拟南芥rna结合蛋白组的变化揭示了新的应激反应机制gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

rna结合蛋白(rna binding protein, rbp)越来越被认为是转录后基因表达的调控成分。rbp通过RNA结合域与mrna相互作用，这些相互作用影响RNA的翻译可用性、RNA稳定性和翻转，从而影响发育和刺激特异性反应所必需的RNA和蛋白质表达。在这里，我们研究了严重干旱胁迫对rna结合蛋白质组的影响，以深入了解在系统水平上控制干旱胁迫反应的机制。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

无标记质谱法鉴定出567种蛋白质，其中150种对干旱诱导处理有显著反应。基因本体论分析显示，在“RNA结合”和“RNA加工”类别以及“对脱落酸的反应”和“对缺水的反应”等生物过程中都有富集。重要的是，大量的应激反应蛋白以前没有被确定为rbp，包括碳水化合物代谢中的蛋白质，特别是糖酵解和柠檬酸途径中的蛋白质。这表明rbp在应激反应过程中控制代谢变化的过程中具有迄今未知的作用。此外，RBP结构域的比较分析显示了植物和动物之间的植物特异性结构域和共同结构域。后者可能表明rbp是古代应激反应的一部分。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究建立了mRNA相互作用组捕获技术作为研究环境变化中涉及的应激信号反应的方法。我们的研究结果表明，蛋白质组中的RBP变化是植物适应不断变化的环境的关键成分，特别是干旱胁迫下RNA代谢的蛋白质依赖变化。gydF4y2Ba

RNA结合蛋白(rbp)决定RNA从合成到衰变的命运，并越来越被认为是关键的转录后基因调控因子。rbp通过RNA结合域(rbd)结合mrna，从而影响RNA加工和翻译的可用性[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba对刺激特异性反应至关重要的[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。值得注意的是，在动物系统中，人们注意到，修改表达模式或使rbp和/或其靶结合位点突变会影响备选剪接事件，并可能引发神经系统疾病和癌症等疾病[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。此外，已经观察到转录阻滞诱导应激颗粒形成，以响应低氧、氧化和热应激[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。应激颗粒是由非翻译信使核糖核蛋白的细胞质聚集体形成的细胞质灶，被描述为mRNA储存、分类和分类的位点。然而，它们还没有在植物和其他系统中得到充分的表征。gydF4y2Ba

通过使用相互作用组捕获技术，对rna结合蛋白质组(RBPome)的系统水平检测已经成为可能，并在几个物种中产生了全基因组的mRNA相互作用组[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba他们揭示了哺乳动物细胞和酵母之间的高度相似性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，以及植物[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba表明有一个古老的起源。相互作用组捕获包括通过紫外交联将蛋白质在体内固定到其靶mrna上，然后通过聚腺苷化RNA的亲和捕获纯化mrna -蛋白质复合物，然后通过串联质谱(MS/MS)分析相互作用蛋白。与其他基于化学固定的交联技术相比，该技术具有很大的优势，因为它在体内产生物理相互作用的蛋白质和mrna之间的共价键[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。它还允许时间分辨分离rbp，从而表征细胞系统的目标发育和生理状态。此外，已经确定细胞对应激信号的反应迫使基因表达的严格调控，包括编码特定应激反应因子的基因的及时上调。然而，相应的应激反应RBPome仍有待建立。因此，我们开始确定一个定义的非生物胁迫是否诱导RBP响应特征，并使用拟南芥对干旱胁迫的响应作为实验测试系统。我们首先建立了相互作用组捕获技术作为研究胁迫响应的方法，特别是干旱响应RBPome。我们认为，后者的变化将提供对应激期间控制代谢变化的机制的见解，我们的结果将提供一个独特的系统视图RBP变化。最后，我们认为应激诱导的rbp可能是一种进化保守的机制，控制着对应激的转录后反应。gydF4y2Ba

这里我们使用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮培养(生态型哥伦比亚-0)，以获得和表征植物胁迫RBPome，并深入了解在系统水平上控制胁迫反应的机制。3个生物重复，添加40% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v) PEG是一种模拟干旱胁迫的脱水诱导剂，在1 h和4 h采集样品并测量ABA水平。gydF4y2Ba

