了解植物的生长和发育[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]或子宫内膜转运等细胞过程[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在本研究中，我们从CERMN (Médicament de Normandie, Normandie university, UniCaen, France)的化学文库中筛选了258种不同的化合物，这是la Chimiothèque Nationale (gydF4y2Bahttp://chimiotheque-nationale.cn.cnrs.fr/gydF4y2Ba)gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba花粉萌发和花粉管生长。分离得到两种化合物，分别命名为disruptola和disruptolb。与galvestine-1一起，已知通过抑制单乳糖基二酰甘油(MGDG)合成酶来改变花粉管生长和抑制半乳糖的生物合成[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，这些分子能够以剂量依赖的方式通过调节肌动蛋白动力学和ROS积累来干扰花粉萌发和破坏花粉管的极化生长。果胶和阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)等细胞壁聚合物的分布也受到影响，这表明这些化合物可能直接或间接地干扰花粉管尖端的囊泡运输。它们的剂量依赖性效应指出了这些化合物作为研究极化生长的新工具的潜在好处。gydF4y2Ba

化学筛选从CERMN化学库中鉴定出两种化合物gydF4y2Ba

在20 μM波长下测试的258种化合物中，筛选出了两种能够阻断微晶尖极化生长的化合物gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba花粉管。这些化合物被命名为disruptola和disruptolb。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).即使disruptola是一种三环的呋喃吡啶二氮卓酮，而disruptolb是一种线性的尿硫代羧酸，但这两种衍生物具有共同的结构特征(苯甲醚挂环、五元杂环、羧酰胺或脲基、烷基或环烷基链……)，并且disruptola可以被认为是一种刚性的disruptolb类似物。本研究中还使用了另一种化合物(galvestine-1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa). Galvestine-1被证明可缩短体外花粉管长度[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]并被进一步表征。galvestine-1阴性对照为G0。G0分子具有galvestine-1结构修饰，导致生物活性的丧失(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

化合物对花粉萌发和花粉管生长的影响gydF4y2Ba

在96孔板中，研究了所选化合物对花粉萌发和花粉管生长的影响，拟南芥、烟草和番茄花粉粒与不同浓度的化合物孵育6小时。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。0.3% DMSO处理的花粉管(对照组)平均长度为845.6 μm±33.6。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).不同浓度的G0(加尔维斯汀阴性对照)也得到了类似的结果。DMSO和G0处理对花粉萌发、花粉管形状和长度均无明显影响(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG0和0.3% DMSO的花粉管正常率分别为22.3%±1.4 ~ 29.5%±1.3，只有2%的花粉管形态异常(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).干扰因子- a、干扰因子- b和galvestine-1对花粉管长度有剂量依赖性影响(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba6 h后，干扰素a处理的花粉管变短(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)，头部肿胀超过5 μM(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab). 6 h后，管长仅为400 μm，是DMSO对照组的一半(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).在disruptor - b存在的情况下，花粉管也缩短至5 μM以上(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).在20 μM时，花粉管尖端变形(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).在10 μM处，Galvestine-1也显著缩短了花粉管长度。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)，但没有引起任何强烈的变形(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).在处理后观察到类似的效果gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba花粉管(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。为了进一步研究化合物的影响，根据发芽率和表型频率之间的比例，只选择一种浓度用于每种化合物。因此，选择浓度是为了避免严重的影响(不发芽，不生长或死亡的花粉管)，而是具有具有表型的存活和生长的花粉管。所选浓度(图中红色方块突出显示)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab) disruptola和galvestine-1为10 μM, disruptolb为20 μM。gydF4y2Ba

早期爆裂花粉管(即花粉管在萌发后刚刚破裂)没有发生显著变化(对照组22-24%，galvestine-1和disruptola组17-19%，除disruptolb外(12%))(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).与对照G0相比，10 μM galvestine-1处理的花粉管缩短(12.8%)，后爆花粉管(花粉管长度为花粉粒直径~ 20 μM)的比例增加(3.9%)。干扰素a (10 μM)和干扰素b (20 μM)对花粉管萌发有影响。与对照组(44.3%±3.2)相比，干扰素a组和干扰素b组的未萌发花粉粒率分别为69.3%±3.6和68.2%±6.9。同样，干扰素a和干扰素b的正常花粉管阳性率分别为2.8%±0.6和4.8%±1.2，显著低于对照组(29.5%±1.3)(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

所有化合物对花粉管直径均有显著影响。在距离尖端5 μm和30 μm处测量管的直径(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．对照组花粉管直径在5 ~ 7 μm之间。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．galvestine-1孵育6 h后，花粉管直径在尖端5 μm和30 μm处显著增大，分别达到9.2 μm±0.4和12.6 μm±0.5。在花粉管顶端30 μm处(9.9 μm±0.5)，干扰素b处理也能显著增加花粉管直径。在花粉管尖端后方5 μm和30 μm处，干扰因子a对花粉管直径达到16 μm左右的影响最为重要(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，因为鼻尖肿胀(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

化合物对超氧化物产生的影响gydF4y2Ba

为了确定化合物对超氧化物产生的影响，我们使用NBT染色。NBT可以检测超氧阴离子(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba})与试剂孵育20分钟后。用Image J软件定量NBT染色作为花粉管尖端的平均像素强度(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．在DMSO和G0两种对照条件下，2、4和6 h后，超氧化物的积累有规律地增加。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，像素平均强度随时间的推移略有增加:DMSO在2、4和6 h后分别为184、224和230,G0在2、4和6 h后分别为150、197和230(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．Galvestine-1诱导了同样的增加，与对照组相比没有显著差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．与DMSO相比，使用disruptola和disruptolb的处理在2和4小时后没有显着差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．然而，6小时后，处理样品的阴离子超氧化物产量显著低于DMSO(229.89±4.29)(图7)(disruptola为158.7±0.12,disruptolb为177.5±0.04)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

化合物对细胞壁沉积的影响gydF4y2Ba

为了研究化合物对胼胝质塞数量和细胞壁上胼胝质沉积的影响，我们使用了脱色苯胺蓝(DAB)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).值得注意的是，在对照条件(DMSO和G0)下生长2 h的花粉管被添加到数据集中，以便能够比较短花粉管中胼胝质塞的数量(即处理花粉管生长6 h)。用DMSO和G0培养2 h的花粉管长度小于500 μm，其中大多数(~ 90%)产生一个胼胝质塞(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab). 6 h后，对照花粉管在细胞壁和花塞内胼胝质沉积正常(大部分为2个，其余花粉管有1个或3个胼胝质，只有< 5%的花粉管有4个胼胝质)(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).第一个胼胝质栓靠近花粉粒(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)，其余花粉管有规律地沉积，随着花粉管长度的增加，其数量逐渐增加(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

用disruptola处理花粉管时，其花粉管长度在48 ~ 579 μm之间，有98.6%的花粉管中含有0 ~ 1个胼胝质塞。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).用disruptolb处理导致花粉管长度减少(最大200 μm)，但花粉管仍含有1个胼胝质塞(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).值得注意的是，在某些情况下，加尔维斯汀-1、干扰素- a和干扰素- b处理也会分别在0.7、7.5和2.7%的情况下诱导管尖细胞壁上的胼胝质沉积。在对照组中没有这种沉积模式。galvestine-1处理的花粉管比G0处理的花粉管短，但在200 μm和400 μm花粉管中仍含有大量的1 ~ 3胼胝质塞(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).在相同平均长度(~ 400 μm)下，galvestine-1处理花粉管有2个或3个花塞(多数)。gydF4y2Ba

用LM19抗体免疫标记花粉管(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，该表位可识别低甲基化HGs，结果表明，该表位在对照组(DMSO和G0)花粉管柄中检测最多。处理后的花粉管显示出不同的表位分布。与对照组(14%)相比，用galvestine-1处理的花粉管有85%在顶端定位。在使用disruptola处理的花粉管中，LM19识别的表位定位在整个花粉管细胞壁上的比例为100%，而在使用disruptolb处理的花粉管中，这一比例为92%。在花粉管扭曲区也观察到更明亮的标记，这原本是扩张的尖端，停止生长导致新尖端的出现。在所有处理中，还观察到更明亮的环状沉积物，在用disruptola处理的花粉管肿胀的尖端，这表明在缓慢生长阶段细胞壁物质的积累。gydF4y2Ba

用LM2抗体进行免疫标记，可以识别与agp相关的表位，显示该表位在对照花粉管(DMSO和G0)的顶端被明亮地标记。与对照组(20%)相比，用galvestine-1处理的93.7%的花粉管和用disruptola处理的100%的花粉管顶端没有显示更亮的标记。所有处理均能诱导花粉管细胞壁形成较亮的环状沉积物，如LM19所观察到的。gydF4y2Ba

化合物对肌动蛋白动力学和顶端极化标记RIC4的影响gydF4y2Ba

为了研究细胞壁聚合物的定位错误和生长缺陷是否由于细胞内运输的中断，使用花粉管表达来跟踪肌动蛋白丝动态gydF4y2BapLAT52: lifeact-mEGFPgydF4y2Ba．在对照组(DMSO和G0)中，在孵育2、4和6小时后，花粉管柄区和顶端的肌动蛋白边缘观察到长索，肌动蛋白动力学正常(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:视频S1)。这些结构保持高度动态，花粉管随着时间的推移正常扩张(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。用disruptola处理4 h和6 h后，花粉管尖端区域可以清楚地看到通常位于花粉管后部的液泡(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2，附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:视频S2)，肌动蛋白边缘开始随着肿胀尖端的出现而消失，6小时后完全消失(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．此时，花粉管不再扩张，但肌动蛋白索仍在移动(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。在与disruptolb孵育2、4和6 h后，肌动蛋白边缘和肌动蛋白丝的空间组织也出现异常(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．然而，4和6 h后，花粉管仍在扩张，但扩张速度较对照慢，且呈缠绕状(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:视频S3)，尖端未检测到液泡(图3)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。用galvestine-1孵育2小时和4小时后，花粉管也扩张，但6小时后，生长减慢(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。4 h后，随着花粉管直径的增大，肌动蛋白条纹形状发生变化。它位于根尖下区和柄区开始处。处理6 h后，肌动蛋白边缘在尖端更明显，而在柄区和亚尖区消失(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．仅在用galvestine-1处理的花粉管中，在靠近顶端的柄部也观察到小点的肌动蛋白灶。干扰素- a和加尔维斯汀-1处理在培养4和6小时后在小腿区诱导肌动蛋白环的出现。在干扰素- b处理的花粉粒中也观察到肌动蛋白环。对照组和G0的花粉管中未观察到肌动蛋白环(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

通过追踪ROP1效应蛋白RIC4的位置来评估化合物对根尖生长标志物ROP1的影响gydF4y2BapCL: CRIB4-GFPgydF4y2Ba．在对照组(DMSO和G0)中，RIC4的定位在生长2、4和6 h后仍然正常。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)在顶顶的质膜处出现/消失搏动(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S3)。在所有条件下，所有花粉管的细胞质中均检测到GFP。gydF4y2Ba

用disruptola处理2小时后，观察到RIC4动力学的扰动。RIC4不仅局限于根尖穹窿，而且也存在于根尖下区，有时这种位置持续存在(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S3)。培养4小时后，RIC4在根尖质膜上的定位消失，而GFP仅位于细胞质中(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．RIC4在花粉管尖端的定位是多种多样的，依赖于花粉管的形状。RIC4定位于花粉管顶顶区，然后从顶顶顶的一侧向另一侧移动。这与生长缓慢和尖端生长方向的多次变化有关(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2Ba

在用galvestine-1处理2和4小时后，RIC4与DMSO和G0条件下一样位于根尖区域(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．galvestine-1治疗6小时后，病灶扩展至根尖下区(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这些化合物破坏了肌动蛋白动力学和ROP信号:花粉管尖生长的两个中心机制gydF4y2Ba

肌动蛋白骨架在花粉管和极性生长中起关键作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，加尔维斯汀-1、干扰素- a和干扰素- b能够干扰肌动蛋白的细胞骨架动力学。用disruptola处理诱导肌动蛋白边缘逐渐消失，6小时后完全消失，出现表型和花粉管生长减少。膜运输抑制剂Brefeldin A (BFA)或电子传递链抑制剂氰化钾(KCN)也观察到类似的效果[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．用disruptor - b和galvestine-1处理不会引起肌动蛋白边缘的消失，但会导致结构的破坏。用disruptolb处理后，肌动蛋白边缘的不稳定性可以解释花粉管的缠绕形状。事实上，研究表明，肌动蛋白丝的翻转(聚合/解聚)是花粉管定向生长变化的早期事件[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

所有处理均诱导花粉管柄部出现环状肌动蛋白结构。在大多数花粉管中观察到这些代表肌动蛋白丝圆形构象的结构，并且已经在一些使用染色技术或表达荧光蛋白标记的肌动蛋白结合域的研究中得到描述[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．即使高水平的Lifeact表达会由于与原生肌动蛋白结合蛋白的竞争而诱导人工合成[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]，则处理花粉管中的环状肌动蛋白结构可能反映了细胞内的某种生理状态，如热应激、钙利用率和细胞外pH值的变化[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与对照相比，所有处理都干扰了RIC4的位置和振荡。在用disruptola处理的花粉管中，RIC4完全从顶端区域消失，同时肌动蛋白边缘消失。这些结果与RIC4通路促进花粉管尖端肌动蛋白边缘的组装有关[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Galvestine-1是半乳糖生物合成的抑制剂，更准确地说是MGDG。这些半乳糖脂对光合膜的生物发生至关重要，在磷酸盐缺乏的整个细胞中，它们是多不饱和脂肪酸的来源[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．半乳糖脂合成相关基因的表达在花粉发育和萌发过程中被强烈激活，这表明它们在花粉成熟和花粉管生长过程中的重要性[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．半乳糖脂遍布花粉管膜[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，抑制半乳糖的生物合成可能会影响质膜ROP信号/定位。有趣的是，galvestine-1治疗观察到小而罕见的点状肌动蛋白灶。这些结构是不寻常的，在文献中描述得很少。然而，肌动蛋白焦点似乎是在自交不亲和(SI)反应中诱导的gydF4y2Ba罂粟花gydF4y2Ba［gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]并且能够改变两种肌动蛋白结合蛋白，环化酶相关蛋白和肌动蛋白解聚因子的细胞内位置[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．因此，我们假设galvestine-1改变了质膜的脂质稳态，改变了ROP1和actin的定位和动态[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．因此，处理对肌动蛋白丝和动力学的破坏可能是由于抑制或激活了在肌动蛋白聚合和解聚中起关键作用的肌动蛋白结合蛋白(ABPs)。事实上，肌动蛋白结构的构建需要几个ABPs [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]如双胍，一种肌动蛋白成核蛋白，与形成顶端下肌动蛋白有关[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]或绒毛，一种稳定肌动蛋白丝的主要捆扎因子[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这些化合物扰乱细胞壁分布，导致花粉管形态的改变gydF4y2Ba

胼胝质塞的数量一般与花粉管的长度有关[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．用LatB(一种肌动蛋白聚合抑制剂)处理可以影响花粉管中胼胝质塞的沉积，并诱导尖端的胼胝质沉积。基于胼胝质的位置，推测LatB可能触发刺激反应，通过激活位于尖端的胼胝质的合成酶来增强胼胝质的合成[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．在我们的实验中，当用galvestine-1、disruptola或disruptolb处理花粉管时，花粉管长度与胼胝质塞数量不相关。实际上，花粉管的长度减少了，而胼胝质栓的数量保持不变，说明胼胝质栓的合成与花粉管的长度无关，而是与时间有关。但这需要进一步的调查。即使肌动蛋白丝对胼胝质合酶的分布至关重要[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]而且先前的研究表明，质膜中一种无序的纤维素合成酶复合物可能能够催化纤维素和胼胝质的合成[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]，很难将我们分子的作用与胼胝质塞的形成或沉积联系起来。花粉管尖端胼胝质的合成可能是处理后花粉管恢复的一种保护机制，提示处理后花粉管出现新的尖端。gydF4y2Ba

表型的出现，特别是使用disruptola和disruptolb处理，以及对延伸的抑制/减少表明细胞壁沉积受到处理的影响。在未经处理的花粉管中，弱甲基化的HG表位主要出现在柄部，而顶端则没有，相反，阿拉伯半乳聚糖蛋白相关的表位在顶端更容易被检测到。这些结果与以往的研究结果一致[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．一般认为，果胶在最顶端高度甲基化，然后通过细胞壁内果胶甲基酯酶的活性去酯化[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．这种严格的调节被认为是为了控制尖端(可扩展性)和柄(刚性)之间的细胞壁的刚度，以维持管的圆柱形[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．所有处理均显示LM19抗体结合的尖端定位异常。因此，影响花粉管细胞壁延伸能力的处理可能会影响果胶重塑[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．在disruptola和galvestine-1存在的情况下，agp尖端局部标记的缺失证实了细胞壁物质的传递被改变，因为人们认为agp参与了花粉管生长过程中新细胞壁物质的沉积[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．由于肌动蛋白骨架对囊泡运输很重要，细胞壁聚合物分布的改变可能与细胞壁聚合物和细胞壁修饰酶的囊泡运输和极化胞吐作用的改变有关[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．Yariv苯基葡萄糖苷阻断花粉管质膜表面agp，也会导致花粉管尖端胼胝质沉积，agp和果胶错位，并导致生长停滞[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．有趣的是，去除试剂后，这种效果是可逆的，并且可以从被阻塞的原始尖端重新产生新的尖端[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba正如用disruptor - b观察到的那样。gydF4y2Ba

除了在与细胞毒性相关的无数生理过程中扮演第二信使的角色外[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]， ROS也会影响壁的可塑性[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]并与花粉管生长有关[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．在这项研究中，使用NBT来评估ROS的产生，NBT与O特异性反应gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}．O的产生gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}仅干扰因子- a和干扰因子- b显著降低(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}在花粉管生长和重新定位中起作用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．ROS还可能在影响植物细胞中肌动蛋白聚合动力学方面发挥作用[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．我们可以假设OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}干扰素a和干扰素b的产生可以诱导肌动蛋白动力学中断。本研究中使用的化合物对肌动蛋白边缘的影响更为明显。与KCN一样，随着透明带的丧失和生长抑制，边缘是最先降解的成分之一，但细胞质流仍在继续[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．已知ROS还在调节细胞壁可扩展性方面发挥作用，以允许细胞扩张，并防止顶端破裂[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba］．在干扰素- a和干扰素- b处理后，OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba}水平诱导尖端肿胀和极性丧失，可能是通过改变不同形式的ROS之间的平衡，促进细胞壁变硬和/或松动[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

然而，极化生长的修饰、细胞壁聚合物的重塑与肌动蛋白动态之间的联系尚不清楚，有待进一步研究。gydF4y2Ba

干扰素a和干扰素b的可能目标gydF4y2Ba

干扰素a和干扰素b的目标目前还不清楚。干扰素a和干扰素b是CERMN化学库中的两种合成化合物。从构效关系(SAR)的角度来看，disruptor -a和disruptor - b理论上表现出适当的结构特征，以与激酶进行抑制性相互作用，如已知干扰核因子κ b激酶抑制剂(IKK)的分子、脲基呋喃和噻吩羧酰胺所示[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．更具体地说，disruptor - b的药效特征与PIP5K抑制剂UNC3230的结构密切相关。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba94gydF4y2Ba这种脂质激酶家族可能是我们化合物的潜在靶点。需要进一步的研究来验证这一假设，并确定干扰素a和干扰素b对尖端生长机制的直接和间接影响。gydF4y2Ba

磷酸肌醇与肌动蛋白动力学对于维持液泡形态至关重要[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba］．最近,拟南芥gydF4y2Bavac14gydF4y2Ba功能缺失突变体，缺乏AtVAC14，酵母和后生动物VAC14的同源物，涉及磷脂酰肌醇3-5双磷酸(PI(3-5)PgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)的特征[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．在拟南芥中，VAC14在花粉发育过程中呈组成性强表达，其缺失导致花粉败育和花粉管生长缺陷[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．此外，用PIPkinase细胞渗透性抑制剂YM-201636处理花粉管，可引起与用disruptola和B处理相似的缺陷，即花粉萌发率降低，花粉管变短直径变宽[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．同样，在烟草花粉管中过度表达PIP5K10或PIP5K11这两种花粉特异性磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI4P) 5激酶，能够在体外产生磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸，导致顶端严重肿胀、空泡化和肌动蛋白精细结构改变[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．因此，我们可能假设，disruptor -a干扰花粉管中的磷酸肌醇代谢，扰乱肌动蛋白细胞骨架，这可能受到PI4P 5激酶的影响，并可能有助于控制质膜相关的Nt-Rac5库。事实上，Nt-Rac5是与细胞生长过程中肌动蛋白重组有关的小GTPase家族的一员[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．拟南芥基因组中发现了同源体ARAC4/ROP2、ARAC1/ROP3、ARAC6/ROP5、ARAC11/ROP1和ARAC3/ROP6, ARAC11/ROP1与花粉管生长有关[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．用disruptor - b和galvestine-1处理RIC4定位的破坏也伴随着肌动蛋白边缘的紊乱。RIC4在花粉管顶端向亚尖端区域振荡，其位置预测了花粉管的定向生长，说明RIC4在顶端区域的异常定位解释了花粉管的多向生长[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．尽管RIC4是否通过调控肌动蛋白聚合因子直接或间接与肌动蛋白丝相互作用尚不清楚[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]，我们的研究结果表明RIC4动力学的破坏与肌动蛋白条纹的形成密切相关，并证实了顶端丝状肌动蛋白动力学和浓度受到ROP-GTPases的影响[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物生长条件gydF4y2Ba

的种子gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba将Col-0(4°C贮藏)铺于无菌土壤表面，在长日照光周期(分别在20°C/16°C下光照16 h /暗8 h)和60%相对湿度条件下的生长室中培养。含有gydF4y2BapLAT52: lifeact-mEGFPgydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba99gydF4y2Ba]或gydF4y2BapCL-CRIB4-GFPgydF4y2Ba［gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba]，分别由黄善进院士(中国科学院北京植物研究所)和杨振彪院士(美国加州大学河滨分校植物细胞生物学研究中心)赠送。gydF4y2Ba

烟草gydF4y2Ba简历。将苍耳草种子播撒在消毒后的土壤表面。在25°C和22°C的光照和暗期，植物分别以16 h光照/8 h暗循环的光周期生长。相对湿度保持在60%，每2天浇水一次。烟草种子是UMR 6037 (CNRS, Université de Rouen, Rouen, France)赠送的。gydF4y2Ba

番茄龙葵gydF4y2Ba“西弗吉尼亚106”(wva106)种子被播种在无菌土壤表面下1厘米处，并在生长室中培养。在25°C和22°C的光照和暗期，植物分别以16 h光照/8 h暗循环的光周期生长。番茄种子是Pierre Baldet博士(INRA, Université de Bordeaux, UMR 1332, Bordeaux, France)赠送的礼物。gydF4y2Ba

花粉管培养gydF4y2Ba

花粉粒gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba在含有5 mM氯化钙的液体萌发培养基(GM)中萌发gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.01% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba) HgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 5 mM KCl, 1 mM MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 10% (w/v)蔗糖，pH 7.5如前所述[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba］．由[gydF4y2Ba102gydF4y2Ba]，从第一次和第二次花序顶部的第二排收集40朵完全开放的花(在1.5 mL Eppendorf®塑料管中)，将其淹没在1 mL GM中。用旋涡摇动管柱，使花粉颗粒从花药中释放出来。用镊子将花取出，花粉悬浮液在4000度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba7分钟。向球粒中添加新GM，将花粉转移至96孔板(ThermoFisher®)或μ-玻片(Ibidi®)中，分别在倒置显微镜或共聚焦倒置显微镜下观察，在22℃黑暗条件下生长。gydF4y2Ba

从新鲜开裂的花药中采集花粉粒，将3朵花(烟草)或5朵花(番茄)的雄蕊浸泡在5 mL BK培养基中[1.62 mM HgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 1.25 mM Ca (NOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 2.97毫米知道gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba1.65 mM MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO] [gydF4y2Ba103gydF4y2Ba含有15%的蔗糖。用旋涡悬浮花粉粒，用镊子去除雄蕊。番茄花粉管在玻璃小瓶中生长，22°C，黑暗，搅拌6小时。烟草花粉管在24孔板(ThermoFisher®)中生长，在22°C的黑暗中不搅拌。gydF4y2Ba

当花粉管长度大于花粉粒直径时，认为花粉粒已萌发。花粉管破裂时，较小的花粉管被认为是“早期破裂”，较长的花粉管被认为是“最近破裂”。当没有观察到明显的筒尖时，花粉粒被认为是未萌发的。gydF4y2Ba

化学屏幕gydF4y2Ba

筛选了一组258种化合物，它们代表了CERMN化学文库的化学多样性(质心方法)(法国诺曼底大学诺曼底研究中心Médicament de Normandie)。化合物在10 mM的100% DMSO中溶解，并在−80°C下储存。在主筛选中，化合物以20 μM (GM稀释)的浓度进行筛选，并根据其诱导花粉管形态的能力进行筛选。对于主筛，阴性对照为0.1% DMSO。在96孔板中进行分子筛选和剂量反应效应。gydF4y2Ba

然后我们选择了两种化合物，分别命名为disruptola和disruptolb。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).研究中还使用了另一种化合物(galvestine-1)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).已知Galvestine-1可缩短体外花粉管长度[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．galvestine-1阴性对照为G0。G0具有galvestine-1结构修饰，导致生物活性的丧失(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在0.5、1、5、10、20和30 μM浓度范围内，对花粉颗粒进行了剂量效应试验。将DMSO中浓度为10 mM的化合物用蒸馏水稀释至500 μM。将不同体积的DMSO 5%， 500 μM和GM混合，得到所有处理的DMSO最终浓度为0.3%。gydF4y2Ba

细胞化学的染色gydF4y2Ba

胼胝质染色gydF4y2Ba

苯胺蓝在100mmk中脱色gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba用1% pH值12定位胼胝质[gydF4y2Ba102gydF4y2Ba］．脱色的苯胺蓝在培养6 h后直接加入到培养基中，最终浓度为0.1%。室温下在黑暗中孵育2 h后进行观察。gydF4y2Ba

过氧化物检测gydF4y2Ba

超氧阴离子(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{•- - - - - -gydF4y2Ba})用硝基蓝四氮唑(NBT;阿尔法蛇丘®)。在7 mM的GM中制备NBT溶液，最终浓度为1.2 mM的花粉管孵育20 min [gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

拟南芥花粉管细胞壁表位的免疫定位gydF4y2Ba

使用两种主要的单克隆抗体(LM19和LM2, PlantProbes)。单抗LM19识别与果胶低甲基化均半乳糖醛酸(HG)结构域相关的表位[gydF4y2Ba104gydF4y2Ba]而LM2针对水稻AGPs产生，并识别含有β-连接葡萄糖醛酸的碳水化合物表位[gydF4y2Ba105gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

培养6小时后，固定培养基含有100mm的PIPES, 4mm的MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba7小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 4 mM EGTA, 10% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)蔗糖及5% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v) pH为7.5的多聚甲醛加入GM, 4℃孵育过夜。花粉管在4000℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba7分钟。颗粒悬浮在200 μL磷酸盐缓冲盐水(PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 7 mM Na)中gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 1.5毫米KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2BapH值7.2)，然后沉积在μ-Slide VI上gydF4y2Ba^0.4gydF4y2Ba聚l -赖氨酸(Ibidi®)，室温孵育一夜，将花粉管固定在赖氨酸基质上，然后用PBS冲洗3次，然后用PBS 3%脱脂牛奶在室温下孵育30分钟。用PBS冲洗花粉管3次。用PBS按1:5稀释一抗，4℃黑暗孵育过夜。PBS和二抗大鼠抗体联合异硫氰酸荧光素(FITC;Sigma)用PBS以1:50稀释，在30°C下孵育3小时。阴性对照通过省略一抗进行。在观察之前，用PBS冲洗花粉管三次，并悬浮在citifluor/PBS (v/v)的混合物中。提出的意见如下。gydF4y2Ba

显微技术和图像采集gydF4y2Ba

用Leica SP2共聚焦倒置显微镜观察花粉管的表达gydF4y2BapLAT52: lifeact-mEGFPgydF4y2Ba而且gydF4y2BapCL-CRIB4-GFPgydF4y2Ba使用μ-slide 18孔(Ibidi®)。图像每2 s 915 msec采集一次，持续5分钟。使用了不同的过滤器集，gydF4y2BapLAT52: lifeact-mEGFPgydF4y2Ba(吸收488 nm，发射505-545 nm);gydF4y2BapCL-CRIB4-GFPgydF4y2Ba(吸收488 nm，发射498-560 nm)。gydF4y2Ba

使用徕卡DMI 6000B倒置显微镜观察苯胺蓝和FITC在亮场或外显荧光下的表型，不同滤光组(吸收405 nm;发射，523 nm或吸收，460-500 nm;发射,分别)。gydF4y2Ba

程序ImageJ [gydF4y2Ba106gydF4y2Ba]，人工测定每张图片上的花粉管发芽率、异常花粉管形状、花粉管长度和直径。在NBT技术中，将图像转换为灰度图像，从尖端到30 μm后绘制标记，并使用徒手选择工具手动选择表面。利用测量工具得到像素强度的平均值。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据采用R软件处理[gydF4y2Ba107gydF4y2Ba]，表示平均值±SEM。根据数据集的参数化和非参数化批次进行Dunnett检验或Wilcoxon检验分析并进行Holm调整，两两比较。显著差异为gydF4y2Ba^＊gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2Ba^**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01，gydF4y2Ba^{＊＊＊gydF4y2Ba}PgydF4y2Ba< 0.001。gydF4y2Ba

agp:gydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白质gydF4y2Ba

CDC42:gydF4y2Ba

细胞分裂控制蛋白42gydF4y2Ba

婴儿床:gydF4y2Ba

Cdc42 / Rac-interactive绑定gydF4y2Ba

DMSO溶液:gydF4y2Ba

DimethylsulfoxydegydF4y2Ba

HG:gydF4y2Ba

HomogalacturonangydF4y2Ba

IKK:gydF4y2Ba

核因子κ b激酶抑制剂gydF4y2Ba

LM:gydF4y2Ba

利兹单克隆gydF4y2Ba

MGDG:gydF4y2Ba

MonogalactosyldiacylglycerolgydF4y2Ba

NADPH氧化酶:gydF4y2Ba

β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶gydF4y2Ba

电视台:gydF4y2Ba

氮蓝四唑gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐缓冲盐水gydF4y2Ba

PIP5K:gydF4y2Ba

磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI4P) 5激酶gydF4y2Ba

RBOH:gydF4y2Ba

呼吸爆裂氧化酶同源物gydF4y2Ba

RIC4:gydF4y2Ba

rop互作的CRIB基序含蛋白4gydF4y2Ba

ROP1:gydF4y2Ba

植物中与铑相关的GTPasesgydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

作者感谢Université de Rouen Normandie PRIMACEN的细胞成像平台(gydF4y2Bahttp://www.primacen.frgydF4y2Ba)．我们也感谢黄善进院士(中国科学院，北京，中国)和杨振彪院士(加州大学，河滨分校，美国)赠送的转基因种子。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作部分由Université de Rouen Normandie和法国研究部资助。FL和JD由Université de Rouen Normandie的博士奖学金和Région Normandie的FD资助。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究中分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Arnaud Lehner和Jean-Claude Mollet对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Normandie Université， UNIROUEN，实验室糖生物学和细胞外基质Végétale EA4358, Fédération de Recherche“NORVEGE”- FED 4277, 76000，鲁昂，法国gydF4y2Ba

   Ferdousse Laggoun, Flavien Dardelle, Jérémy Dehors, Azeddine Driouich, Arnaud Lehner & Jean-Claude MolletgydF4y2Ba

2. 纤维生理学实验室等Végétale，法国国家科学研究中心，CEA, INRA, Université格勒诺布尔阿尔卑斯，格勒诺布尔生物科学和生物技术研究所，CEA格勒诺布尔，38000，格勒诺布尔，cedex 9，法国gydF4y2Ba

   丹尼斯小鹰gydF4y2Ba

3. 诺曼底Université， UNICAEN，诺曼底研究中心Médicament, CNRS 3038 INC3M, SFR ICORE, 14032，法国卡昂gydF4y2Ba

   Christophe Rochais & Patrick DallemagnegydF4y2Ba

4. 现地址:LPS-BioSciences, Bâtiment 409, Université Paris-Sud, 91400，奥赛，法国gydF4y2Ba

   Flavien DardellegydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

FD在AD和J-CM的监督下进行了一次筛选，FL在JD的帮助下进行了大部分实验，FL在JD、DF、PD、AL和J-CM的输入下进行了数据分析并起草了手稿;CR和PD提供了化学库，并进一步研究了两种纯化的化合物，DF提供了Galvestine和G0, AL和J-CM设计并指导了研究。所有作者都参与了写作并通过了最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaArnaud雷纳gydF4y2Ba或gydF4y2Ba特里MolletgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba