异源多倍体的早期后果改变花的进化烟草（茄科）

背景

多倍体在被子植物的进化中起着重要的作用。以前的研究已经比较了多倍体表型与其现有的祖先，但没有在异源多倍体起源的预测祖先表型的背景下。此外，还没有研究多倍体和二倍体进化趋势的差异。我们利用祖先的特征状态重建来估计异源多倍体起源的祖先表型，以确定多倍体进化导致现有物种形态的模式。我们还比较了二倍体和异源多倍体进化的趋势，以确定多倍体是否改变了花的进化模式。

结果

预测从多倍体形成时的二倍体表型重建的祖先表型从多倍体形成时产生不同的表型预测，而不是当使用外延二倍体表型时，其结果可以改变多倍体演化的结论;然而，大多数分析产生相同的结果。使用二倍体的祖先重建的二倍体花卉表型表明，幼年多倍体演化较短，较宽的花冠管，但较旧的多倍体和二倍体不会显示任何可检测的进化趋势。检查的特征的可怜（花状，花冠长度和花冠宽度）不同于年轻和旧多倍体和二倍体的不同。在较旧的多倍体和二倍体中，花冠长度更具发展无化的不稳定。多倍体不根据形态和颜色特征展示独特的花卉人物套房，但有些人物套房可能会在一起，似乎在内部多次出现烟草，可能是由于传粉者的影响。

结论

年轻多倍体在花的进化上表现出不同的趋势(更短，更宽的花冠管，这可能导致更广泛的授粉)，这表明分化模式受到异源多倍体的早期后果的影响。可能源于基因组休克和/或随后与二倍化相关的基因组稳定。花的形态和颜色的趋同进化烟草可以符合Collinator偏好，表明粉丝器可能具有成形的花卉演进烟草．

多倍体或全基因组复制是被子植物中普遍存在的现象。所有被子植物在进化史上至少有一次全基因组复制[1]，〜15％的心血管患者的物种事件，蕨类植物中〜31％涉及多倍体[2]现有维管植物中有24%是新多倍体[3.］.多倍体可能增加对新环境的适应性[4.]，但新建立的多倍体稀少，因此处于不利地位，因为它们更有可能从二倍体获得花粉，而二倍体可能由于倍性差异而不兼容[5.，或可能自交，导致近交衰退。许多作物品种，如小麦、油菜、咖啡和棉花，都是异源多倍体，包括全基因组复制和种间杂交[6.］.

在一个异源多倍体细胞核中合并两个不同的基因组可能导致“基因组休克”[7.，从而产生基因表达的变化[8.那9.那10.那11.那12.，染色体重排[13.那14.]转座因子活性增加[15.那16.]，生理过程的改变[17.那18.]，改变形态[19.那20，细分市场也会发生变化[21]. 这些过程及其结果可以从它们的二倍体祖细胞中分离出新形成的异源多倍体，并可能促进它们作为一个新物种的建立。与异源多倍体相关的基因组休克可能导致新的性状组合，这可能使它们对进化压力的反应不同于二倍体。在长期的进化实验中，四倍体酵母比单倍体或二倍体酵母更容易适应低碳源培养基[22那23］.四倍体酵母也积累了更多的适应性突变的多样性，这表明四倍体可能具有二倍体和单倍体酵母所缺乏的进化潜力[23]. 然而，在短期生长实验中，在多种环境条件下，二倍体酵母始终比单倍体、三倍体和四倍体酵母具有更高的生长适应性[24］.虽然酵母的生长和被子植物复杂性状的进化可能在不同的规模上，但它们都受到调控网络和生化途径的控制。因此，这些酵母结果表明，四倍体可能在短期内处于适应劣势，但可能在长期内更有适应能力，特别是在严酷和紧张的条件下[22那23那24那25］.多倍体的适应恶劣环境的能力已被提议作为一个假设的持久性和增加重大生态事件发生后多倍体的多样化，如在白垩纪 - 古近系界线[大灭绝事件25那26那27］.

被子植物以前的研究已经调查了异源多倍体进化表型相对于植物生物量[19.那28，光合作用能力[29]，非光化学猝灭[18.]，对草食的防御反应[17.，以及花的形态和颜色[20那30那31那32］.这些研究相比，异源多倍体表型的那些二倍体祖细胞，以评估是否异源多倍体显示新特征或特征的组合，但这些研究都没有解决的异源多倍体是否遵循比二倍体不同的进化趋势。此外，这些研究没有考虑到一个事实，即二倍体祖品种也已自异源多倍体的起源进化。因此，在异源多倍体起源时间的祖细胞的表型可能是从那些用于评估异源多倍体表型和演变的现存物种的不同。表型的这种分歧是特别可能是在旧的异源多倍体物种的真实。使用现存的祖先可能，因此，误差引入到我们的异源多倍体是如何演变的诠释。此前，有研究报道了基因组结构的allopolyploidy的短期和长期影响的差异[13.那15.那16.那33那34，但我们对异源多倍体对表型的短期和长期影响所知甚少，而且据我们所知，没有一个利用祖先的特征状态重建来预测多倍体起源时祖先二倍体的表型。在本研究中，我们使用祖先性状状态重建来比较异源多倍体和二倍体的进化响应，并确定使用重建的祖先表型是否修改了我们关于多倍体进化的结论。

烟草由76个物种组成，其中大约一半来自6个独立的异源四倍体事件在不同的时间点(约0.4、0.6、0.7、1.4、4.3和600万年前;表格1；[35］.此外，在实验室中合成的异源多倍体([19.];K.Y. Lim, Queen Mary, University of London)来自同一祖先物种的自然异源多倍体是可用的。烟草已被系统遗传学研究得很好[36那37那38那39那40，并已确定所有异源多倍体种/组的假定亲本。烟草在花的形态和颜色上表现出相当大的多样性[20那31那41，有助于研究异源多倍体对花进化的影响。烟草异源多倍体可以表现出超出其二倍体祖细胞范围的越轨形态，并且被认为进化出了比预期更短、更宽的花冠管，假设新生多倍体具有现有二倍体花朵形态预测的形态[20］.

在这项研究中，我们比较了异源多倍体和二倍体的花进化，以解决以下问题。1)异源多倍体是否具有二倍体中没有的花特征组合?2)异源多倍体的花形态进化趋势是否与二倍体不同?3)在异源多倍体之后的表型进化与在更长的时间尺度上观察到的表型进化有差异吗?4)与现有二倍体的预测值相比，重建的祖先表型是否改变了多倍体进化的解释?

连接的数据集产生了支持良好的树

为了确定异源多倍体和二倍体是否表现出不同的进化趋势，我们重建了祖先的特征状态，这需要一个支持良好的系统发育树来代表物种关系和详细的特征状态。过去的系统发育研究烟草[36那37那38那39]，对物种亲缘关系和杂交起源有强有力的支持，但往往缺乏骨干节点的支持，因为它们是基于单一的DNA标记序列。我们的连接数据集，使用从这些以前的研究中获得的序列和本研究中生成的额外序列(附加文件1:表S1)，生成了一个支持良好的树，> 70%的引导支持来自对所有节点(除了5个节点)的最大似然(ML)分析，> 0.95后验概率来自贝叶斯分析对所有节点(除了4个节点)的后验概率。在这些分析中，脊柱也得到了很好的支撑(图)。1)．

在我们的树中，异源多倍体部分的位置，因此推断出的二倍体祖先，与之前的研究一致[36那37那38］.此外，我们的结果表明二倍体烟草可以分成两个大分支，由1）第Undulatae那Paniculatae那Tomentosae,Trigonophyllae和2)部分Alatae那叶那类佩图,夜蛾. 切片观察姐妹关系Alatae和叶那类佩图和夜蛾,Undulatae和Paniculatae，而Tomentosae是分段的姐妹Undulatae和Paniculatae，及Trigonophyllae是分段的姐妹Undulatae那Paniculatae,Tomentosae．

在烟草碎花变化

植物花形的几何形态计量分析烟草异源多倍体和二倍体基于主成分1和2产生了与先前获得的相似的形态空间[20］.形态空间由两个对角轴组成:圆形到星状的花肢轮廓，和相对较小到相对较大的花管开口(“相对”，因为在这个分析中所有形状都缩放到相同的大小;额外的文件2：图S1）。主成分1（PC1）占数据集中变异的58.84%，PC2占变异的19.41%。在整个花冠大小数据集中，花冠管长度范围为0.84至9.36 厘米和管宽范围为0.14至1.65 cm（附加文件2:图S1)，这是根据每朵花的五张复制照片的测量结果计算出的花的平均值。

二倍体与异源多倍体的花进化

为了确定二倍体形态的进化趋势，我们使用祖先特征状态重建来预测整个二倍体树花形态的重大变化。一些实质性变化的例子包括:分枝上的花轮廓向更星状的转变，导致了最近的共同祖先N白花丹和N长花（图。2)，在枝上转移到一个较长的花冠筒，导致n的抗旱性（图。3.A)，并转移到一个较小的花冠筒宽度上的分枝导致n miersii（图。3.b).花形演变的移位数(22移位;无花果。2）是类似于在管长度的演变看出（23个移位的图。3.A)，而管宽演变中的偏移不太常见(13个偏移;无花果。3.b） 。此外，71%的有移位的分支在不止一个性状上有移位（图。3.C)，表明多种特征的变化往往会同时发生。

我们使用Blomberg's K和Pagel'sλ测试了每个花特征是否显示了系统发育信号，即近缘物种是否具有相似的形态。与性状进化的布朗运动模型（K < 1、表2)，但只有管长度的结果未能拒绝无系统发育信号的零假设。对于Pagel的λ，我们得到了类似的结果；管宽以及PC1和PC2与λ显著不同 = 0（无系统发育信号），但管长度没有（表1）2). 这些结果表明，与其他花性状相比，花管长度的进化受系统发育的制约较小。

为了估计二倍体花形态进化的进程，我们量化了二倍体树中连续的内部节点之间的变化方向和大小，以及现存分类群和它们最近重建的祖先之间的变化。重构内部节点之间的变化如图中箭头所示。4.．我们将这些与各种多单倍数的形态变化的方向和程度进行了比较，如祖先中点（每个祖细胞种类的平均值）和每种所有类多倍数物种/加入的平均值的距离所测量的，按照麦卡锡等的方法al。[20］.然后我们比较了二倍体和异源多倍体的花形态进化趋势(图。5.)．

根据图中的图。5.，二倍体没有显示出任何明显的进化趋势，因为估计的进化进程与花肢形状的起源周围的均匀圆形分布没有显著差异（Moore-Rayleigh，R* = 0.0237,N= 58岁P.< 0.999，经Bonferroni校正后α = 0.05的显著性阈值为0.0036)或管长和管宽(Moore-Rayleigh, R* = 0.365，N= 58岁P. < 0.90; 无花果。5.e, f;表格3.). 同样，当分析完整的多倍体数据集时，异源多倍体中花肢形状进化方向的总体趋势与均匀的圆形分布没有显著差异（Moore Rayleigh，R* = 0.433,N= 20,P.< 0.90)或年轻时(0 - 70万岁(myo);摩尔-瑞利，R* = 1.27，N= 13,P.< 0.01，经Bonferroni校正后，α = 0.05的显著性阈值为0.0036)和年龄较大(1.4-4.3 myo;摩尔-瑞利，R* = 1.202，N= 7,P. < 0.025, significance threshold of α = 0.05 is 0.0036 after Bonferroni correction) allopolyploids are analyzed separately (Fig.5.a、 c；桌子3.). 对于完整的多倍体数据集，花冠长度和宽度的进化模式明显不同于均匀的圆形分布（Moore-Rayleigh，R* = 1.57,N= 20,P.< 0.001;无花果。5.b、d;表格3.)，表明多倍体倾向于进化出更短、更宽的花冠管，正如McCarthy等人的结论[20］.对于年轻的多倍体，进化模式再次向更短和更宽的花冠管倾斜(Moore-Rayleigh, R* = 1.65，N= 13,P. < 0.001); 然而，较老的多倍体与均匀的圆形分布并无显著差异（Moore-Rayleigh，R* = 0.437,N= 7,P. < 0.90; 无花果。5.b、d;表格3.)．这些结果表明多倍体比二倍体沿着更相似的路径分化，特别是在异源多倍体进化的早期。

重建的祖先表型并不改变烟草异源多倍体进化的解释

我们假设，重建和现存祖形态之间的差异将与多倍体年龄（多倍体出身，年龄增加表中找到1)．为了验证这一点，我们测量了现存的和重建的祖先表型之间的距离烟草不同年龄的多倍体在我们的花特征形态空间。大约一半(14个中的8个)的重建表型与现有的对应表型存在差异(图。6.正如预测的那样，随着异源多倍体年龄的增加，现有的和重建的二倍体祖先表型之间的距离增加(图2)。6.c)。

为了确定使用重建表型是否改变了对异源多倍体分化的解释，我们比较了使用重建表型和现有祖先表型分析异源多倍体进化的结果。根据花肢形状和花冠管的长度和宽度数据(图)，60%的病例(10例中6例)现存和重建的祖细胞中点不同。4.a, b, c;额外的文件3.:图S2;额外的文件4.图S3)，这些祖中点的变化导致7个异源多倍体在花肢形状和管长、宽上的异源多倍体分化方向的差异(图S3)， 27%异源多倍体在花肢形状和管长、宽上的差异(图S3)。5.模拟)。例如,n nesophila那n repanda,n stocktonii与现存的祖先中点相比，具有长而宽、短而窄、短而宽的花冠(图2)。4.a, c)。然而，与它们的重建前体细胞中点相比，它们都更长、更窄(图2)。4.b, c)。

基于现存或重组祖细胞表型的Moore-Rayleigh试验结果比较表明，在大多数分析中，重组祖细胞表型不会改变异源多倍体在花进化中的反应。对于花肢形状，当分析完整的多倍体数据集时，使用重建的祖细胞表型的进化方向趋势与均匀的圆形分布没有显著差异（Moore Rayleigh，R* = 0.314,N= 20,P.< 0.90)或年轻时(摩尔-瑞利，R* = 1.19，N= 13,P.< 0.025，经Bonferroni校正后，α = 0.05的显著性阈值为0.0036)和年龄较大(Moore-Rayleigh, R* = 1.28，N= 7,P.< 0.01，经Bonferroni校正后α = 0.05的显著性阈值为0.0036)。5.a、 c；桌子3.)．对于花冠管的长度和宽度，进化模式是倾斜的短和宽的花冠管的年轻多倍体(Moore-Rayleigh, R* = 1.64，N= 13,P. < 0.001），但与较老多倍体的均匀圆形分布没有显著差异（Moore-Rayleigh，R* = 0.234,N= 7, p < 0.90)。5.b、d;表格3.)．相比之下，基于重建的祖表型分析完整的多倍体数据集时，花冠筒长度和宽度的进化与均匀的圆形分布没有显著差异(Moore-Rayleigh, R* = 1.01，N= 20,P. < 0.10), whereas it is skewed towards shorter and wider tubes when extant progenitor phenotypes are used (Fig.5.b、d;表格3.)．

异源多倍体有时表现出二倍体中所没有的花的特征

为了确定异源多倍体是否具有二倍体中没有的花特征，我们鉴定了花特征的进化变化，并确定这些变化是否代表趋同进化。当仅使用形态学特征时，两者均可N. quadrivalvis加入和四个N塔巴库姆花冠呈星状，花管开口较宽，花管长度中等(平均2.90 ~ 4.67 cm)，花管宽度较大(平均0.67 ~ 0.94 cm);额外的文件5.:图S4)。这两个N. quadrivalvis副本也包括在这个聚合机制中，但它只包括母体的副本N塔巴库姆登记入册;父亲的副本N塔巴库姆与其父系祖先和相关二倍体聚在一起。由于每个异源多倍体拷贝由于贡献每个拷贝的祖先的不同进化历史而具有不同的系统发育背景，因此即使两个拷贝进入了相同的形态，表面程序也可以将两个拷贝置于不同的制度下。然而，这些结果表明N. quadrivalvis和N塔巴库姆异源多倍体具有一套不同于在烟草二倍体。此外，相关的异源多倍体的两个拷贝n nesophila那n repanda,n stocktonii花冠筒长(平均为4.28-5.10 cm)，窄(平均为0.31-0.42 cm)5.:图S4)。虽然这并不奇怪，因为每个物种的两个副本都输入了相同的形态，但根据形态学数据，这表明这些异源多倍体物种显示出一套与任何二倍体物种不共享的花特征。其他异源多倍体与它们的母系祖先、父系祖先或两者一起分组(附加文件)5.:图S4)。

在只考虑颜色性状和同时考虑形态性状和颜色性状的分析中，所有异源多倍体都与它们的母本、父本或两个祖先分组(图。7.；额外的文件6.:图S5)。然而，这些分析表明，一些收敛的制度存在烟草．应当指出的是，花颜色PCA用其标准化为曲线下的相同区域，以组谱与相同形状的光谱进行的，并因此最有可能的类似的颜料，而不是着眼于亮度或颜料的浓度．因此，收敛机制可以包括具有变化的花的颜色饱和度，即一些光的花和一些暗花卉物种，但应该反映在花色调的差异。在花色仅分析，鉴定对应的四个会聚制度于绿色，品红色/紫色 - ，粉红 - ，和紫外线反射白色花物种（附加文件6.：图S5），表明这些花色在植物中多次出现烟草．

在形态和颜色分析中，收敛机制与单纯颜色分析得到的收敛机制相似，但有一些差异，说明相同颜色的花具有相似的形态。“绿色”制度还包括n knightiana与花枝宽度相比，开绿色花的物种群有一个相对较大的开口的圆形，中等宽度（平均为0.38-0.65） 厘米）和一些长度变化（平均值为1.64–4.24 厘米无花果。7.)．“紫外线反射白色”不再包括在内n nudicaulis，但确实包括N.茜草，以具有高紫外线与视觉光谱比率的花卉品种(N.茜草一般为紫色，而非反射紫外线的白色)，大部分为圆形花型，中等长度(平均1.89-2.20厘米，除n pauciflora: 5.51厘米)，中等宽度(平均0.35-0.60厘米;无花果。7.)．“粉红色”的物种组成与仅使用花颜色数据恢复的物种相同，包括粉红色、品红或(对人类来说)红色的花，具有星状形状，与花的枝干宽度、宽管(平均0.81-1.33厘米)相比，管口相对较大，管长有一定的变化(平均为2.36 ~ 4.56 cm;无花果。7.)．第四种会聚形态，“白色，星状”形态，在纯色分析中没有发现，它包含有白色星状花，与花翼宽度相比，管开口相对较小，花冠管长(平均3.21-8.09厘米;无花果。7.)．几个趋同政权的存在烟草表明，花卉人物套房可能会在一起，也许是由于粉丝器的影响。除了收敛方案之外，表面分析检测到与收敛演化无关的花卉特征的换档。这些独特的偏移和收敛方案往往对应于使用祖先重建分析鉴定的至少两个特征的换档（图。3.c和7.)．

异源多倍体的花冠长度进化不如二倍体不稳定，可能在物种形成中起作用

年轻多倍体、老多倍体和二倍体在不同花特性的相对不稳定性方面存在明显的进化差异。在多倍体中，我们测量的不稳定性是不太可能与预期的表型重叠，由祖先的平均值表示(我们的零假设)。与预期表型交叠率较低的多倍体组被认为更不稳定。在二倍体中，我们通过测试一个性状是否显示系统发育信号来衡量其不稳定性;没有系统发育信号的性状比有系统发育信号的性状更不稳定。因为测试系统发育信号需要系统发育树的输入，我们不能使用这个度量来分析多倍体。虽然我们不能使用相同的度量标准来测量多倍体和二倍体的不稳定性，但我们可以对三种花的不稳定性(最不稳定性到最不稳定性)进行排名，并在年轻多倍体、老多倍体、和二倍体来确定相同或不同的性状在三组中相对更不稳定。

我们之前的分析表明，花冠管长度可能比花肢形状或管宽度更低烟草多倍体植株(20，与预期表型重叠较少。然而，当我们分离年轻的多倍体和年老的多倍体，并重新检查这些数据时，我们看到了不同的模式。在年轻的多倍体中，我们观察到管长与预期表型的重叠大于花肢形状，而管宽的重叠最少[20]. 因此，在年轻多倍体中，试管宽度是最不稳定的性状，其次是花肢形状，试管长度是最不稳定的性状。相比之下，较老的多倍体在花肢形状上最不稳定，其次是花管长度，花管宽度最不稳定[20］.在二倍体中，花冠管长度最不稳定(无系统发育信号)，而花冠管宽度和花肢形状不稳定(显著的系统发育信号;表格2)．因此，花的特性在不同的群体中不稳定性不同，这表明它们可能在不同的进化压力下。

花冠筒长度相对不稳定性的差异可能与授粉有关。花冠管的长度是花与传粉者配合的重要因素[42那43那44]因此，花冠管或花蜜距长度的变化可能有助于物种间的生殖隔离[45那46那47］.与这一假设一致的是，在我们的二倍体树的11对姐妹物种中，有6对在花冠管长度上表现出相反的变化:一个朝向较长的管，另一个朝向较短的管(图。3.这12个班次占观察到的花冠筒长度班次的一半以上。这些结果，以及花冠管长度进化不受系统发育限制的证据，表明花冠管长度的变化可能在物种分化中发挥作用，可能是通过传粉者介导的选择。传粉者的关系只被阐明了一个子集烟草物种;然而，有几对姊妹种在管长上表现出变化，属于节Alatae，研究得最好的部分烟草在授粉的条款。这三对姐妹物种不仅显示在他们的主要传粉在管长度的变化，也移位。妹妹物种之间n alata和n mutabilis, longer-tubedn alata由天蛾授粉[48], shorter-tubedn mutabilis是由蜂鸟授粉的[49];HawkMoth介导的选择已被证明可以驱动较长的花香管的演变[45］.缩短管道n bonariensis拜访的小蛾的舌头长度类似于它的花冠管，而它的姐妹物种，长管n forgetiana，主要由蜂鸟授粉[50］.Longer-tubedN长花由天蛾授粉，但它的短管装的妹妹种，N白花丹，是自花传粉[50，这与异交物种更有可能受到传粉者持续的选择压力的观点一致[50那51]，从而保持较长的花冠筒。这些结果表明，花冠筒长度的变化可能与种间对不同传粉者类型的专业化相关，表明传粉者可能影响花冠筒长度的演变烟草这反过来可能在物种分歧中发挥作用。

类似地，具有相同起源的古老异源多倍体物种也表现出花冠筒长度的差异[20];无花果。1)．在节Polydicliae(约140万年;[35]，N克利夫兰有短花冠筒，而N. quadrivalvis要长得多（附加文件）4.:图S3)。节Repandae(约430万年;[35]，n nudicaulis有一个短花冠筒，但其姊妹枝组成n repanda那n nesophila,n stocktonii有更长的管子(图。4.)．花冠管分化在老年性多倍体中的流行程度与二倍体中所见的分化程度一致烟草种区分老多倍体和二倍体与年轻多倍体的一个方面是它们经历了物种多样性。我们目前的系统发育结果支持来自每个二倍体祖细胞对的单个多倍体事件；较老的多倍体分类群在这些单一多倍体事件发生后已形成物种，并由包括两个或更多物种的部分组成，而年轻的多倍体没有经历额外的物种形成，每个事件仅由一个物种组成。管长度的差异可能伴随或促进物种形成，可能是通过对不同传粉者类型的专门化。

重建的祖细胞表型不会改变异源多倍体进化的解释

一些研究利用染色体数目的祖先状态重建来推断多倍体事件[52那53那54那55]. 然而，我们不知道有任何研究在异源多倍体起源点重建了祖细胞表型，特别是为了检验重建的与现存的祖细胞表型的使用是否改变了异源多倍体形态进化的解释。由于现存的二倍体表型可能与异源多倍体起源时的祖细胞表型存在实质性差异，因此使用现存的二倍体分析异源多倍体进化趋势可能导致不准确的解释。在这里，我们表明二倍体祖细胞在异源多倍体起源点的重建祖先状态与现存形态大约有一半的时间不同，并且几乎总是对较老的异源多倍体不同，这是随着分化时间的增加而预期的（图。6.)．这些祖细胞表型的差异也会导致祖细胞中点的差异，而中点预测了异源多倍体的起源形态。根据我们的性状数据，60%的病例中，基于现有祖细胞表型和重构祖细胞表型的祖细胞中点存在差异(图)。4.c;额外的文件3.:图S2;额外的文件4.:图S3)。

然而，在这里进行的大多数异源多倍体进化分析中，无论使用重建或现有的祖先表型，结论都是相同的。例外的是，当使用重建的祖先表型时，所有多倍体的花冠管长度和宽度的进化方向没有趋势，而当使用现有的祖先表型时，花冠管长度和宽度的进化方向则相反(图)。5.b, d).由于年轻多倍体和年老多倍体的结果在不同分析之间是一致的，所有多倍体在不同分析之间的反应差异表明，多倍体的直接和短期后果导致了更短和更宽的管的进化，而不是多倍体和二倍体本身的差异。

烟草的趋同进化

我们的研究结果表明：烟草当同时考虑形态和颜色特征时，异源多倍体不具有不同于二倍体的花特征组合，很少表现出不同的形态特征组合。然而，我们的分析恢复了收敛的“政权”，似乎已经在内部独立演化了多次烟草．根据花的形态和颜色，确定了四种会聚机制(图。7.). “绿色”区域和“白色、星状”区域的花特征在很大程度上对应于传统上公认的授粉综合征[56那57］.“白色，星状”体制包括二倍体n alata那N白花丹,N长花，其特征是白色的花具有长，狭窄的花冠筒和星状的花翼轮廓(图。7.），在夜间开放[41])。这些特征的结合与天蛾授粉有关[45那58那59),n alata和N长花主要由天蛾授粉[50］.烟草plumbaginifolia这主要是自恋[50］.'绿色'制度包括n .黄花(异源四倍体),N. benavidesii那n raimondii就那n solanifolia那N金扭扣那n knightiana,N. langsdorffii(二倍体)．这些物种的特征是花与中等花冠宽度，一个圆形的花翼轮廓，一个缩小的花翼与花管开口相比，这是经常在花期反折(图。7.)，通常是丰富的花蜜(个人观察)，这与蜂鸟授粉综合症一致，尽管这些花是绿色的，而不是传统的红色。事实上，蜂鸟是主要的传粉者N. langsdorffii[50),N金扭扣[60)，并被观察到访问n raimondii就(S. Knapp，个人观察);然而，关于其他物种传粉者的信息是无法获得的。同样，我们对另外两个趋同的授粉系统，即“高紫外线”和“粉色”的传粉者所知甚少。然而，有一种“粉色”物种，n otophora，由蝙蝠传粉[61］.宽管和丰富的花蜜在这种情况下发现与蝙蝠授粉综合症一致，但粉红色，品红和红色的花朵颜色通常与蝙蝠授粉无关。在“高紫外线”模式下，花朵呈圆形轮廓，与人类可见范围相比，其紫外线反射率较高。这种高紫外线反射率表明，这种情况可能与具有紫外线受体的传粉者有关，但这些物种的传粉者是未知的。然而，这些物种中的大多数，除了N.茜草UV-white;因此，它们可能对蜜蜂没有吸引力，因为蜜蜂很难从背景材料中分辨出紫外线白色物体[62]. 此外，蜜蜂喜欢高度解剖的花轮廓而不是圆形的花轮廓[63，这表明这些花可能不太可能由蜜蜂授粉。

我们的结果表明，从异源多倍体起源的角度使用重建的祖先表型可能会改变对异源多倍体进化进程的解释，特别是在较老的异源多倍体中。我们还发现，年轻的异源多倍体比年老的异源多倍体或二倍体表现出不同的花进化趋势，表明异源多倍体的早期结果可以改变花进化，至少在植物中烟草异源多倍体。这些年轻的异源多倍体有更短，更宽的花冠管，这表明形态变化更通才授粉可能伴随着异源多倍体。在年轻的异源多倍体、年老的异源多倍体和二倍体中观察到的特定花特征的进化稳定性也不同。花冠筒长度的进化在二倍体和较老的异源多倍体中比在年轻的异源多倍体中更不稳定，似乎与物种的分化和有时初级传粉者类型的差异有关。趋同机制的存在，其中一些类似于传统的授粉综合征，表明选择，可能是传粉者介导的，可能参与形成花的进化烟草．这些结果表明，授粉可能同时影响了异源多倍体和二倍体的进化烟草，但尚需进一步研究，以确定观察到的花表型分化是否会影响自然界中传粉者的偏好和效率。

植物材料及生长条件

对于这些分析，我们结合了McCarthy等人的数据集[20我们在美国加州大学河滨分校(UCR)获得了额外的花卉测量数据，以生成一个扩展的形态数据集，增加了整个属的采样，包括二倍体和异源四倍体物种，以及由同一祖先物种与自然异源四倍体杂交产生的合成异源四倍体。尽管这些合成的异源多倍体提供了一个极好的机会来比较异源多倍体的直接后果和随后的异源多倍体进化的影响，但重要的是要注意，用于创造这些合成的异源多倍体的二倍体个体可能在遗传上存在差异，因此可能在表型上存在差异，来自自然异源多倍体的实际祖先，由于种内遗传变异和自自然异源多倍体起源以来祖先物种的持续进化。植物在20°C的温室中生长，暴露在自然光下，并通过滴灌系统用液体肥料浇灌。对于一些物种，我们使用了来自多个来源的植物材料;我们的分析中包括的物种和资源的清单可以在附加文件中找到7.S2:表。TW和TH的加入来自美国烟草种质收集。9位数**4750***的参赛作品来自荷兰奈梅根的拉德布大学鲍德温的加入来自鲍德温实验室（马克斯·普朗克研究所，德国耶拿）。CAM参赛作品来自英国剑桥大学植物园。CPG参赛作品来自英国切尔西物理花园。095-55的加入来自德国的IPK Gatersleben。烟草“rastroensis”材料从史密斯实验室（科罗拉多大学博尔德，科罗拉多州博尔德USA），凭证传来：Holtsford，s.n。代表一个未被描述的物种。517**玻利维亚政府向纽约植物园的Michael Nee博士颁发了2000年的许可证，在玻利维亚收集了材料。Michael Nee博士和Sandra Knapp博士鉴定了标本，并将代金券标本存放在伦敦自然历史博物馆的标本室，目录号BM000940731、BM000940688和BM000940685。烟草“Chulumani”于1950年由Winifred Mary Adelaide Brooke收集；凭证样本存放在伦敦自然历史博物馆，目录号BM001070053，由桑德拉·纳普博士鉴定。第一代和第二代合成橡胶n .黄花(年代_0.和S₁均来自同一合成系;因此，为了进行分析，我们平均了它们的形态数据。我们同样平均了n stocktoniiTW126和974750101，因为这些材料来自同一野外采集；美国农业部（TW126）将收集的种子材料发送给奈梅根（974750101）。

DNA提取、PCR和测序

一个支持良好的系统发育树为祖先特征状态重建提供了最准确的结果;因此，我们进行了系统发育分析烟草使用已发布序列数据的串联数据集来提高分辨率和对深祖先节点的支持(详细信息将在下一节中介绍)，以及增加分类采样。根据以前的分析获得的GenBank序列[36那37那38那39那64]，我们研究物种的两个异源多倍体起源节点在现有的异源多倍体序列数据下无法很好地解决。为了提高分辨率和支持这些节点，我们生成了来自三个异源四倍体物种的两个位点的额外序列数据，N. quadrivalvis904750042,n nudicaulis964750114,n repandaTW110，其中只有二倍体物种的序列可用。我们使用Qiagen DNeasy Plant迷你试剂盒（德国希尔登Qiagen）提取基因组DNA并进行扩增球形棕囊藻（如果留意; 第3-6外显子）和蜡状（5.th–9th exon) using 10 pmol primer (primer sequences from Kelly et al. ([39];表格4.)和EconoTaq (Lucigen)在以下条件下进行:94°C初始变性3 min，然后94°C 1 min, 52°C (如果留意)或48°C (蜡状)退火温度1分钟，72°C延伸1 (如果留意)或2 (蜡状)分钟，然后在72°C下延长最后7分钟。我们按照制造商的协议使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)清洗PCR产品。为了从这些异源多倍体物种的两个祖先拷贝中获得序列，我们使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)克隆了PCR产物，使用M13引物筛选和PCR筛选白色菌群，使用Qiaprep Miniprep Spin Kit (Qiagen, Hilden, Germany)进行质粒制备。我们对克隆进行了测序，并将得到的序列添加到现有序列中进行系统发育重建。

从连接数据集重建系统发育

对于系统发育重建，我们使用了上述新生成的序列，并下载了所有可用的序列烟草GenBank中以下基因座的序列：核基因乙醇脱氢酶（抗利尿激素）， glo，谷氨酰胺合成酶（GS）那它的，多叶/花茎（LFY/FLO），MADS1 / FRUITFULL（MADS1 /富尔语）那和蜡状，质体基因和内含子/间隔子TRNL-F.那trnS-G那马特克那ndhF那trnH序列-R那rpoC1那trnK那accD,大亚基．所有序列的GenBank登录号可在附加文件中找到1S1:表。

从以往研究的比对开始，我们根据需要使用Geneious (Biomatters)手动对所有位点进行独立比对，并使用SequenceMatrix将这些比对连接起来[65]. 总分类群抽样包括目前在世界范围内确认的76个物种中的41个烟草[66那67]: 32种二倍体和9种异源多倍体。最古老的异源多倍体切片，切片芳香的，没有包括在我们的分析中，因为它的起源不像年轻的异源多倍体部分那么直接[40］.此外，我们没有包括同倍(二倍体)杂交种。与异源多倍体不同，同倍杂交种不保持固定的杂合度;相反，它们倾向于每个基因只保留一个祖先副本。然而，保留的祖先序列会因基因而异，导致同倍体杂交物种在单位点树中的位置不一致。基因树之间的这种冲突可能会导致支持度差和由连接的矩阵导致的树中分类单元的假位置。因此，我们排除了文献记载的同倍杂交种，N. glauca, N. glutinosa, N. linearis，和n spegazzinii[38那39，从我们的分析，以及N. acaulis由于之前观察到其安置在单一轨迹树中的不一致[36那37那38那39］.对于异源多倍体类群，我们在数据矩阵中包含了每个基因的母本和父本副本，并通过在物种名称中添加数量(母本1个，父本2个)来区分它们。平均基因覆盖率为73.7%GS有最高的覆盖率(89.6%)和MADS1 /富尔语覆盖率最低(60.3%;表格5.). 串联数据矩阵由919706个细胞组成，其中490886个细胞具有核苷酸数据（53.4%的核苷酸覆盖率）。虽然我们没有所有物种的完整数据，但我们使用的超矩阵方法已经证明，即使有大量缺失数据，也能产生准确的拓扑结构[68那69那70那71]. 我们在Dryad中存放了每个轨迹和连接数据集的对齐文件(https://doi.org/10.5061/dryad.f374gf0)．

我们使用最大似然法（ML；Garli版本2.01[72]和贝叶斯推理(MrBayes，版本3.2.5;[73]，而我们只使用ML分析个体位点Anthocercis Cyphanathera,和Symonanthus根据之前对茄科的分析，将其视为外群[36那37那74那75］.由于在物种水平上缺少外群数据，我们通过连接来自多个物种的序列来创建属水平外群Anthocercis Cyphanathera,和Symonanthus．

我们选择使用Garli进行ML分析，因为与RAxML相比，它允许在分子进化模型中有更多的选择[76]. 我们分析了jModelTest版本2.1.2中的每个基因座[77];表格5.)，并使用赤池信息准则(AIC)估计选择适当的模型[78］.对于ML分析，我们为每个位点完成了20次独立的运行(附加文件8.:图S6)和连接的完整数据集，使用佛罗里达大学高性能计算集群上的Garli单线程实例，并为分析中的每个分区提供适当的演化模型。我们将每个ML搜索设置为终止，如果在10,000代之后树的似然值没有改进。此外，我们对每个个体基因、质体纯数据集和完整数据集进行了1000个重复的ML bootstrap分析。我们使用合适的进化模型对连接的数据集进行MrBayes运行，该数据集包含500万代的两次独立运行，每1000代采样4条链，直到分裂偏差小于0.004。在具有后验概率的共识树生成之前，对25%的烧伤后部位进行了去除。

植物的特性测量

对于本研究中包括的所有物种，我们拍摄了花朵并分析了结果图像，如McCarthy等人所述[20]. 简单地说，我们拍摄了五张正面照片（描绘花冠的裂片和展开部分的花肢）并进行了解剖（沿花管在中脉处切割并用别针固定开），每朵花、每株植物五朵花和每种植物五朵花（如有）。对于花肢形状的几何形态计量分析，我们为照片指定了15个标志点[20]并使用了TPS软件[79那80那81]来分析与花大小无关的花的形状。我们测量花冠管长度和宽度从解剖和前视图照片使用ImageJ，版本1.51 k， [82]. 在随后的分析中，我们使用了试管长度和宽度的花朵和物种平均值以及几何形态计量分析产生的PC1（主成分1）和PC2。我们将PC1/PC2作为二维性状进行分析，但管长度和宽度是分开的，因为管长度和宽度没有遗传联系[83那84］.

连续字符祖先状态重建

我们使用anc对PC1、PC2、管长和管宽的连续特征进行了祖先状态重建。ML在phytools包中，版本0.5-38，[85在R版本3.4.2中，[86］.R脚本上传到GitHub (https://github.com/elizabethwmccarthy/Ancestral-reconstruction)．为了分析二倍体的性状进化，我们使用了一棵只有二倍体物种的树。我们在phytools包中使用了control . ml [85]生成管长度和宽度的特征演变热图。因为我们将花的形状作为一个单一的二维特征进行分析，所以使用祖先节点的PC1和PC2坐标从形态空间中提取样条来表示重建的表型。我们通过计算连续节点（例如，由分支连接的内部节点之间或现存分类单元与其最近共同祖先的节点之间）的每个重构特征值之间的差异，确定每个特征（形状、管长度和管宽度）的形态变化。我们认为，只有当这些连续节点的重建值之间的差异大于在现存物种中观察到的该特征范围的10%时，才会发生形态学变化（例如，在现存物种中观察到的管长范围为10厘米，那么当连续节之间的差异大于1厘米时，就会发生形态上的转移)。我们选择这个阈值是因为所有性状的种内变异中位数是总变异范围的10%。

用于估计来自多倍体形成的节点的祖先性状(图中红色圈出)。1），我们使用了包括二倍体和Allopolyploid物种的ML树。然而，我们仅使用二倍体形态来估计祖传人物状态，因为我们希望基于二倍体物种的分叉演化来重建祖先表型。我们绘制了每个数据集（PC1，PC2，管长度和管宽）的重建祖细胞节点以及用于现象祖氏形态的数据，以可视化重建值与观察到的延时形态之间的差异。

二倍体分化分析

为了比较二倍体和异源多倍体之间的形态进化趋势，我们使用仅二倍体树上祖先特征状态重建的值来检查二倍体分化的趋势。基于树的连续节点上重建值之间的差异，可以在整个树上测量二倍体散度。我们通过绘制花特征形态空间中重建节点的值以及现存物种的数据来可视化这些差异的方向。我们用箭头（向量）连接连续的节点（从较老到较新），以便根据系统发育关系重现形态空间中的进化过程。

我们用数学方法将二倍体的形态进化趋势转化为一个图的原点，并以较老的节点为原点。我们使用了一种改进的瑞利测试[87]，由摩尔介绍[88]，它考虑了变化的大小和方向，以确定这些向量是否均匀分布在原点周围。在随后的文本中，我们将该测试命名为“摩尔-瑞利”，并根据摩尔的概率分布确定显著性[88]在Bonferroni校正之后。R脚本被上传到GitHub(https://github.com/elizabethwmccarthy/Ancestral-reconstruction)．

此外，我们利用Blomberg’s K和Pagel’s λ检验个体性状是否显示系统发育信号，以确定花区性状的进化是否遵循系统发育分化的轨迹，或者是否存在更复杂的模式。我们使用phytools包在R中实现了这些分析[85］.R脚本上传到GitHub (https://github.com/elizabethwmccarthy/Ancestral-reconstruction)．

利用现存与重建的祖细胞表型分析异源多倍体分化

为了分析异源多倍体的形态进化，我们遵循了McCarthy等人所描述的方法[20］.简要地说，最简单的零假设是异源多倍体将显示那些及其祖细胞的之间的中间表型。因此，对于每一个异源多倍体加入和花香特质，我们发现平均每个品种祖，然后把平均值两者的估计预期的异源多倍体形态。我们指定此值祖中点。尽管异源多倍体可以显示表型是中间，如一个或另一个亲本，或侵，我们选择使用中间用户由于平均的祖细胞是对于预期异源多倍体表现型的最简单的零假设。这使我们能够始终如一地和无偏计算的方向和异源多倍体进化幅度的估计。相反，这将是不可能的可能的表型的无限数量的一个决定，如果我们使用以下异源多倍体原点的海侵表型为我们的预期，因此，我们将不能够进行分析，我们在座。

我们通过观察异源多倍体与其祖先中点的不同方向来确定其形态进化是否存在趋势。我们用数学方法将所有的中点转换为图表的原点，并相应地绘制出每个异源多倍体与其祖先中点之间的距离的方向和大小。这使得我们可以使用摩尔-瑞利检验来检验异源多倍体的形态进化趋势是否均匀分布在这个空间中[87那88]如上所述。

我们使用现存的和重建的祖先表型进行了上述分析，并比较了每一个结果，以确定我们基于现存和重建的祖先表型对异源多倍体形态进化的解释是否不同。我们测试了整个多倍体的数据集,以及年轻的(合成到070万岁(myo)没有扩展后续异源多倍体起源)及以上(1.4 - -4.3 myo,随后发生了物种形成)异源多倍体分别为每个形态数据集(花卉肢体形状和花冠管长度和宽度)。异源多倍体起源后物种形成的存在或不存在是基于当前的分类学烟草物种(66］.我们比较了二倍体和异源多倍体的Moore-Rayleigh检验结果，以确定异源多倍体的形态进化趋势是否与二倍体的形态进化趋势不同，并采用Bonferroni校正确定显著性。我们还计算了所有性状中现存和重建的祖先表型之间的差异，并将这些值与异源多倍体年龄进行对比，以确定这种差异是否随着时间的推移而增加。本研究的异源多倍体物种的亲缘关系和年龄见表1．

光谱反射率的测量，归一化，和主成分分析（PCA）

我们使用光谱反射率测量来量化花的颜色。这里使用的大多数光谱都是以前发表过的[31那32那89，但我们获得了新的光谱n alata那n bonariensis那N.茜草那n corymbosa那n forgetiana那n kawakamii那N长花,n solanifolia使用带有脉冲氙气光源的JAZ分光光度计(Ocean Optics, Dunedin, Florida, USA)，并使用Spectralon白色标准(Labsphere, North Sutton, New Hampshire, USA)进行标准化。我们平滑光谱三次，滚动平均超过9 nm [31］.为了根据光谱的形状而不是总体强度来比较光谱，我们将光谱归一化到从300到700 nm的曲线下的相同区域。然后，我们使用ade4包，版本1.7.11，在R[中以25 nm增量(300 nm, 325 nm, 350 nm等)对归一化光谱值进行PCA分析。90.]并使用得到的前三个主成分（只有三个> 5%的变异），占数据集中变异的91.73%，在进一步分析中（附加文件9.:图S7)。R脚本上传到GitHub (https://github.com/elizabethwmccarthy/Ancestral-reconstruction)．

收敛演化分析

为了确定多倍体是否显示出新的花性状组合或与二倍体物种具有相同的性状组合，我们使用surface package（版本0.4.1）进行了分析，以测试趋同进化[91.R脚本上传到GitHub (https://github.com/elizabethwmccarthy/Ancestral-reconstruction)．简言之，该包使用来自多个连续性状数据和系统发生树和适用，以便识别在系统发生进化上下文转移稳定围绕多个自适应峰值选择的汉森模型。此外，分析随后确定任何这些变化是否表示使用最大似然和AIC来评估收敛制度是否提高模型的拟合收敛机制。如果两个独立的转变坍塌成一个单一的制度改善了配合，这些变化被认为是收敛的。我们进行了三组分析：仅形态数据，只花的颜色数据（花的形状，管长度和管宽度的几何形态测定分析的前两个主成分）（光谱反射率的PCA的前三个主成分），两者的形态和颜色数据（这些性状的所有七个）。我们使用了二倍体+异源多倍体树木既异源多倍体homeologs为了评价这两个母亲和父亲的表型的情况下的花卉人物套房。我们还增加polytomies树，如果我们有异源多倍体物种的多个国家加入我们花性状的数据集，但包含在树在我们的分析同种异源多倍体的加入之间一体化的改变仅仅一个加入。

抗利尿激素：

乙醇脱氢酶

如果留意：

球形棕囊藻

GS：

谷氨酰胺合成酶

它的：

内部转录间隔区

LFY/FLO：

叶/ FLORICAULA

MADS1 /富尔语：

MADS1 / FRUITFULL

ML:

最大似然

肌：

百万年前

个人电脑：

主成分

主成分分析:

主成分分析

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

加州大学:

加州大学河滨分校

作者感谢Laura J. Kelly的灵感，利用重建的祖先表型分析异源多倍体进化，Laura J. Kelly和James J. Clarkson提供序列比对，Stacey D. Smith联合国“rastroensis”材料和共享使用她的反射分光光度计，茱莉安伍联合国“rastroensis”反射光谱，马塞洛雷吉纳托使用表面封装共享[R脚本，以及加州大学河滨分校的资金。

资金

本研究未获得任何资金。

数据和材料的可用性

在这项研究中生成和分析的数据集可在Dryad（Doi：https://doi.org/10.5061/dryad.f374gf0)．在GitHub中可以找到用于分析的R脚本(https://github.com/elizabethwmccarthy/Ancestral-reconstruction)．花卉照片上载至figshare (https://figshare.com/articles/nicotiana_flower_morphology_photographs/7609988.)．

从属关系

1. 加州大学植物学与植物科学系，滨江，滨江，加利福尼亚州，美国92521

   Elizabeth W. McCarthy，Jacob B. Landis，Amelda Kurti，Amber J. Lawhorn＆Amy Litt

2. 佛罗里达大学生物学系，佛罗里达，盖恩斯维尔，佛罗里达，32611

   雅各布·b·兰迪斯

3. 佛罗里达大学佛罗里达自然历史博物馆，佛罗里达盖恩斯维尔，佛罗里达32611，美国

   雅各布·b·兰迪斯

4. 英国皇家植物园邱园，里士满，萨里，TW9 3DS，英国

   马克·w·蔡斯

5. 科廷大学环境与农业学系，西澳本特利，6102，澳大利亚

   马克·w·蔡斯

6. 英国伦敦自然历史博物馆SW7 5BD

   桑德拉·纳普

7. 伦敦玛丽女王大学生物和化学科学学院，伦敦，E1 4NS，英国

   史蒂文C。康伯和安德鲁R。莱奇

8. 目前地址：美国南部的生物科学系，Suny Cortland，Cortland，NY，13045

   伊丽莎白·w·麦卡锡

贡献

EWM和AL设计了这项研究。EWM、AJL和AK收集并测量了花的性状数据，生成了本研究中新的序列，并生成了数字。JBL进行了系统发育推断。SCLC为摩尔-瑞利测试写了R脚本。EWM进行了所有其他分析。EWM、JBL和AL在SK、MWC、SCLC和ARL的帮助下撰写了手稿。所有作者都已阅读并批准了本手稿。

相应的作者

对应到艾米Litt．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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再版和权限