脱落酸测定gydF4y2Ba

以40% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v) PEG是否足以诱导或模拟干旱胁迫，我们使用Phytodetek®ABA免疫测定试剂盒进行了ABA测定。与对照样品相比，处理后1小时和4小时ABA水平迅速上升(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).我们注意到ABA在1 h时增加了3倍，在4 h时增加了1.5倍，这与干旱胁迫的诱导一致(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).这进一步证实，暴露于干旱胁迫下会发出一个快速的细胞信号，导致ABA激素水平的增加，ABA是干旱或水脱水胁迫的典型应激标志物。gydF4y2Ba

对干旱胁迫响应的rbp鉴定gydF4y2Ba

质谱分析鉴定出1408个蛋白，其中567个蛋白对干旱胁迫表现出特定的时间依赖性反应，这些蛋白代表drRBPome。在567种反应蛋白中，178种蛋白在处理后1小时或4小时被检测到，191种蛋白在处理后1小时和4小时都被检测到，而48种蛋白仅在对照样品中持续被检测到，或者在暴露于应激时无法被检测到(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表1)。值得注意的是，只有在本研究中使用的所有三个生物重复中一致检测到蛋白质时，才考虑到干旱胁迫导致的这些随时间变化的瞬时变化。这组rbp代表仅在应力处理的样品中存在或不存在的蛋白质。其余150个显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba-值≤0.05)改变的蛋白(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表1)表示干旱胁迫响应rbp (drrbp)。drrbp含有核糖体蛋白S15A (AT1G07770)、ILITYHIA (AT1G64790)和ABA超敏1 (CBP80, AT2G13540)，其丰度显著增加(loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-倍数变化≥1.5;gydF4y2BapgydF4y2Ba-value≤0.05)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)处理后1h和4h。相反，rna结合蛋白(AT3G15010)、开花时间控制蛋白(AT4G16280)、透明质酸(AtRGGA, AT4G16830)、共伴侣GrpE家族蛋白(AT4G26780)、富含甘氨酸的rna结合蛋白8或冷、昼夜节律和rna结合蛋白1 (GR-RBP8, AT4G39260)和核运输因子2 (NTF2, AT5G43960)的丰度降低。这些蛋白质中的大多数先前与干旱和/或ABA反应有关，例如CBP80和AtRGGA，它们作为rbp的作用被认为对渗透胁迫的适当反应很重要[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。在长时间暴露于ABA或PEG后，观察到AtRGGA基因表达增加[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。这与这些rbp作为干旱胁迫反应信号的转录后调节剂的观点是一致的。gydF4y2Ba

接下来，我们评估了与RNA结合的刺激特异性rbp在蛋白质组水平上的变化。在蛋白质水平上，大多数drrbp没有变化，除了5个蛋白表现出显著的(gydF4y2BapgydF4y2Ba-值≤0.05)处理后蛋白和RBP水平的丰度变化(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。这五种蛋白中的三种，钙结合的EF hand蛋白、轮状酶CYP1和rna结合蛋白(AT1G60650)，在蛋白质丰度和rna结合水平上表现出不同的反应，即rna结合水平升高，蛋白质丰度降低。SWIB/MDM2结构域蛋白和胁迫诱导蛋白在蛋白和rna结合水平上的反应趋势相似。总的来说，数据表明，观察到的rna与蛋白质结合的变化是由于RBP-RNA相互作用，因此是细胞对应激刺激反应的一部分。gydF4y2Ba

响应干旱胁迫的RBPome结构域组织gydF4y2Ba

为了进一步表征drRBPome的组成，我们观察了RBD的富集，并注意到50个蛋白质含有RNA识别基序(RRM)，代表了该数据集中最突出的RBD(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。6个含有NTF2结构域的RRM蛋白也含有NTF2结构域。其他主要的“经典”RBDs包括锌指(ZF)-CCCH, k同源性，DEAD解旋酶，like-Smith(通常称为LSm)，聚(A)结合蛋白和冷休克结构域(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。此外，300种蛋白质含有未知或未经证实的rbd(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表2)。rdb产生了一种三向分类。第一类包括基于rbd和/或RNA加工作用与RNA生物学相关的蛋白质(占RBPome的42%)，第二类包含核糖体蛋白质(5%)，第三类包含目前未知的RNA相互作用的蛋白质(53%)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).后者表明有大量潜在的rna相互作用蛋白尚未完全表征，特别是它们的作用方式和靶rna。gydF4y2Ba

drrbp在基因本体(GO)类别中表现出丰富gydF4y2Ba

也许并不令人惊讶的是，drrbb在功能类别中丰富，“核酸结合”和“RNA结合”(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD)和干旱特异性过程，这是最丰富的生物过程之一。后者包括“应激反应”和“刺激反应”，包括激素和温度刺激、“ABA刺激反应”、“渗透应激反应”和“缺水反应”(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae、附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba表S3)。此外，还丰富了信号转导中继相关的“转运”、“在细胞内建立定位”等过程。在后一种情况下，在这一类中富集的蛋白质包括六种NTF2蛋白，它们参与mRNA的核胞质转运，这一过程使各自的mRNA能够在目的地翻译[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。在治疗的第一个小时内，所有六种NTF2蛋白的丰度都下降，这可能表明其靶mrna的核质转运减少。相反，核孔锚蛋白(一种介导RNA和其他货物在细胞核和细胞质之间运输的蛋白质)的丰度增加。核孔锚已被证明是细胞核和细胞质之间的RNA稳态所必需的，并且是开花时间和生长素信号传导所必需的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

选择一组上调和/或下调最多的蛋白和前300个共表达蛋白进行共表达分析，以进一步表征。总的来说，共表达分析表明，在排名最高的蛋白质中，普遍倾向于在应激处理时具有时间特异性的蛋白质，尽管也存在一些在1 h和4 h时差异调节的蛋白质(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba表6)。后者的例子包括ILITHYA，它有56个来自drRBP响应蛋白的共表达蛋白，其中17个在干旱胁迫下上调。上调的蛋白包括经典的干旱胁迫响应蛋白CBP80、参与中间代谢的蛋白如磷酸果糖激酶(AT1G20950)和碳水化合物结合样折叠蛋白(AT3G62360)，以及各种RNA结合蛋白包括NTF2 (AT1G13730)、eIF2 γ (AT1G04170)和核糖体蛋白L4/L1 (AT3G09630)。第二种高度表达的共表达蛋白是核仁gtp结合蛋白(AT1G50920)，其中55种蛋白对干旱胁迫有反应，其中13种是差异调节的。第三个是腺嘌呤核苷酸α水解酶样超级蛋白(AT5G54430)，有41个(其中15个受差异调节)蛋白，其次是鸟苷结合蛋白(AT5G46070)，有38个(其中13个受差异调节)蛋白。其中代表性最少的是有15个蛋白(5个是差异调节的)的开花时间控制(AT4G16280)。与花期调控蛋白共表达的蛋白除了具有典型的发育生物学作用外，还参与RNA结合。与腺嘌呤核苷酸α水解酶样超级蛋白共表达的蛋白质倾向于富集“应激反应”和“初级代谢过程”等生物过程。值得注意的是，所选蛋白及其共表达蛋白的富集生物学过程均涉及RNA代谢过程、翻译活动或中间代谢，功能上偏向于RNA结合。共表达分析表明，drrbp具有很强的连通性网络，在生物技术上可能是提高作物耐旱性的重要靶点。gydF4y2Ba

探测到的enigmarbp对干旱胁迫有响应gydF4y2Ba

对独特的uv富集和drrbp进行了途径分析。KEGG注释的途径揭示了对代谢酶的偏爱，特别是对治疗后丰度增加的蛋白质。七个应激反应蛋白属于碳水化合物代谢途径(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(表S4)和6种(甘油醛3-磷酸脱氢酶C-2 (GAPC2)、丙酮酸脱氢酶E1组分α-亚基(PDHA)、磷酸果糖激酶、醛脱氢酶7B4 (ALDH7B4)、细胞质nadi依赖性苹果酸脱氢酶1和乌头酸酶3 (ACO))在糖酵解和柠檬酸循环中起作用。两种蛋白(ALDH7B4和单脱氢抗坏血酸还原酶1)是抗坏血酸和醛酸盐代谢的一部分。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在代谢中发挥作用的rbp的鉴定将转录后基因调控与应激诱导的代谢变化联系起来，并可能表明rbp通过(自动)调节自身或其他mRNA物种来发挥作用。此外，4种碳水化合物代谢蛋白(GAPC2、ALDH7B4、PDHA和ACO)在“响应ABA刺激”、“响应水衍生”和“响应氧化应激”的基因本体类别中也富集。在动物中，除了糖酵解活性外，GAPC2还具有依赖于其亚细胞定位的非糖酵解功能，例如，在细胞核中，它作为程序性细胞死亡的信号[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]并参与转录后调控和维持DNA完整性[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。在蛋白水平上，GAPC2的表达在低温胁迫下增加[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。在本研究中，我们注意到GAPC2在转录后水平上对干旱胁迫的响应增加，这表明其靶RNA的潜在转录上升。醛脱氢酶7B4是“肿瘤反应性”ALDH基因的一员[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba在压力处理后也会增加。ALDH蛋白家族在暴露于环境胁迫(如盐度和脱水)时，对植物产生的醛进行解毒[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。敲除突变体,gydF4y2BaALDH3I1gydF4y2Ba和gydF4y2BaALDH7B4gydF4y2Ba与野生型植物相比，T-DNA对脱水和盐度胁迫表现出更高的敏感性，这与ALDH基因在胁迫反应中的作用一致[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。在转录水平上，丰度gydF4y2BaALDH7B4gydF4y2Ba在脱水和ABA处理后，植株和根呈增加趋势，在缓解胁迫后呈时间依赖性下降[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。在之前的研究中，我们确定ALDH7B4为候选RBP [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba我们发现它在应激反应性RBPome中持续丰富。ADLH7B4具有糖酵解酶和与RNA相互作用的双重功能，从而在干旱胁迫下发挥转录后基因调控作用。我们还注意到对干旱胁迫有反应的另一种特性良好的糖酵解酶是ACO。乌头酸酶是一种铁调节蛋白1 (IRP1)，它催化柠檬酸转化为异柠檬酸。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在动物中，ACO1是一种双功能蛋白，在其催化中心存在铁硫簇时具有催化活性，而在没有簇的情况下，它作为RBP起作用，调节转录本的翻译或稳定性[qh]gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。在植物中，一氧化氮和氧化应激已被证明可以调节铁蛋白的表达[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]并使ACO的催化活性失活[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba通过改变其4Fe-4S簇的结构，将其转化为IRP1。ACO3对氧化应激的响应[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]并在体内与mRNA相互作用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。干旱胁迫下ACO3丰度的增加与转录后调控作用一致，这可能会影响转录组，最终影响蛋白质组和代谢组。综上所述，干旱胁迫诱导的rna相互作用蛋白的差异积累在特定功能组中被过度代表。gydF4y2Ba

drRBPome的生物物理特性及序列拓扑结构gydF4y2Ba

还分析了rbp的生物物理和氨基酸(aa)序列特征，以确定rbp与RNA相互作用的物理特性。drRBPome，很像输入参考和RBP汇辑数据[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，涵盖了蛋白质大小的全谱，大多数蛋白质长度< 1000 aa(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).然而，与参考数据相比，我们注意到与RNA生物学相关的drRBP的行为与与未知RNA生物学相关的drRBP和未知RNA生物学相关的RBP库的行为相同。与RNA生物学相关的蛋白质显示，与RNA生物学未知的蛋白质相比，氨基酸序列长度在1000到2000之间的蛋白质密度较高。在等电点上也有类似的趋势gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)分布(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)“p”gydF4y2Ba我gydF4y2Ba在RNA相互作用中富集的蛋白质显示出与参考数据不同的相似模式。此外，drRBP和RBP库中未知RNA生物学的蛋白质具有相同的结构，并且drRBP和RBP库中与RNA生物学相关的蛋白质具有相同的结构。pgydF4y2Ba我gydF4y2Ba后者的分布显著地向更高的p偏移gydF4y2Ba我gydF4y2Ba(≥8)，与参考蛋白质组相比。与与RNA生物学相关的蛋白质相比，具有未知RNA生物学的蛋白质存在轻微的疏水性偏倚，然而，具有未知RNA生物学的drRBP的密度峰值增强可归因于该数据集中蛋白质的数量要少得多(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).总的来说，在p上观察到的一致趋势gydF4y2Ba我gydF4y2Ba与已知RNA生物学的蛋白质相比，未知RNA生物学的蛋白质上的氨基酸数量和疏水性分布可能表明这组新蛋白质的RNA相互作用具有其他特性。如果我们考虑drRBPome和输入参考中的整体aa频率作为分析的基础，我们注意到具有极性侧链的aa残基更受青睐，因为它们对赖氨酸等RNA具有高亲和力，这明显(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)富集。此外，甘氨酸与鸟嘌呤相互作用强烈[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，也显著富集，而具有脂肪侧链的aa，如苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)，通常代表性不足(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

不同物种间drrbp的保护gydF4y2Ba

许多已鉴定的drrbp(85%， 127个蛋白)在其他植物中有同源物(特别是在植物中)gydF4y2BaBrachypodium distachyongydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表S5)和70%(101个蛋白)在人、小鼠、果蝇、gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba和酵母暗示了古老起源的rbp依赖性反应。领域架构的比较分析揭示了不同物种之间领域副本的相似性和损失或获得。例如，拟南芥冷休克结构域蛋白3 (AtCSD3)在几乎所有被检测的生物中都有同源物(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表5)。AtCSD3是最长的同源基因，与小鼠相似，有7个ZF-CCHC型结构域。CSD3含有富含甘氨酸的区域和至少4个zf - cchc型结构域(图3)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae).重要的是，除了ZF-CCHC之外，CSD结构域也存在，并且似乎是植物所特有的，并且可能已经进化到优化在干旱条件下的生存，而干旱条件也可能是由冷冻引起的[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

含有五肽重复(PPR)的蛋白(At3g13150)在植物和果蝇中显示出比在动物中更高的PPR重复拷贝数(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf). PPR蛋白是一类新兴的rbp，具有35-aa基序，串联重复多达30次，被认为是RNA加工的分子接头[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。rna结合选择性是由二聚体赋予的，其中AsnAsp (ND)与尿嘧啶、AsnSer (NS)与胞嘧啶、SN与腺嘌呤和ThrAsp (TD)与鸟嘌呤相互作用[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与藻类、原生动物、酵母或动物相比，陆生植物中含有ppr的蛋白质的数量(约450个)更高[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。此外，据报道，PPRs参与植物线粒体和叶绿体的RNA代谢，并可能在应对非生物胁迫中发挥调节作用[qh]gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。研究还表明，由于靶基因的表达中断，PPR蛋白的突变可能导致严重的表型，其中许多是植物生存所必需的(例如拟南芥PPR突变体)gydF4y2Ba高叶绿素荧光(hcfgydF4y2Ba由于碳固定缺陷，在自养条件下幼苗期难以存活[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba])。因此，这些发现与rna结合PPR蛋白在适应陆地环境中的重要功能是一致的。gydF4y2Ba

此外，CSD和PPR是已知的与RNA相互作用的蛋白质，我们研究了在没有已知RNA结合作用的最受调节的蛋白质中结构域的保守性。我们注意到，在多种高度上调的蛋白中，包括吡哆醛依赖性脱羧酶蛋白(AT5G11880)、鸟苷结合蛋白(AT5G46070)、轮状酶cyp1 (AT4G38740)、富含丝氨酸的蛋白(AT5G25280)在内的结构域在物种间高度保守。类似的观察结果也出现在最下调的蛋白中，包括富含亮氨酸的重复蛋白(AT5G22320)、钙结合EF手蛋白(AT2G41100)和染色体结构维持蛋白(AT3G54670)，但act样酪氨酸激酶(也称为丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶8)(AT2G17700，图2)除外。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag).后一种蛋白除了其蛋白磷酸化作用外，还与叶绿体组织有关[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。它含有一个高度保守的激酶结构域，这在所有物种中都是常见的。然而，天冬氨酸激酶、choris酸突变酶和酪氨酸A (ACT)结构域仅存在于植物中，锚蛋白结构域仅存在于果蝇中，SH2和3结构域存在于动物系统中。ACT结构域被认为是一个保守的调节结合折叠，它与一系列受氨基酸浓度调节的代谢酶有关。gydF4y2Ba

总之，本研究描述了干旱胁迫响应期间RBPome发生的系统水平变化。它强调了RBPome的定性和定量变化可能影响代谢过程，特别是碳水化合物代谢。在暴露于压力时，代谢过程的控制和稳定可以提高存活率，这意味着RBPome在转录后机制中发生了重大变化，从而实现了及时应激反应所必需的调节可塑性，从而增强了短期和长期适应。此外，rbp在干旱胁迫下具有重要的生物学功能，因为rbp的变化指示了胁迫反应信号。最后，我们的发现也与rbp在转录后干旱胁迫响应机制中的进化保守作用一致。gydF4y2Ba

细胞培养和处理gydF4y2Ba

来源于根的细胞gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(生态型Columbia-0)在液体培养基中生长，如前所述[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。本研究中使用的细胞培养物来自剑桥大学生物化学系的于晓兰女士。细胞用40% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)聚乙二醇(PEG) 6000，一种脱水诱导剂，用于模拟干旱胁迫或用等体积的介质作为负对照。分别在处理后1 h和4 h收集PEG处理细胞和模拟处理细胞的3个生物重复。每个时间点处理在每个复制中都有一个相应的模拟处理。使用Stericup®过滤装置(Millipore, Billerica, MA)排干培养基，在紫外线交联前立即用1倍磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

脱落酸测定gydF4y2Ba

每个时间点细胞悬浮培养的三个生物重复(0小时、1小时和4小时为对照，1小时和4小时为40% PEG处理的样品)按照制造商的说明进行Phytodetek®ABA免疫测定(Agdia Inc.， Elkhart, Indiana, US)。测定每个对照和处理时间点之间的ABA水平并进行统计评估。gydF4y2Ba

紫外交联和相互作用捕获gydF4y2Ba

如前所述，在体内进行了拟南芥rbp的紫外交联和分离[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，使用一种最初针对海拉细胞优化的改进方法[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。每个时间点的样本被分成两组，一组进行紫外线交联，另一组进行非紫外线交联。在体内用254nm紫外线照射用于交联的样品，用寡聚(dT)珠拉下mrna -蛋白复合物。纯化蛋白采用无标记串联质谱法进行分析。类似于[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，通过执行额外的对照来评估mrna -蛋白交联复合物下拉的质量，根据制造商的建议，用RNase T1/A混合物(thermofisher Scientific)处理样品。为了分离rbp，用RNase A/T1混合物处理mrna -蛋白样品，使它们从捕获的RNA分子中释放出来。按照制造商的建议(见[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

蛋白质消化和质谱分析gydF4y2Ba

蛋白质样品被还原、烷基化、交换缓冲液和消化，如其他地方所述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。将干燥后的多肽用20 μL 5% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)乙腈和0.1% (v/v)甲酸，使用纳米电喷雾电离(thermofisher Scientific, San Jose, CA)结合纳米液相色谱(LC) Dionex Ultimate 3000超高高效液相色谱(UHPLC) (thermofisher Scientific)，使用Q-Exactive™Hybrid quadrupolar - orbitrap™进行分析。质谱参数和运行分析按照[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

质谱数据分析gydF4y2Ba

原始文件使用Proteome Discoverer v2.1 (thermofisher Scientific)与当地MASCOT服务器(Matrix Science, London, UK)互连处理。进行了MASCOT搜索gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba利用拟南芥信息资源(TAIR)建立的数据库;释放10))使用20 ppm的前体质量容忍度，±0.5 Da的片段离子质量容忍度和胰蛋白酶特异性，允许最多两次遗漏裂解，肽电荷为+ 2，+ 3和+ 4。以半胱氨酸残基氨基甲酰修饰为固定修饰，蛋氨酸残基氧化修饰为可变修饰，选择诱饵数据库。通过使用Proteome Discoverer v2.1中的Percolator算法允许MASCOT的“正向”和“诱饵”搜索重新评分，进一步严格应用于肽谱匹配(pms)，从而产生< 1%的鲁棒错误发现率(FDR)。gydF4y2Ba

UV-crosslink浓缩gydF4y2Ba

在uv交联上进行蛋白质富集，如前所述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba使用Microsoft Excel。定量分析在uv交联样品和对照(非uv交联样品)中检测到的蛋白质，以评估uv交联富集。将uv交联样品的归一化强度与对照(非uv交联样品)的归一化强度进行定量比较，并进行对数比较gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-倍变化≥2和gydF4y2BapgydF4y2Ba-值≤0.05计算使用学生t检验修正多重检验使用前面描述的方法[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]用于将蛋白质归类为富集rbp，并考虑进行进一步分析。gydF4y2Ba

干旱胁迫响应rb -蛋白质组(drRBPome)分析gydF4y2Ba

在对数据进行归一化和uv交联富集分析后，使用uv交联富集的蛋白质和仅在uv交联样品中鉴定的蛋白质进行定量分析。仅在至少两个生物重复中检测到的蛋白质被包括在内。在本分析中，在1小时时间点收集的样本，即1小时PEG处理的样本和模拟处理的对照进行相互比较，在4小时时间点收集的样本也进行类似的比较。带圆木的蛋白质gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-倍变化≥1.5gydF4y2BapgydF4y2Ba-值≤0.05校正多重检验方法在其他地方详细说明(Benjamini和Hochberg [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba])代表显著响应蛋白，并被归类为显著调控的干旱胁迫响应rbp (drrbp)。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

rbp分类与基因本体分析gydF4y2Ba

在本研究中使用pfam (gydF4y2Bahttp://pfam.xfam.orggydF4y2Ba;2017年2月)。rbp和候选rbp被分类，如前所述[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。此外，为了使数据更清晰，我们外推了三个类别，如先前报道的[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。第一类包含所有已报道或显示在RNA相关过程中起作用的蛋白质(与RNA生物学相关)，第二类包括所有检测到的核糖体蛋白质，第三类包含剩余的未知rbd或已知与RNA相关的蛋白质。基因本体(GO)富集使用AGRIGOgydF4y2Bahttp://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/gydF4y2Ba)，并利用KEGG作图器(gydF4y2Bahttp://www.kegg.jp/kegg/tool/annotate_sequence.htmlgydF4y2Ba;2017年2月)，它注释了BlastKOALA的序列。BlastKOALA是KEGG的内部注释工具，它通过使用SSEARCH计算对非冗余的KEGG基因集进行BLAST搜索，为KEGG分配KEGG同源数[qh]gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。选定的上调和下调蛋白的共表达功能和数据相关性分析使用ATTED数据库(gydF4y2Bahttp://atted.jpgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

生物物理特征和层序地形分析gydF4y2Ba

生物物理特性分析，包括蛋白质长度(氨基酸数目)、等电点(pgydF4y2Ba我gydF4y2Ba)和疏水性用R(版本3.3.1)计算。利用基于web的组成分析器程序(gydF4y2Bahttp://www.cprofiler.org/gydF4y2Ba)使用默认设置和按疏水性排序氨基酸(Kyte-Doolittle)，并使用Bonferroni校正进一步评估显著性水平[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。氨基酸的长度和序列从TAIR (gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/tools/bulk/sequences/index.jspgydF4y2Ba), pgydF4y2Ba我gydF4y2Ba由TAIR (gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/tools/bulk/protein/index.jspgydF4y2Ba)和疏水性值用卤汁计算器(gydF4y2Bahttp://www.gravy-calculator.degydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

drrbp的进化保护gydF4y2Ba

为了了解drrbp的保护和潜在的作用，InParanoid version 8 (gydF4y2Bahttp://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgigydF4y2Ba, (gydF4y2Ba55gydF4y2Ba])来鉴定它们在拟南芥中的预测同源物gydF4y2Ba，gydF4y2Ba选定的dicot (gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba，gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Ba)、单子房(gydF4y2BaBrachypodium distachyongydF4y2Ba，gydF4y2Ba大麦芽gydF4y2Ba，gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba，gydF4y2Ba高粱二色的gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba酿酒cerevisaegydF4y2Ba，gydF4y2Ba黑腹果蝇gydF4y2Ba，gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，gydF4y2Ba亩骶gydF4y2Ba和gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba。在这里，双向预测是可能的，数据在Excel中编译。InParanoid程序通过使用基于两个物种之间全基因组两两序列相似性匹配的聚类规则，生成包括得分低于0.05的所有同源类群[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

aa:gydF4y2Ba

氨基酸gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

华:gydF4y2Ba

顺乌头酸酶gydF4y2Ba

ALDH:gydF4y2Ba

醛脱氢酶gydF4y2Ba

AtCSD3:gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba含冷休克结构域蛋白3gydF4y2Ba

爆炸:gydF4y2Ba

基本的局部对齐搜索工具gydF4y2Ba

CBP80:gydF4y2Ba

帽结合蛋白80或ABA过敏1gydF4y2Ba

D或Asp:gydF4y2Ba

天冬氨酸盐gydF4y2Ba

drRB:gydF4y2Ba

干旱胁迫响应rna结合蛋白gydF4y2Ba

drRPPome:gydF4y2Ba

干旱胁迫响应rna结合蛋白组gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

菲:gydF4y2Ba

铁gydF4y2Ba

GAPC2:gydF4y2Ba

甘油醛3-磷酸脱氢酶C-2gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

GR-RBP8:gydF4y2Ba

富含甘氨酸的rna结合蛋白gydF4y2Ba

人力资源:gydF4y2Ba

小时gydF4y2Ba

IRP1:gydF4y2Ba

铁调节蛋白1gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书gydF4y2Ba

LC:gydF4y2Ba

液相色谱法gydF4y2Ba

LSm:gydF4y2Ba

和史密斯gydF4y2Ba

/ M女士:gydF4y2Ba

串联质谱法gydF4y2Ba

N或Asn:gydF4y2Ba

天冬酰胺gydF4y2Ba

NTF2:gydF4y2Ba

核输运因子2gydF4y2Ba

PDHA:gydF4y2Ba

丙酮酸脱氢酶E1组分α-亚基gydF4y2Ba

挂钩:gydF4y2Ba

聚乙二醇gydF4y2Ba

pgydF4y2Ba我gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

等电点gydF4y2Ba

PPR:gydF4y2Ba

Pentatricopeptide重复gydF4y2Ba

psm:gydF4y2Ba

肽谱匹配gydF4y2Ba

RBD:gydF4y2Ba

rna结合域gydF4y2Ba

RBP:gydF4y2Ba

rna结合蛋白gydF4y2Ba

RRM:gydF4y2Ba

RNA识别基序gydF4y2Ba

S或Ser:gydF4y2Ba

丝氨酸gydF4y2Ba

史:gydF4y2Ba

硫gydF4y2Ba

T或Thr:gydF4y2Ba

色氨酸gydF4y2Ba

TAIR:gydF4y2Ba

拟南芥信息资源gydF4y2Ba

UHPLC:gydF4y2Ba

超高效液相色谱法gydF4y2Ba

紫外线:gydF4y2Ba

紫外线gydF4y2Ba

vgydF4y2Ba/ v:gydF4y2Ba

体积/体积gydF4y2Ba

ZF:gydF4y2Ba

锌指gydF4y2Ba

作者要感谢剑桥大学蛋白质组学中心的Marco Chiapello博士和Mike Deery博士在质谱分析和数据分析方面提供的帮助，以及生物化学系的Xiaolan Yu女士提供的拟南芥细胞悬浮培养。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由阿卜杜拉国王科技大学竞争性研究资助计划办公室资助，批准号为CRG3-62140383。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 剑桥大学蛋白质组学中心、剑桥系统生物学中心和生物化学系，英国剑桥网球场路CB2 1GAgydF4y2Ba

   克劳迪斯·马龙德泽和凯瑟琳·s·利利gydF4y2Ba

2. 阿卜杜拉国王科技大学生物与环境科学与工程系，沙特阿拉伯图瓦尔23955-6900gydF4y2Ba

   克劳迪斯·马龙德泽，路德·托马斯和克里斯·格林gydF4y2Ba

3. 佩鲁贾大学化学，生物与生物技术系，意大利佩鲁贾，06121gydF4y2Ba

   克里斯•格林gydF4y2Ba

4. 现地址:法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学纤维素与vcv生理实验室，CEA/DRF/BIG, INRA UMR1417, CNRS umr5168,38054，格勒诺布尔Cedex 9gydF4y2Ba

   克劳迪斯MarondedzegydF4y2Ba

5. 现居住地:HM。条款，路易·赛朗街，26802，门- l -瓦朗斯，法国gydF4y2Ba

   Ludivine托马斯gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CM、CG、KL和LT设计了研究;CM进行了所有的实验和数据分析。KL和LT为CM提供技术支持。CM和CG起草了手稿。所有作者都参与了稿件的修改，并通过了定稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba克劳迪斯MarondedzegydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供到知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了修改。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba