C4光合作用的脱羧机制gydF4y2Ba糖果gydF4y2Ba在限水条件下增加PEPCK活性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

基于束鞘细胞（NADP-ME，NAD-ME和PEPCK途径）中，基于用于脱羧C4酸的酶被分为三种亚型植物。证据表明，根据环境因素，C4植物可以在使用脱羧机制时表现出一定程度的灵活性。在这种情况下，该目的是延长关于甘蔗脱羧，NADP-ME物种的脱羧途径之间的灵活性的知识，不同水分缺损。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

用两种品种 - RB92579进行实验 - RB92579（耐水赤字）和SP80-3280（易受水缺陷）进行中度水平（ - 1.5至-1.8MPa），严重水平（低于-2.0MPa）和恢复（再水中48小时），研究了三个C4机制和基因表达中涉及的酶活性的变化。我们的研究结果表明，除了NADP-ME之外，甘蔗还使用PEPCK途径作为脱羧机制，这在缺水条件下更明显。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这里得到的结果表明，在水分亏缺条件下，尤其是在耐受品种中，除了NADP-ME途径外，甘蔗还增加了PEPCK途径作为脱羧机制的利用。gydF4y2Ba

甘蔗，如其他种类归类为具有C4光合途径的物种，显影解剖和生理适应优化COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定碳水化合物合成[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．根据C4光合途径的植物是否含有高水平的nadp -苹果酸酶(NADP-ME, EC 1.1.1.40)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK, EC 4.1.1.49)或nadp -苹果酸酶(NADP-ME, EC 1.1.1.39)，可将其分为3个生化亚型。束鞘细胞的脱羧作用可以发生在不同的细胞室，因为NADP-ME发生在叶绿体中，NADP-ME发生在线粒体中，而PEPCK则表现出胞质活性[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．目前，甘蔗被归类为NADP-ME亚型[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba最初是通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)固定在叶肉细胞中，PEPC是C4三种亚型中常见的一种酶(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。形成的产物是草酰乙酸（OAA），其可以通过NADP依赖性苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）的苹果酸盐还原成或通过天冬氨酸氨基转移酶（ASPAT）转化为天冬氨酸。在NADP-ME亚型中，苹果酸盐被运输到束鞘细胞，其中它被转化为丙酮酸，释放COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．接下来，丙酮酸返回到叶蛋白细胞和正磷酸丙酮酸二基酶（PPDK）催化磷丙酮酸（PEP）的形成。在NAD-ME和PEPCK亚型中，天冬氨酸被传送到束鞘细胞并分别在线粒体和细胞溶胶中转换回OAA。在NAD-ME亚型中，OAA通过NADP-MDH降低到苹果醛，然后NAD-ME催化苹果酸甲酸转化为丙酮酸，释放COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba进入线粒体[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在Pepck亚型中，大多数OAA被酶Pepck和Co转换为PEPgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在束鞘细胞的细胞溶胶中释放。NAD-ME酶提供减少的当量为NADH，用于产生PEPCK反应的ATP。所得丙酮酸可以通过酶丙氨酸氨基转移酶（Alaat）转化为丙氨酸，其返回叶肉细胞（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．PEPCK是否是一个独立的生化亚型，或者是否与NAD-ME或NADP-ME物种仍未解决过。gydF4y2Ba

几件分子，生化和生理信息表明，NADP-ME亚型的C4植物，如甘蔗，玉米和高粱，可以在使用三个脱羧亚型中表现出一定的灵活性（NADP-ME，NAD-我和Pepck）并且这些亚型可能不会以刚性的方式遗传确定[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．在这种情况下，灵活性可以定义为与环境条件相同的植物中多于一个C4酸脱羧途径的通量的变化。gydF4y2Ba

实际上，检测到脱羧途径的证据非常早，其中约25％的CgydF4y2Ba^14.gydF4y2Ba- 标记的CO.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba纳入甲醛的Asparated，归类为NADP-ME Subtype [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．此外，在用玉米的实验中，制备大量标记的天冬氨酸，并分离的束鞘细胞能够使用天冬氨酸和氧化或恶化以产生COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba维持光合作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．玉米束鞘细胞中检测到PEPCK高表达[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．Pepck活动在玉米束鞘细胞中验证，gydF4y2BaEchinochloa Colona，E.Crus-GalligydF4y2Ba，gydF4y2BaDigitaria sanguinalis.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba雀稗霉gydF4y2Ba，属于NADP-ME种，但未在NADP-ME亚型种中观察到[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．具体来说，在甘蔗中，一项使用SAGE(基因表达序列分析)技术的研究表明gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba束鞘细胞的转录本比NADP-ME丰富[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]．最近，据报道，甘蔗植物中三个脱羧酶（NADP-ME，NAD-ME和PEPCK）的活性，并且通过PEPCK引起脱羧的阴影增加了[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．在不同C4亚型的酶使用中的这种灵活性对光合作用的能量要求具有直接影响，因此，适应环境条件波动的适应性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

根据环境条件和植物发育阶段的不同因素，可以差异地控制C4光合途径。在使用三种不同C4草的研究中，gydF4y2Ba帕纳普卢姆稀释物gydF4y2Ba（nadp-me subtype），gydF4y2BaCynodon Dactylon.gydF4y2Ba（NAD-ME）和gydF4y2BaZoysia japonicagydF4y2Ba(PEPCK)的研究表明，中度叶片脱水对C4脱羧酶有种特异性影响，主要是通过提高所有3种植物的PEPCK活性[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．根据这些研究，很明显NADP-ME和PEPCK酶都存在于NADP-ME物种的束鞘细胞中，利用苹果酸和/或天冬氨酸作为C4转运酸生成COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba支持光合作用[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

水赤字是限制甘蔗植物在作物发展期间进行重要生化功能的主要约束之一。对水限制的第一个反应之一是由于气孔闭合和CO的下降，减少光合速率gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化，反过来改变了诸如Rubisco，Pepc，PPDK，NADP-ME等的酶等活性[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．在水缺水下，非气孔局限性，例如对羧酸酯的降低的基材供应，可能在C4草中引起足够的代谢抑制以减少COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化约40% [gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]．此外，有证据表明，非生物干扰，如干旱，不仅影响与C4光合作用相关的酶的活动，而且还影响编码这些酶的基因的转录水平[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．这些是可以响应非生物应激而改变的所有调节机制，但仍然在甘蔗中的分子水平下仍未定义。因此，C4脱羧机制以维持光合效率的灵活性可能是在环境压力条件下生长的植物的重要因素，例如水赤字[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

因此，这项工作的目的是研究甘蔗植物中涉及三个脱羧C4亚型（NAD-ME，NADP-ME EP）中涉及的酶，以验证这种重要的NADP-ME作物物种的途径之间的可能性灵活性不同的水赤字水平。为此，我们（a）表征了两种甘蔗品种，对水缺陷条件（RB92579，耐受性和SP80-3280易受水缺陷的SP80-3280），（b）建立了键入三项的酶活性的比较分析亚型和（c）测量了C4酸脱羧机构中涉及的编码酶的基因转录物的变化。gydF4y2Ba

水分状况，叶气交换和生物量分析gydF4y2Ba

每天通过测量叶水潜在值来评估水资源缺陷（gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba）.植物达到预先建立的中度水赤字水平（gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba = − 1.5 to − 1.8 MPa) three days after the onset of the water deprivation, while the severe condition (ψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba = below − 2.0 MPa) occurred nine days after attaining the previous water deficit level. We only observed differences in the water potential values between the susceptible and tolerant plants at the end of the experimental period (12 days) when the plants reached the maximum applied water deficit level. SP80–3280 plants showed a reduction inψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba与RB92579(−2.0 MPa)相比，RB92579(−2.3 MPa)的抗脱水能力较低。复水后，两个品种均恢复生长gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba在正常灌溉条件下植株记录的数值(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

水分亏缺降低了两个甘蔗品种的叶片气体交换(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.耐植物（RB92579）显示出更高的COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化率(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在正常供水条件下。而在水分亏缺条件下，RB92579和SP80-3280的CO含量降低gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化7.56和7.92 μmol COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba米ydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别，但没有显着差异，在品种中的中等和严重的水缺水水平之间（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。易感植物（SP80-3280）在回收下显示出低光合活性（约50％的灌溉对照）。另一方面，合作社gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在水剥夺后耐受性植物中的同化也有所下降，但在实验开始时的灌溉对照植物在类似水平中重新建立光合作用水平（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

气孔导电的下降（gydF4y2BaGS.gydF4y2Ba)，直至水分亏缺处理结束(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。在中等水缺陷下的植物中观察到这种下降，其中这些值范围为0.05至0.03 mol HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bao M.gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在RB92579和SP80-3280上，gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。在水剥夺12天后（严重水平）后气孔导率达到低至0.01 mol H的值gydF4y2Ba_2gydF4y2Bao M.gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}对于易感植物（SP80-3280），但在该水赤字水平的两种品种之间没有发现显着差异。在恢复中，耐受植物RB92579显示出较高的气孔导度值（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。蒸腾水平（gydF4y2BaEgydF4y2Ba中等水分亏缺条件下，抗性植株和敏感植株的光合速率分别比灌水处理低60%和68%。随着缺水时间的增加(12天)，两个品种的蒸腾速率都比灌溉处理降低了95%。复苏后，增长gydF4y2BaEgydF4y2Ba在耐受性植株中含量较高(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

易感植物显示出明显更大的叶面积（gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba)比RB92579在正常供水条件下(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.然而，易感植物（SP80-3280）显示出优异的减少gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba当经过水赤字3天和12天（分别为约16％和38％）。在这些相同的条件下，耐受植物（RB92579）显示叶面积减小约为13和34％。我们没有观察叶子的显着差异（gydF4y2BaLDW.gydF4y2Ba）和根系干重（gydF4y2Bardw.gydF4y2Ba)在所有水分亏缺制度(灌溉、中等和严重水平)下(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.然而，正如观察到的gydF4y2Ba拉gydF4y2Ba，RB92579植物较少减少gydF4y2BaLDW.gydF4y2Ba和gydF4y2Bardw.gydF4y2Ba与在这些相同的水赤字期下，与易感植物预扣用3和12天（19和45％）（7％）gydF4y2BaLDW.gydF4y2Ba52％的52％gydF4y2Bardw.gydF4y2Ba）.易感植物（SP80-3280）的特征在于具有更高的茎干（gydF4y2BaSDWgydF4y2Ba)，这也反映在其较高的总干重(gydF4y2BaTDW.gydF4y2Ba） （桌子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.但是，当暴露于水赤字时，这些植物表现出更大的减少gydF4y2BaSDWgydF4y2Ba（分别与耐耐受植物（RB92579）相比（分别为36和44％）。在水剥夺（严重水平）的12天结束时，与相应的灌溉对照植物中的值相比，SP80-3280（42％）中的总干重累积比在耐受性植物（30％）中较低。在恢复和严重的水缺陷治疗之间没有观察到显着差异，表明48小时的再水解是不足以导致甘蔗植物的生物质的变化（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

酶活性gydF4y2Ba

测定仅在NAD-ME和PEPCK亚型中存在的脱羧酶NADP-ME，NAD-ME和PEPAN和AMINOR转移酶ASPAT和ALAAT。gydF4y2Ba

耐受植株(RB92579)在严重水分亏缺(6.33 μmol min)条件下，NADP-ME酶活性增加gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}背影)。在恢复中，该酶的活性下降（25％）与类似于对照植物的值。在易感植物中，在水缺损治疗后叶片的回收率中观察到该酶的最高活性（5.71μmolmingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}背影)(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

尽管与灌溉植物相比，中等水缺损略有增加，但NAD-ME的活性在这些水分制的品种之间没有显着差异。另一方面，在再水化后，在耐受植物中刺激了NAD-ME的活性（5.11μmolmingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}CHL），而易感植物（SP80-3280）在严重的水缺水下显示出最高的活性（5.92μmolmingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}CHL），在灌溉后在48小时保持相似的值（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

除了显示在正常供水下分析的所有酶中的最高活动之外，PEPCK还会在暴露于缺陷条件下呈现出品种的大幅增加。易感植物（SP80-3280）显示PEPCK活性逐渐增加，直至严重的水缺陷水平，在恢复处理中保持高活性状态（24.78μmolmingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}背影)。与灌溉条件相比，耐水植株(RB92579)在严重水分亏缺(91%)和恢复(138%)条件下，叶片PEPCK活性均显著提高，其中酶活性最高(28.09 μmol min)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}Chl)与后一种情况(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC）。gydF4y2Ba

各水分亏缺水平下，抗性植株叶片中氨基转移酶AspAT活性均呈上升趋势，复水后48 h (3.61 μmol min)的AspAT活性最高gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}背影)。在易感植物（SP80-3280）中，在严重的水剥离植物中，该酶的活性较高（4.86μmolmingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}Chl)，随后采收率下降了20%(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad).在灌溉和中度水分亏缺条件下，耐受性植株(RB92579)叶片中的AlaAT活性高于SP80-3280植株，在重度水分限制(约1.32 μmol min)条件下，AlaAT活性与SP80-3280植株相当gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba} mg^{−1gydF4y2Ba}背影)。当再水化时，易感植物中的Alaat活性（SP80-3280）返回到植物中在常规供水下检测到的水平（〜80％的下降），而耐植物的植物也会降低，但程度较小，但程度较小（ - 23％）（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

RT-qPCR分析基因表达gydF4y2Ba

编码基因的mRNA配置文件gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba，gydF4y2Banad-megydF4y2Ba，gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba，gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba和gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba在水分亏缺条件下，两种株型的甘蔗叶片均发生了显著的变化。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

nadp-megydF4y2Ba与耐受植株相比，敏感植株的叶片表达量更多，主要是在严重水分亏缺和恢复条件下。抄本的数量gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba在耐受植物（RB92579）中，与浇水植物相比，在最严重的水赤字水平和恢复条件下仅具有小的增加（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

他们俩gydF4y2Banad-megydF4y2Ba在所有的水环境中，敏感植物(SP80-3280)的异构体(两个线粒体)更容易表达。为gydF4y2Banad-me1gydF4y2Ba，我们在各种水平的水赤字中检测到易感植物中的类似模式，而转录物水平的增加与压力强度有关gydF4y2BaNAD-ME2,gydF4y2Ba再水水后有明显的下降48小时gydF4y2Ba．gydF4y2Ba耐受植物（RB92579）表现出甚至更小的转录活动gydF4y2Banad-me1gydF4y2Ba和gydF4y2Banad-me2gydF4y2Ba同种型与易感物中观察到相比（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, c)。gydF4y2Ba

在这两个甘蔗品种中，gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba与正常供水条件下生长的植物相比，在缺水和复水条件下基因表达下调。敏感植物(SP80-3280)表达了大量的转录本gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba基因在所有水质制度中比RB92579（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

他们俩gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba基因亚型对本研究中使用的水环境有不同的反应(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae，f）。RT-QPCR分析显示有更多的成绩单gydF4y2BaAspAT1gydF4y2Ba同种型(胞质)gydF4y2BaAspAT2gydF4y2Ba（线粒体）在甘蔗叶中。gydF4y2BaAspAT1gydF4y2Ba在重新浇水后，在两种植物类型中的所有水缺损水平上显示出增加的MRNA表达增加，但在易感植物（SP80-3280）中被下调。另一方面，gydF4y2BaAspAT2gydF4y2Ba在中度和重度干旱条件下，两品种的表达量均维持在与充足水分条件相似的水平。mRNA水平gydF4y2BaAspAT2gydF4y2Ba重新灌溉后仅增加48小时，在易感植物的情况下，这更明显。gydF4y2Ba

与这里研究的其他基因的转录概况相比，gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba在剥夺水剥夺后的转录物数量最大的增加。gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba在严重水分亏缺条件下，两种株型甘蔗叶片中SP80-3280基因的表达显著上调(在严重水分亏缺条件下，SP80-3280基因的表达上调了15倍)。在恢复处理中，AlaAT的mRNA水平在敏感和耐受性植株中都严重下降(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaG）。gydF4y2Ba

叶水潜力（gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba)可以被认为是一个很好的指示水分状况的指标，它能使甘蔗植物的光合作用达到最大[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]．耐水性耐水植物能够保持更高gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba与相同的水限制水平下的更敏感的值相比[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．同样，在本研究中，耐受性植株(RB92579)表现较弱gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba当遭受12天的严重缺水时(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

两个品种的CO含量均降低gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化率(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）当受水赤字时。然而，有趣的是指出，与正常供水条件（对照处理）的易感植物相比，耐受性植物也呈现了更高的同化速率（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。为了支持这些数据，先前已经表明RB92579工厂实现了更高的COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化，以及在没有水限制的条件下的高茎生物质和糖含量[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．恢复后，敏感植物保持低COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化价值，表明再水化后48小时的时间不足以恢复其COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化能力，不像耐受性植物。这种反应在以前的研究中观察到，一些遭受水分亏缺的甘蔗植物在重新浇水后，光合速率出现了最小的增加，表明恢复原来内环境平衡的能力更低[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

不论品种，减少gydF4y2BaGS.gydF4y2Ba比下降更令人恼火gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，说明水分亏缺对光合作用的抑制很可能与中度水分亏缺下植物气孔关闭有关(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b).在水分限制的甘蔗植株中，由于气孔导度降低，导致光合作用降低(gydF4y2BaGS.gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．正如所料,gydF4y2BaGS.gydF4y2Ba根据水缺陷严重程度减少了值，但在中度和严重水平之间的植物类型之间没有显着差异（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）类似于其他品种中报告的内容[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

对水缺陷条件进行的甘蔗植物具有显着降低的总干重，包括与非应力植物相比的叶面积外，叶片，根和茎的干重[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．正如预期的那样，施用水分亏缺对本研究中使用的两种甘蔗类型的生物量产生了负面影响(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.较低的生物质积累与叶面燃气汇率相关，主要是减少gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaGS.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．有趣的是，在灌溉条件下，耐受性植物较低的植物呈现较高的叶面积和茎干重量，尽管其光合速率低于RB92579，可能是由于与叶面积和光合容量之间的补偿机制相关的抵消效果。众所周知，叶片较少的植物可以相对较高的光合速率。光合活性的增加主要是通过增强气孔导度来实现的，但也可以增加培养的导电率[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．然而，与耐受植物相比，缺水导致敏感SP80-3280的生物量减少更高。gydF4y2Ba

在甘蔗中，据报道，Calvin循环过程和C4途径不受中等水分应激的影响，但在严重应激下，C4酶的活性显着降低[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．在本研究中，NADP-ME，NAD-ME，PEPCK，ASPAT和ALAAT酶的活动表明，在严重的水缺损下，尤其是PEPCK酶在严重的水缺损下的增加。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.在我们的研究中检测到大量的NADP-ME活性，其值与观察到的NADP-ME相似，特别是在严重水分亏缺处理下的甘蔗植株(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa，b）。据推测，该酶提供必要的ATP，以增加压力下甘蔗植物的Pepck活性[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．Western Blot分析表明，主要使用PEPCK的植物物种具有显着的NAD-ME水平[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]．在暴露于严重水缺陷时，我们还检测到两种品种中Aspat和Alaat的活动增加（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad，e）。在gydF4y2Baz梅斯gydF4y2Ba，束鞘细胞显示出天冬氨酸脱羧能力，这一过程显然是由AspAT启动的一系列酶活性完成的，其次是生成苹果酸的NADP-MDH的活性，然后在叶绿体中被NADP-ME脱羧[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．该天冬氨酸脱羧可能占苹果酸盐最大脱羧的约20％，部分地促进总共有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba释放到束鞘细胞[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

Furbank（2011）提出了两项​​假设为Aspartate贡献到CO的池中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在NADP-ME物种中。第一种假说预测，如果PEPCK存在于NADP-ME物种中，则天冬氨酸转氨酶(AspAT)产生的草酰乙酸(OAA)应通过PEPCK在胞质中直接脱羧。这种酶需要叶绿体或线粒体中的ATP来脱羧生成OAA。在第二种假说中，天冬氨酸产生的OAA在维管束中重新还原为苹果酸，然后在叶绿体中通过NADP-ME脱羧[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．在苹果酸被NADP-ME脱羧后，产生的NADPH可以用于卡尔文循环，也可以用于将OAA还原为苹果酸。在这种情况下，丙酮酸可以直接返回到叶肉细胞或通过丙氨酸转氨酶(AlaAT)的作用转化为丙氨酸，丙氨酸转氨酶又被输送到叶肉细胞。在叶肉细胞中，丙氨酸被转化回丙酮酸，在这两种情况下，丙酮酸被转化为PEP都需要ATP [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]．根据以上考虑,PEPCK活性的增加可以增加支持的几种酶的活动:NAD-ME提供ATP必要脱羧酶,AspAT形成草酰乙酸的生产(OAA)和AlaAT丙氨酸通过丙酮酸,这反过来,定向到叶肉细胞(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．在我们的研究中加强了该假设，因为当植物暴露于水缺损时，当植物暴露于水缺损时，我们检测到这些酶的活性增加，特别是在严重的水剥夺下的易感植物（SP80-3280）中（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.集体，我们的数据赞成第二个假设，以便为香港油池贡献到CO的池中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在NADP-ME物种中[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．增加数量的转录物和酶活性（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）ASPAT形成OAA，PEPCK为OAA的脱羧，形成PEP和ALAAT通过丙酮酸支持丙氨酸，支持这种观点。不同的C4途径的灵活使用可能允许在不同环境条件下维持更大的光合效率，例如在本研究中应用的那些。这是因为除了NADPH转化为苹果醛的NADPH外，仅仅需要更多NADP-ME需要更多的能量将丙酮酸转化为蛋白质中的蛋白质中的PEP。通过使用Pepck，PEG能够直接返回叶肉细胞，并且已经在羧化中使用，而无需任何额外的能量消耗并且不需要PPDK酶。gydF4y2Ba

PEPCK活动的增加可以通过各种环境因素进行调制[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．特别是在甘蔗中，遮光导致PEPCK脱羧酶增加，这表明该酶是弱光条件下的主要脱羧酶[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．这些作者表明了这一点gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba脱羧化使用更少的量子gydF4y2Ba每gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定而不是gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba，因此增加gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba活动有利于维持甚至增加CO的量子效率gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba限制光下的同化。我们的数据表明，通过增加水缺陷水平，酶的活性对于涉及PEPCK脱羧的反应也有所增加（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

考虑到与C4光合作用相关的酶的调节受到水分限制的影响，我们分析了编码这些酶的基因的转录水平[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．增加的成绩单数量gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba在易感植物中严重水缺陷的基因可以通过以下事实来解释，在这些应力条件下，气孔导率降低和CO的量gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba进入叶肉细胞的量也减少了。在这种情况下，作为COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba输入越低，这种酶的表达量就会增加，以供应COgydF4y2Ba_2gydF4y2BaCalvin周期所需[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba] （图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。据报道了gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba和gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba在秸秆伸长阶段的水缺陷甘蔗植物下没有显着富集转录物，而gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba高度诱导[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，这也发生在我们的工作中。然而，与该研究相反，我们观察到编码天门冬氨酸转氨酶(gydF4y2BaAspAT1gydF4y2Ba）在严重的水限制（灌溉悬浮液后九天）下表现出高转录活性（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae)。大量的成绩单gydF4y2BaAspAT2gydF4y2Ba和gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba基因可能与我们作品中观察到的PEPCK的高活性有关（图。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Baf和g）。在使用该第二脱羧酶的情况下，更需要参与该途径的其他酶以使脱羧机制有效地加工。这已经证明gydF4y2Baz梅斯gydF4y2Ba和gydF4y2BaSetaria Viridis.gydF4y2Ba，属于nadp-me subtype的物种，其中gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba和gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba基因在叶片和束鞘细胞中高度表达[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

虽然PEPCK在严重的水剥夺下甘蔗植物中的高活性呈现出高活性（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac），编码该酶的基因的表达没有遵循相同的模式并减少当两个品种暴露于水缺损时的转录物数量（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad）。酶活性与基因的转录水平之间的关系可能是各种因素的结果，例如昼夜节律，转录稳定性，转录因子，增强剂活性，转录后和转基因后调节途径，基材可用性以及不同同种型的参与在不同时间和空间水平的生物过程中[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]．众所周知，PEPCK的活性受多种因素的调节，如光、生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]在一些C4叶中观察到Pepck的磷酸化[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]．因此,可能的upregulation PEPCK脱羧甘蔗剥夺植物在水中活动观察到这里可能是由通过phosphorylation-dephosphorylation反应很容易推测upregulation甘蔗PEPCK活性的植物在水中缺乏观察这里不会发生一个t the transcriptional level, but rather via modulation of phosphorylation–dephosphorylation reactions. The purification of this enzyme and cloning of the complete cDNA sequence of thePPCKgydF4y2Ba该基因可能与缺水条件下甘蔗特异磷酸化位点的鉴定及其功能意义有关。gydF4y2Ba

当甘蔗植物进行水赤字时，NAD的一种同种型的mRNA表达大幅增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba依赖苹果酶(gydF4y2Banad-me2gydF4y2Ba）在易感植物（SP80-3280）中，尤其是在严重的水缺损下。然而，该基因的表达仍然低于观察到的gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba在正常供水条件下（控制）。在这种情况下，六个更大的放大循环（gydF4y2BaCgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba-定量循环)的检测gydF4y2Banad-me2gydF4y2Ba基因与之相比gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba基因在两个品种(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S2）。甚至考虑了引物效率的差异，这些数据显示了gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba基因更加表达（约50倍）gydF4y2Banad-me2gydF4y2Ba在非胁迫条件下(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, c)gydF4y2BaCgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba的值gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba在正常供水下的植物中MRNA类似于检测到的植物gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba在两个品种(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S2）。高表达gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba基因也在玉米叶片的束鞘细胞中被观察到，玉米叶片属于NADP-ME亚型[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．因此，首选表达gydF4y2Banad-megydF4y2Ba和gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba基因可能与其相应的亚型完全相关。gydF4y2Ba

如上所述，AspAT和AlaAT酶的基因表达和活性增加，这不是经典NADP-ME亚型所使用的代谢途径的特征[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]在水赤字条件下检测在甘蔗中。同意，在使用Sage技术的转录组研究中，没有gydF4y2Banadp-mdh.gydF4y2Ba转录本检测到较高的mRNA水平gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba和gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba确定基因[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]．观察到的缺乏（或低水平）gydF4y2Banadp-mdh.gydF4y2Ba转录相当于更高的表达gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba和gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba表明，Pepck脱羧途径似乎在甘蔗叶中起作用，均在灌溉条件下以及水缺陷条件下的条件下。我们的数据支持最近的研究表明，其在先前认为以先前认为的各种植物中的混合脱羧C4途径发生的研究发生在C4光合机制的单个亚型[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

添加到C4亚型中仅通过相应的酶活性进行分类甘蔗的难度，是甘蔗是甘蔗的唯一命名的NADP-ME物种，其中据报道麦芽肿细胞的存在迄今为止存在[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．NADP-ME亚型的植物不具有碎片鞘，它是位于束鞘细胞和血管束之间的乘积非光合细胞层（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S3）。甘蔗是唯一有趣的例外，因为已经清楚地检测到血管包围周围的碎片的存在[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．此外，值得一提的是，在可能在阴影下生长的甘蔗植物中观察到束鞘细胞的叶片鞘细胞的叶片细胞叶片细胞的变化均匀分布（典型的Pepck亚型）。增加CO.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba鞘和叶片细胞之间的扩散，减少COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba损失(gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．这些作者认为，这种重排成为保持有限公司效率的重要性gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在弱光条件下同化，这也可能是缺水条件下的情况。gydF4y2Ba

最后,尽管gydF4y2Ba^13.gydF4y2Ba在更广泛的造影品种中的C通量测量是必需的，以获得将PEPCK连接到耐旱的直接证据，在水赤字条件下使用PEPCK通路的巨大增加表明，需要进一步探索这一方面。gydF4y2Ba

除了NADP-ME途径之外，酶活性和基因表达分析表明甘蔗使用PEPCK途径作为脱羧机制。在水赤字的条件下，检测到Pepck途径的使用越来越大，特别是在耐受品种中，建议额外的调查检查Pepck脱羧途径的互补使用作为其他甘蔗植物在水中的反应和调整剥夺。gydF4y2Ba

植物材料和水赤字治疗gydF4y2Ba

甘蔗植物由单节点茎段（大约7cm）从CV产生。RB92578，耐水赤字[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]和cv。SP80-3280，易受水赤字的影响[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．每种品种的类似尺寸（每株术后的一个茎秆茎）的植物在填充有13千克富营养的红黄色Argisoil的塑料罐（15L）中生长[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]在温室条件下。通过在135 dae（出现后的天数）中加入5g 20-00-20（NPK），并在165 dae中加入5g 20-00-20（NPK），根据化学分析进行土壤施肥。gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．所有的植物每天浇水到滴点，直到干旱处理开始。gydF4y2Ba

水分亏缺处理在茎伸长期出苗后210 d开始。通过叶片水势(gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba)，中午在第三片完全展开的叶片中，用压力室(PMS 1000, PMS Instruments, USA)测量。处理包括不同程度的水分亏缺:对照(正常供水条件，gydF4y2BaψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba = − 0.4 to − 0.6 MPa), moderate level (ψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba = − 1.5 to − 1.8 MPa) three days after the onset of the water deprivation, severe level (ψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba = below − 2.0 MPa) twelve days after the onset of the water deprivation and re-watered plants (48 h after rehydration,ψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba = − 0.6 to − 1.0 MPa). In the control treatment, the pots were maintained at 100% field capacity, while for the water deficit treatment the soil water content was adjusted to 30% of field water holding capacity by daily watering according to evapotranspirated water estimated by weighing the pots for twelve days. The two cultivars reached the established water deficit levels at the same time: the moderate condition occurred three days after the imposition of the water deficit, while the severe level occurred nine days after that date, totaling twelve days of water shortage.

气体交换测量gydF4y2Ba

叶片气体交换分析在+ 1叶中进行（第一叶完全从上到下膨胀[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]），当植物达到既定的水赤字水平（水扣后3和12天，再水解后48小时），总是在中午。分析过程中的环境条件是PAR（光合活性辐射）800μmolMgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，28至29°C的空气温度，平均湿度67±3.3％，叶温31.7±0.6°C和VPDL 2.4±0.6 KPA。在1600μmolm的照射下，在+ 1叶中进行测量gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度400ppmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．将叶片组织置于叶室室中，并在测量之前短暂地适应5分钟，直到读数稳定。有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba），气孔电导（gydF4y2BaGS.gydF4y2Ba）和蒸腾（gydF4y2BaEgydF4y2Ba）使用红外气体分析仪（Li-6400xtr，Li-Cor，Lincoln，USA）进行量化。收获分析的叶片，立即在液体N中冷冻并储存在Ultrafreezer（MDF-U33 V-PE VIP ULT，80°C的Ultrafreezer（MDF-U33 V-PE VIP VIP ULT，Panasonic，Loughborough，英国）直至酶和RT-QPCR分析。恢复后，收集植物以进行生物量分析。gydF4y2Ba

酶促测定gydF4y2Ba

提取液的方法是将20 mg冷冻叶片样品(从+ 1叶片的中间三分之一中取出)磨碎，置于1 mL的冰冷提取培养基中。对于酶NADP-ME, NADP-ME和PEPCK，缓冲液含有50 mM Bicine-KOH (pH 8.0)， 1 mM EDTA, 5% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）PVP 25000,6％（W / V）PEG 4000,10mM DTT，50mM 2-巯基乙醇和1％（gydF4y2BavgydF4y2Ba/ v）蛋白酶抑制剂鸡尾酒[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．对于AspAT和AlaAT，缓冲液由10% (v/v)甘油，0.25% (w/v) BSA, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM Hepes-KOH (pH 7.5)， 10 mM MgCl组成gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% (v/v)蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1 mM DTT [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

NADP-ME（EC 1.1.1.40），NAD-ME（EC 1.1.1.39）和PEPCK（EC 4.1.1.49）酶的最大活动量化了[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．对于NADP-ME，反应混合物(1.5 mL)含有50 mM Hepes-KOH (pH 8.0)， 10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 0.5 mM NADPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba、5 mM l -苹果酸和40 μL叶提取物。对于NAD-ME，溶液(1.5 mL)包含50 mM Hepes-KOH (pH 7.2)， 4 mM MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，0.1毫米COA，4毫米NADgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba， 5 mM l -苹果酸和40 mL叶提取物进行定量。在这两种分析中，萃取物与除底物外的所有试剂在25℃下孵育3 min，加入l -苹果酸开始反应。PEPCK的测定使用1.5 mL溶液，其中包含100 mM Hepes-KOH (pH 7.0)， 100 mM KCl, 90 mM KHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba，5 mm mgclgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 2毫米锰clgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，1mM ADP，0.2mm NADH，12 U苹果脱氢酶，5mM PEP和40μL叶子提取物。通过添加PEP开始反应。在这三种程序中，通过分光光度法（模型UV-M51，BEL，RIO DE Janeiro，Brazil）以340nm的波长进行1分钟监测吸光度。gydF4y2Ba

aspat（ec 2.6.1.1）的酶活性[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]和Alaat（ec 2.6.1.2）[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba还确定了。对于ASPAT，在含有50mM Tris-HCl（pH 7.8）的溶液中进行反应，50mM L-天冬氨酸，10mM 2-氧氟醚，0.07mM吡哆醛磷酸盐，0.1mm NadH，2 U苹果酸脱氢酶和40μl叶片最终体积的1.5 ml提取物。对于Alaat，含有10mM L-丙氨酸的溶液（1.5mL），5mm 2-氧缺乏酸盐，0.1mm Nadh，50mM Tris-HCl（pH7.5），5u乳酸脱氢酶和40μl叶提取物。在两种分析中，将叶子提取物与除2-氧基劳替酸盐除外3分钟外，在25℃下孵育，并在加入2-氧氯丁酸盐开始反应。在两种重复后，通过分光光度法在340nm的分光光度法下监测吸光度变化，每次治疗三个生物学重复的两种重复后，立即在340nm。gydF4y2Ba

酶活性基于总叶绿素含量。为此，从20mg叶片组织中测定在80％丙酮溶液中以40％丙酮溶液在4℃下保持24小时并保护免于光。测定通过分光光度法在645nm和663nm处进行[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

生物量gydF4y2Ba

试验结束时，将水分亏缺3 d(中度亏缺)和12 d(重度亏缺)的植株移出盆栽，分为茎、叶、根三组进行生物量评价。总叶面积用叶面积计(LI-3000A, LI-COR, Lincoln, USA)测量。在60°C的空气干燥器中干燥样品后，记录叶片和根系的干重，并取平均值，直到使用精密天平获得恒定的重量。对茎干重量也进行了评估[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

筛选、搜索和分析候选基因序列gydF4y2Ba

我们评估了编码以下酶的mrna水平:gydF4y2Banadp-megydF4y2Ba（NADP-苹果酶）;2，gydF4y2Banad-megydF4y2Ba（NAD-苹果酶）;3，gydF4y2BaPepck.gydF4y2Ba(磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase);4，gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba（天冬氨酸氨基转移酶）;5，gydF4y2BaalaatgydF4y2Ba（丙氨酸氨基转移酶）。选择这些基因的分析主要是由于它们在C4光合作用的三种亚型中的作用[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]．鉴定与上述酶的合成相关的甘蔗转录物通过同一性与相应的高粱进行（gydF4y2Ba高粱二色的gydF4y2Ba)直接同源。利用高粱各基因编码区序列对甘蔗est进行查询。SP80-3280使用BLAST工具(gydF4y2Bahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi.gydF4y2Ba）.从（1）获得使用454测序技术获得的一组完全编码序列的甘蔗酯[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]和（2）“基因指数数据库”，可用gydF4y2Baftp://occams.dfci.harvard.edu/pub/bio/tgi/data/saccharum_officinarum/gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

然后使用BLASTX选项将选定的甘蔗转录本与GenBank上的高粱基因组序列进行比较，以确保该转录本是与其高粱同源物(accession, e-value, score)相匹配的最佳转录本。此外，利用ClustalW多序列比对算法(gydF4y2Bahttps://www.genome.jp/tools-bin/clustalw.gydF4y2Ba）评估序列之间的保护模式（表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.为了确保彻底的分析，Multiloc2 [gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]和目标[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba用于预测每种酶的蛋白质的亚细胞定位。gydF4y2Ba

底漆设计gydF4y2Ba

使用Program Primer3Plus设计了引物[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]，获得80 ~ 120 bp的扩增子，Tm为57°C ~ 60°C，长度为20 ~ 23 bp, GC为40 ~ 80%(见表4)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.具有多于一种同种型的基因序列（gydF4y2Banad-megydF4y2Ba和gydF4y2Baaspat.gydF4y2Ba）通过CLUSTALW程序对齐，以识别保守区域并设计针对每种同种型的引物。为了避免对其他转录物进行非特异性退火，所有引物对都受到挑战gydF4y2Ba糖果gydF4y2BaSPP。使用Primer-Blast沉积在Genbank上的序列（gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

RNA提取和cDNA合成gydF4y2Ba

使用Purelink Plant™RNA试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）在制造商的说明之后从+ 1叶中的中三分之一的100mg从+ 1叶中的中间三分之一中取出总RNA。使用无RNase的DNase I（Turbo DNase，Ambion，Austin，Tx）除去污染DNA。在260nm UV的分光光度法评估总RNA的产率，其相对纯度通过260/280nm的吸光度率估计，并且在1.2％上检查的完整性（gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba）溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。通过缺乏内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因组DNA扩增证实了基因组DNA污染的缺失（gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba）通过PCR基因。gydF4y2Ba

根据生产说明书，用SuperScript IV逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从2 μg总RNA中合成cDNA。特定产品和扩增子长度的引物对PCR验证了使用一个池的cDNA在下列条件下样品的解决方案:在95°C初始变性5分钟,其次是40 95°C的周期为1分钟,57°C 30年代,30年代72°C, 72°C的最终扩展步骤2分钟。扩增产物在1.5% (w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳，确定产物大小。gydF4y2Ba

RT-qPCRgydF4y2Ba

使用SYBR Green PCR主混合物（Applied Biosystems），在StealOnPlus™实时PCR系统（Applied Biosystems）中进行RT-QPCR反应。每个反应由1μlcDNA样品（1：5稀释），5μlssbr绿色PCR主混合物，0.4μl每种底漆（5μm）和无核酸酶的水至10μl的总体积。热条件为95℃，2分钟，其次为40℃，30℃和60℃的40℃。在发布QPCR实验（MIQE）的最小信息之后，所有反应一式一式一式一式一式三份，每次进行三份的生物学复制（MIQE）[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]．分析熔化曲线以验证非特异性产品的存在，仅在单峰的情况下使用引物。每个引物对的平均放大效率由LINREGPCR计划计算[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]，使用从所有样本中提取的cDNA文库(见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

每个基因的相对表达量用(1 + E)计算gydF4y2Ba^{——ΔΔCtgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]．在所有分析中，靶基因的转录水平归一化在内源参考基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba）[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]．以正常供水条件下生长的SP80-3280植株中各靶基因的相对mRNA水平作为校正器。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

该实验以2×4因子（品种X水域）进行，在完全随机化设计中进行，每个水域内的三次重复。每次复制由每罐一株植物组成，共24株植物。从气体交换测量，生物质和酶活性的数据进行差异分析（ANOVA），当显着时，使用统计程序SISVAR版本5.3的概率为5％的Tukey试验比较手段[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

净联合gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化gydF4y2Ba

Alaat：gydF4y2Ba

丙氨酸氨基转移酶gydF4y2Ba

AspAT:gydF4y2Ba

天冬氨酸氨基转移酶gydF4y2Ba

CgydF4y2Ba_问gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

量化周期gydF4y2Ba

EgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

蒸腾作用gydF4y2Ba

GAPDHgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

甘油醛-3-磷酸脱氢酶gydF4y2Ba

GS.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

气孔电导gydF4y2Ba

拉gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

叶面积gydF4y2Ba

LDW.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

叶片干重gydF4y2Ba

NAD-ME:gydF4y2Ba

NAD-苹果酶gydF4y2Ba

NADP-MDH:gydF4y2Ba

NADP-dependent苹果酸脱氢酶gydF4y2Ba

NADP-ME:gydF4y2Ba

NADP-苹果酶gydF4y2Ba

OAA:gydF4y2Ba

草酸乙酸盐gydF4y2Ba

PEP：gydF4y2Ba

磷丙酮酸gydF4y2Ba

Pepc：gydF4y2Ba

磷丙酮酸羧化酶gydF4y2Ba

PEPCK:gydF4y2Ba

磷酸烯醇丙酮酸carboxykinasegydF4y2Ba

PPDK:gydF4y2Ba

正正磷酸丙酮酸二氨基酶gydF4y2Ba

rdw.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

根干重gydF4y2Ba

智者：gydF4y2Ba

基因表达的序列分析gydF4y2Ba

SDWgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

茎干重gydF4y2Ba

TDW.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

总干重gydF4y2Ba

ψgydF4y2Ba_wgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

水势gydF4y2Ba

我们感谢CNPQ和CAPES支持这项研究，Gustavo Maia Souza博士为生理措施和Sandy J. Snyman博士的建议。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

该工作得到了国家科技发展理事会，CNPQ（研究授予编号446393/201-2）支持LGEV。VC由CoordenaçãodeAperfeçoamentodePessoaldeNível上级，披肩（财务代码001）提供支持。筹资机构只提供了这项工作的实验成本和出版费用;数据的实验设计，分析和解释以及本手稿的写作是由助成的作者进行的。gydF4y2Ba

可用性数据和材料gydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发表的文章[及其补充信息文件]中。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Centro de estudos em Ecofisologia植物植物Do Oeste Paulista（Cevop），罗斯特·保利斯塔（UNOESTE），罗维亚Raposo Tavares，KM 572，CEP，SP，SP，19067-175，巴西19067-175gydF4y2Ba

   Viviane Cacefo, Rafael Rebes Zilliani, Daniel Moreira Neris和Adriana Lima MorogydF4y2Ba

2. 农艺研究生课程，罗斯特·保利斯塔（UNOESTE），罗维亚Raposo塔瓦斯，KM 572，CEP，总统Prudente，SP，19067-175，巴西gydF4y2Ba

   亚历山德拉·费雷拉·里巴斯和路易斯·贡扎加·埃斯特维斯·维埃拉gydF4y2Ba

3. Instituto de Biociências de里约热内卢Claro, Universidade Estadual Paulista (UNESP)， Avenida 24-A, 1515, CEP，里约热内卢Claro, SP, 13506-900，巴西gydF4y2Ba

   Douglas Silva DominguegydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

LGEV构思和设计了实验。VC和RRZ进行了非生物应激实验。VC和AFR进行RT-QPCR测定并分析数据。VC，DMN和ALM进行酶测定。LGEV和VC写了稿件。DSD为生物信息学分析提供了知识分子输入并修订了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2BaLuiz Gonzaga Esteves VieiragydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba