成绩单的分析揭示在调节果实成熟的中国枣脱落酸的综合作用

背景

枣树(Ziziphus Jujuba.是一种非更年期的果实;然而，这个物种成熟的潜在机制和脱落酸在这个过程中的作用还不清楚。

结果

本研究确定了内源ABA的动态变化与枣树成熟开始时间呈正相关关系。转录分析表明编码基因之间的表达平衡nine-cis-epoxycarotenoid加双氧酶（ZjNCED3），ABA-8的羟化酶（zjcyp707a2.),beta-glucosidase（ZjBG4，ZjBG5，ZjBG8,ZjBG9)在维持ABA积累中起重要作用，而受体(Zjpyl8.），蛋白磷酸酶2摄氏度（ZJPP2C4-8),蔗糖非发酵1相关的蛋白激酶2（ZjSnRK2-2和ZjSnRK2-5)在调节果实对ABA的敏感性方面起重要作用。另外，采收白色成熟‘东早’果实，添加50 mg L处理⁻¹aba或50 mg l⁻¹以去甲双氢愈疮木酸(NDGA)为研究对象，探讨ABA在枣果实成熟中的作用。通过比较转录组分析，外源ABA和NDGA处理后第1天的差异表达基因分别为1103和505个。这些DEGs与光合作用、次生代谢、脂质代谢、细胞壁代谢、淀粉代谢和糖代谢过程相关，表明ABA参与了枣果实成熟的调控。此外，ABA还与其他植物激素和转录因子发生了串音，表明ABA对枣果实成熟具有调控网络。

结论

我们的研究进一步阐明了ABA相关的代谢和监管过程。这些发现有助于改善枣果实储存的策略，并用于了解复杂的非中小学果实成熟过程的见解。

枣树(Ziziphus Jujuba.米尔）是一个受欢迎的水果作物品种原产于中国和消费者由于水果的丰富营养和健康的好处[非常希望全世界1，2］．然而，肉枣果实具有非常短的保质期，在收获后2-3天内的快速脱水或水浸泡劣化下划线下划线[3.］．因此，果实储存和质量维护一直是大枣行业发展中最紧迫的挑战之一，而缺乏与其成熟特征和规定相关的知识。在过去的几十年里，阐明了澄清果实成熟的调控，已经取得了大踏步研究[4];乙烯和脱落酸(ABA)被认为是直接或间接参与更年期和非更年期果实成熟的最重要的植物激素[5，6］．最近，大枣被认为是一种非更年期的水果，但仍需要基本水平的乙烯来维持果实完全成熟[7］．这些结果也揭示了红枣果实成熟的调控机制是相对复杂的，需要进一步探索这些机制，以加深我们对红枣果实成熟的认识。

关于ABA，已经有报道称，包括葡萄在内的几种水果作物在成熟开始时，果实中ABA水平显著增加[8甜樱桃[9),黄瓜10,西瓜11，柿子[5]，这表明ABA在触发果实成熟的过程中起着重要的作用[8］．此外，外源ABA和nordihydroguaiaretic acid (NDGA，一种ABA生物合成抑制剂)的应用使我们能够识别ABA依赖的途径[12，13];研究成果的数量增加建议，促进可溶性糖的代谢和积累[ABA的积极作用12，14]形成剥离的形成[15，16]，以及细胞壁分解代谢的修饰[17]，从而加速成熟过程[5］．果实成熟是一个高度整合的过程，涉及激素控制和串扰，以及转录因子(TFs)转录本数量的改变[18，19］．越来越多的转录组测序数据为我们提供了更广泛的分子机制和调控网络的见解。例如，ABA调节绝大多数参与草莓果实成熟的基因的表达[19]， ABA对乙烯、生长素和赤霉素(GAs)的代谢和信号转导也有潜在的影响[12，20.，21，22］．然而，ABA参与枣非更年期果实成熟调控的报道却很少。

本研究旨在探讨ABA在枣树果实成熟调控中的作用。通过测定果实成熟过程中ABA水平的动态变化，对刚开始成熟的果实进行采摘，并对其进行外源ABA和NDGA处理，研究ABA依赖的途径和代谢过程。利用枣树参考基因组(LPXJ00000000.1)，我们鉴定了参与ABA生物合成、代谢和信号转导的基因。1)，并通过qRT-PCR检测其在果实发育和成熟过程中的表达。此外，通过转录组测序，我们同时检测了aba相关的成熟代谢和包括激素串音和转录因子活性的调控网络。这些结果为进一步研究非更年期成熟过程中ABA网络提供了依据。

内源ABA的积累与枣果实发育成熟的关系

‘东早’果实的整体动态生长呈双s型。2），来自E2至E3的两种快速生长相，其次是E4至WM。WM阶段被定义为果实成熟的发作，在此期间，果实颜色变白，重量累积率明显减少。内源性ABA的含量与果实生长过程一起测定，在未成熟的水果中具有低且稳定的水平;内容显示在WM的最大增加，并且在BR和HR果实中保持高水平。之后，含量在FR阶段下降，其水平相对较低，而不是在HR果实中观察到的水平。我们通过使用人的相关模型进行了统计分析，结果显示了ABA含量和果实重量之间的显着相关性，R平方值= 0.9254（p < 0.0001, two tailed).

中国冬枣果实发育和成熟过程中的ABA生物合成基因相对表达

在ABA生物合成途径中，从参考红枣基因组中鉴定出13个基因，其中1个为外源基因玉米黄质环氧酶（ZEP), 3数控， 1黄氧脱氢酶（ABA2), 6脱落醛氧化酶（AAO), 2钼辅因子sulfurtransferase（ABA3)基因。的相对表达ZjZEP果实发育和成熟过程中无显著变化。3.)．ZjNCED1在整个生长过程中持续表达，除了在E1阶段，在此期间中检测到相对高的表达。ZjNCED2还显示出一种稳定的表达模式，但在HR和FR阶段的水平略低于另一个阶段。ZjNCED3在WM期表达迅速增加，在果实成熟过程中保持较高水平。ZjABA2在未成熟的水果中没有高度表达，但在WM阶段后转录物的数量显着增加。ZjAAO3在低水平表达，但在WM其表达迅速增加和成熟过程中仍然很高，而相对表达ZjAAO1，ZjAAO2，ZjAAO4，ZjAAO5,ZjAAO6与ABA积累无关。此外,ZjABA3-1和ZjABA3-2WM期后的表达量高于未成熟果实。

ABA代谢基因在枣果实发育和成熟过程中的相对表达

在ABA分解代谢途径中，我们确定了五个CYP707A的相对表达zjcyp707a1.在果实发育和成熟过程中变化不显著。4)．zjcyp707a2.表现出未成熟的果实相对低的表达;然而，其转录强劲增长，这是伴随着ABA的积累，并达成在FR阶段最高水平。zjcyp707a3.在E1果实中表现出相对高的表达，但随后这种表达减少到非常低的水平。zjcyp707a4.仅在YF期高表达。zjcyp707a5.在YF期表达相对较高，但在YF期后表达降低，无明显差异。

在ABA稳态通路，8BGS被确定。其中，ZjBG4，ZjBG5，ZjBG8,ZjBG9ABA的积累与表达模式相似;这些基因在未成熟果实中的表达量较低，但在WM期后表达量增加。ZjBG1在YF和E1期表达量高于其他期，但随后表达量下降，且无明显变化。ZjBG2在HR、FR和YF阶段的表达高于其他阶段。ZjBG6在YF显示出相对高的表达，并且在其他阶段没有显着变化。ZjBG7在YF，WM，和BR阶段显示出更高的表达比在其他阶段。此外，我们还确定了两个ABA-glucosyltransferases（AOG）但它们的表达水平极低，并且在图中未示出。

ABA信号通路基因在红枣果实发育和成熟过程中的相对表达

在信号通路方面，有6个编码ABA受体的基因PYR /所有/ RCAR被确定。ZjPYR1和ZjPYR5在YF和E1期表达相对较高，但在成熟开始后表达非常低(图2)。5a).的表达水平Zjpyl8.和Zjpyl9.在未成熟果实中含量较低，但在WM后略有增加。此外,ZjPYL2和Zjpyl4.在冬枣果实中不表达。

在八个确定PP2C年代,ZjPP2C4，ZjPP2C5，ZjPP2C6，ZjPP2C7,ZjPP2C8随着ABA积累，表达模式相似，在WM期表达迅速增加(图2)。5然而,b)。ZjPP2C1在YF和E1阶段显示出较低的表达，但HR果实表达更高。ZjPP2C2在YF期表现出相对高的表达，但之后的表达是一致的。的相对表达ZjPP2C3在整个果实生长过程中也没有显着改变。

七个SnRK2从中国大枣基因组中鉴定出。ZjSnRK2-3，ZjSnRK2-4和ZjSnRK2-7在未成熟的果实中表现出相对较低的表达，但它们的表达随着ABA积累而显着增加。此外,ZjSnRK2-1在YF和E1期表达量低于其他期，但在E3期开始表达量增加，在WM期表达量最大(图2)。5c)。ZjSnRK2-2在YF时表达相对较高，但在其他阶段表达保持一致。ZjSnRK2-5和ZjSnRK2-6在果实发育和成熟过程中表现出相对一致的表达模式ZjSnRK2-6在人力资源果实中显示出最大的表达。

关于ABA和NDGA的WM Chinese Jujube Fruit的成熟和激素水平的变化

为探讨ABA对大枣果实成熟的调控作用，采用外源ABA或NDGA处理大枣果实。正如预期的那样，ABA处理后的果实在贮藏期间内源ABA浓度显著增加并保持在较高水平(图2)。6a). 3 DAT时，CK和ABA处理的果实ABA含量均达到一个中等峰值，而ndga处理的果实ABA含量略低。在贮藏过程中，呼吸速率的变化先趋于减小，后趋于中度增加(图1)。6b).外源ABA处理显著提高了1 DAT时的呼吸速率，但随后的效果并不显著。NDGA显著抑制果实呼吸作用，处理果实呼吸作用水平较对照降低。此外，乙烯产量很低，ABA处理在1 DAT时显著增加，而NDGA对乙烯产量的影响有限(图2)。6c)。

比较转录组分析中DEGs的鉴定

为了研究ABA相关成熟过程的分子基础，我们在1dat对经过ABA和NDGA处理的WM枣果实进行转录组测序。总共产生了41.26 Gb原始测序数据，包含275,139,538个reads;在质量控制后，271,970,678个干净读取被用于进一步分析(附加文件1)．通过与大枣基因组比对，每个文库(附加文件)中平均有87.42%的reads被唯一映射2），并计算的31031个转录物的相对表达水平。通过比较转录组分析，1103度的视角进行了鉴定，与456个上调和下调647转录响应外源性ABA（图检测到。7a).此外，505个基因转录本在NDGA处理后发生显著变化，其中45个基因表达上调，460个基因表达下调(图4)。7b).当比较这些输出时，ABA和NDGA同时诱导了83个deg(图。7c)。

通过GO，KEGG和MAPMAN分析进行富集的DEGS

为了揭示ABA和NDGA处理对枣果实成熟影响的差异，我们利用GO注释充实了特定DEGs的假设功能，分别为ABA(1020)和NDGA(422)处理生成了31和32个2级类(附加文件)3.)．膜，细胞部分和细胞类别在细胞组分中高度表示（图。8a).催化活性和结合类分子功能高度富集。最后，代谢过程、单生物过程和细胞过程是最丰富的生物过程。

KEGG通路分析将DEGs分别富集到ABA和NDGA处理的83和72条通路中(补充文件)4)．这些途径大多与10个代谢过程相关(图。8b）包括影响碳水化合物，氨基酸，其他次级代谢物的生物合成的人，其它氨基酸，能量，脂质，核苷酸，三萜和聚酮化合物，辅因子和维生素，以及聚糖生物合成和代谢。此外，与环境适应，翻译，复制和修复，折叠，分选和降解，信号转导，膜运输和转移以及分解代谢相关的基因也在途径富集的途径浓缩中的高度代表。

此外，MAPMAN分析允许我们概述ABA和NDGA治疗后代谢过程的转录变化。响应于外源性ABA，显着抑制了与光合作用代谢和几种次级代谢物（萜类代谢物）的DEGs，而细胞壁改性，脂质代谢和淀粉和蔗糖代谢稍微促进（图。9一个额外的文件5)．此外，NDGA显著抑制了这些代谢过程，包括次生代谢、细胞壁修饰、脂质代谢、氨基酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢(图2)。9b,额外的文件5)．

与植物激素代谢和响应ABA和NDGA处理信令度的视角

鉴定出一些与植物激素代谢和信号转导相关的deg(图。10额外的文件6)．在ABA新陈代谢，外源ABA下调了表达ZjNCED2（ZJ.JZ004177006）并上调了两种β-葡糖苷酶的表达（ZjBG4Zj.jz038707010;ZjBG5， Zj.jz044273026)， NDGA促进zjcyp707a1.(Zj.jz017079277)，并抑制ZjBG5(Zj.jz044273026)。在信号通路中，外源ABA和NDGA诱导的基因表达不显著。

控制乙烯生物合成的基因的转录物，包括1-氨基环丙烷-1-羧酸盐合酶（ACS71-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO3，ZJ.JZ017079235），响应于ABA治疗而显着积累。但是，响应NDGA，表达ACO1(Zj.jz022243019)表达下调。在乙烯信号转导中，受体的表达ERS2(Zj.jz001627227)被ABA强化ETR2（Zj.jz028715030）中的溶液高度上调响应于NDGA。参与信令其他基因几乎不受任一处理诱导;另外，乙烯 - 不敏感的3结合的F-box（EBF， Zj.jz019851103)，它调制乙烯不敏感3-like (EIN3 /面纱在翻译后水平上，ABA表达上调，而NDGA表达不显著。

an的表达ent-Kaureno酸羟化酶（花王参与赤霉素生物合成早期步骤的基因表达上调花王(Zj.jz001403002)被NDGA下调。此外，两种ga -20氧化酶(Ga0ox., Zj。jz041763136, Zj.jz037529002)参与活性GA的生物合成，响应外源ABA而下调。对于GA的降解，一个GA-2氧化酶(GA2ox，ZJ.JZ034557218）在ABA处理的果实中显示出相对高的表达。关于信号通路，转录DELLA1（ZJ.JZ004979072）由ABA下调，但NDGA未显着诱导。

参与促进剂代谢和信号传导的基因的相对表达几乎不能被外源aba诱导;然而，一种色氨酸氨基转移酶（TAA在植物生长素生物合成的色氨酸依赖途径和一个gretchen hagen 3 (GH3NDGA处理同时下调了与偶联相关的基因Zj.jz043973001。此外，外源ABA下调了控制细胞分裂素生物合成的两个基因的表达，包括CYP735A(Zj.jz043523077)，编码细胞分裂素反羟化酶日志(Zj.jz008869058)，它编码一个细胞分裂素核苷5 ' -单磷酸磷酸水解酶。在信号转导中，只有含有组氨酸的磷酸转移酶(AHP.)的表达量受到ABA的下调，NDGA对这些基因的表达量影响有限。

ABA和NDGA处理对转录因子的影响

我们还鉴定了几个在ABA和NDGA处理下差异表达的tf(图)。11额外的文件7)．外源ABA上调表达3 APETALA2 / ethylene-responsive元素（AP2 /小块土地, Zj。jz042635005, Zj。jz044705012和Zj.jz044537132)，二锌指蛋白（Zj.jz028519044和Zj.jz006119044），1-南汽domain-containing蛋白质（Zj.jz007373078），和1个WRKY基因(Zj.jz015029046)。此外，ABA下调了2AP2 /小块土地年代(Zj。jz044531026和Zj.jz034557065)， 2Bhlh.S（Zj.jz042793020和Zj.jz042921104），2-Bzip.年代(Zj。jz0137047 and Zj.jz037039133)， 1锌指蛋白(Zj.jz041823042) 3同源框（乙肝）转录因子（Zj.jz029235034，Zj.jz039989051，和Zj.jz043799010），1-热休克特遣部队(HSF，Zj.jz004979138），6my年代(Zj。jz004979253, Zj。jz005919060, Zj。jz008869110, Zj。jz019661008, Zj。jz041121020, Zj。jz043819011和Zj.jz044713001)WRKYS（Zj.jz034949026和Zj.jz042571063）。

NDGA还诱导了几种与TFs相关的deg的表达，包括2AP2 /小块土地s (ZjERF52, Zj。jz034557065 and Zj.jz001627224)， 1Bhlh.(Zj.jz031003007), 1锌图蛋白质(Zj.jz017079223), 1my(Zj.jz044713001)。下调基因包括2Bhlh.年代(Zj。jz015029086和Zj.jz016733025)， 5锌指蛋白(Zj。jz038707050, Zj。jz042849020, Zj。jz038181028, Zj。jz037267016和Zj.jz035687008)， 1乙肝(Zj.jz006473038), 2my年代(Zj。jz022481098和Zj.jz014311034)。

转录组表达水平的验证

选择十七基因通过qPCR来验证转录表达水平。的RNA-SEQ数据和相对表达从0.838-1.0范围之间的相关系数（附加文件8)，从而确认RNA-seq数据的可靠性。

红枣果实成熟过程中内源ABA的动态积累

研究了内源ABA在枣果实发育和成熟过程中的动态积累。一些研究表明内源性ABA是由果肉组织合成的，而不是由种子运输的[8，11，23］．红枣YF期初期内源ABA含量较高，可诱导同化产物的吸收和蔗糖的积累[8，9]，而在WM阶段的迅速增加，响应于与色素积聚，糖代谢，在水果细胞壁降解熟化相关的发作[24］．ABA的增加也被报道在更年期和非更年期的果实中，如番茄[5],桃子[25]，柿子[26)、葡萄(24),草莓27]和西瓜[11］．ABA在诱导枣果实成熟过程中起着重要作用，因为在我们上一项研究中报道的‘东枣’果实WM期乙烯排放有限[7］．FR果实中乙烯产量略有增加，ABA含量同时下降。我们提出可以存在一种互补机制，如SlNCED1 RNAi番茄植株ABA含量较低，但乙烯产量较高[28］．然而，这些发现表明ABA在调节枣树果实成熟的发生和维持过程催熟作用。

ABA生物合成和代谢途径基因在枣果实发育和成熟过程中的表达表明ABA在调控过程中发挥了平衡作用数控，CYP707A,BG基因并确定内源性ABA的积累[5，29，30.］．虽然ZjNCED3表达量不高，有增加的趋势，这与ABA的积累有关;的ZjNCED3蛋白质的氨基酸序列相似性为64%AtNCED6(AT3G24220)蛋白，在ABA合成调控中起关键作用拟南芥．这些结果表明ZjNCED3也可能是在确定中国冬枣果实ABA的生物合成非常重要的。虽然表达ZjNCED1和ZjNCED2未能平行ABA积累，这些基因可能也参与了这个过程;例如,CsNCED2似乎起到ABA积累起辅助作用，如基因产物在限制为包含有色体组织柑橘类水果 [31］．而CYP707As被证明能催化ABA降解[32，33]，我们发现表达了zjcyp707a3.，zjcyp707a4.,zjcyp707a5.在枣果成熟开始时减少，提示发育阶段依赖的表达模式[27]，在西瓜(Cla020637和Cla016011) ［11]和桑树(MaCYP707-1-4) ［34］．此外,zjcyp707a2.在FR期表达量增加，我们认为这可能与FR期ABA含量下降有关。关于BGS，编码酶催化糖基化 - ABA的水解，迅速增加植物组织中免费ABA的含量[35］．我们的研究结果表明，ZjBG4，ZjBG5，ZjBG8,ZjBG9由于它们的表达模式与ABA的动态变化一致，因此可能参与了ABA积累的调控[5，23];抑制的表达FaBG3减少了ABA含量和延迟草莓果实成熟[36］．在黄瓜，两个BGs也被鉴定为参与了ABA积累的调节[23］．

我们的研究也确定了ABA生物合成途径中其他几个基因的表达，但关于它们在果实成熟过程中的表达的报道很少。ZjZEP大枣果实发育过程中持续表达和成熟，并在其表达也没有涉及到ABA积累varcinium myrtillus.水果 [37］．ZjABA2在ABA的动态变化后表现出增加的表达ATABA2.-过表达植株也表现出较高的ABA积累[38];但在果实成熟过程中未检测到相关性varcinium myrtillus.［37］．在Jujube，只有ZjAAO3表达量与ABA的动态变化一致;AAOS属于一个小的基因家族，其成员被认为是功能冗余的AtAAO3参与ABA的生物合成拟南芥［39，40］．此外，表示ZjABA3-1符合的ZjAAO3；ABA3编码钼辅助因子硫酶并与AAO3［30.］．之前的一项研究也表明ATABA3.ABA含量与拟南芥［41］．

ABA信号通路基因在枣子发育和成熟过程中的转录

ABA的信号传导途径，包括p/塔/RCAR-PP2C-SnRK2,已在植物中广泛报道[5］．在我们的研究中，ZjPYR1和Zjpyl5.在不成熟的水果中表达了相对较高的水平，但成熟后，它们的表情低于Zjpyl8.和Zjpyl9.呈现相反的趋势，在成熟阶段表达量相对较高。根据系统发育分析的结果(附加文件9），ZjPYR1属于进化支IIIZjpyl5.属于进化枝II。这两个分支也显示它们的表达和积累ABA之间的负相关柑橘类水果(CsPYR1，cspyl4.,cspyl5.) ［42］．Zjpyl8.和Zjpyl9.随着ABA水平的增加，与该进化支相关的基因也在逐渐积累cspyl8.和cspyl9.基因柑橘类［42];SlPYL1，SlPYL2,SlPYL3在番茄43];和FaPYR1在草莓44］．因此，我们的研究结果表明，ZjPYR1和Zjpyl5.是枣子未成熟果实ABA信号转导的关键基因，而Zjpyl8.和Zjpyl9.在果实成熟过程中维持信号传递更为重要。

PP2C蛋白充当ABA信号转导负调节[45]，它们可以与受体结合并形成蛋白激酶复合物的组分，这调节对ABA信号的果实敏感性[42，46，47］．我们的研究确定了8个基因属于PP2C-亚族，其中5个(ZjPP2C4- - - - - -8)随着ABA积累而上调。以往的一些研究也表明，局部表达PP2C在果实成熟过程中累积柑橘类（CsABI1，cshab1.，CsAHG1，CsAHG3,CsHAI3）， 番茄 （SlPP2C1和SlPP2C5），和葡萄（VvPP2C3，VvPP2C6，VvPP2C7,VvPP2C9) ［42，43，48］．然而，还需要更多的证据来阐明两者之间的关系PP2C对ABA信号的敏感性。

此外,7SnRK2S在我们的研究中被确定，并根据两者的研究将其分为三个分支柑橘类和番茄42，43］．然而，由于富集的ASP（D）残基，仅提出了Clade III，该途径参与了ABA信号通路，其位于C末端序列内，并且称为激酶结合位点[49］．我们的研究只发现了这一点ZjSnRK2-2和ZjSnRK2-5属于这个思工（附加文件9)，其转录本与ABA含量之间无显著相关性。这一现象与之前的研究结果一致柑橘类，西红柿和苹果水果[42，43，50］．对于分支I和II，ZjSnRK2-3，ZjSnRK2-4,ZjSnRK2-7也随着ABA含量的增加而积累，说明这些基因参与了成熟调控而不参与ABA信号[51］．尽管如此,ZjSnRK2-2和ZjSnRK2-5对维持大枣果实的ABA信号相对重要。

ABA在红枣果实成熟过程中起正向调节作用

为进一步研究ABA对枣果实成熟的调控作用，采用低浓度ABA或NDGA处理WM‘东枣’果实。结果表明，ABA处理促进了果实内源ABA的快速积累，在一定程度上促进了果实呼吸作用和乙烯生成。这些结果与最近的一项研究结果相似，该研究表明50毫克L⁻¹ABA促进WM‘东早’果实成熟，降低果实采后贮藏品质[52］．此外，我们的研究表明50毫克L⁻¹NDGA抑制在3 DAT内源性ABA的增加，显著降低水果的呼吸，但略受影响乙烯生产在我们的研究。NDGA是ABA生物合成的抑制剂，因为它可以与NCED酶就其渗透速度相互作用[53］．因此，NDGA减少了ABA生物合成，但没有完全抑制过程[54，55］．上述结果表明，ABA在红枣果实成熟过程中起着潜在的正调节作用。

比较转录组分析提供了与代谢过程改变响应的deg相关的概述。前人研究表明，ABA诱导果实成熟背后的转变与抑制营养生长代谢和激活成熟特异性途径有关[14，56］．在我们的研究中，发现与光合代谢和几个次级代谢产物基因由ABA（附加文件有所下调5)．光合新陈代谢被认为是诱导到通过下调基因表达的过渡到果实逐渐过渡的转变，响应于外源ABA [13，14，57］．此外，1 DAT ABA下调了黄酮、黄烷醇和黄酮类化合物代谢相关基因的表达，表明外源ABA可能对红枣果实产生胁迫反应。在葡萄中，ABA在处理后20 h也下调了苯丙素生物合成和类黄酮生物合成相关基因的表达，但在处理后44 h上调了表达[14］．我们推测，由于其在调节次生代谢物中的积极作用，ABA之后，ABA将积极地诱导二次新陈代谢;这个过程对番茄，葡萄和草莓是常见的[13，16，58］．

另一方面，我们发现，ABA和NDGA对脂质、细胞壁修饰、淀粉和蔗糖代谢等相关基因具有一定的正向诱导作用，表明ABA与成熟相关代谢之间存在相关性。在脂质途径中，改变的基因表达参与细胞膜的修饰，芳香化合物的生物合成，以及由损伤引起的木质素化。12，19，59，60］．在细胞壁修饰方面，纤维素合成、细胞壁蛋白、细胞壁降解和修饰相关基因均被ABA上调，说明ABA在调控果实质地变化方面具有潜在作用[5，17，61］．在淀粉生物合成途径中，通过ABA下调编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶和异戊聚糖酶的基因，而NDGA下调了控制淀粉降解的基因的表达，包括两个α-淀粉酶和编码β-淀粉酶编码基因。这些结果表明，ABA参与淀粉代谢，就像ZmEREB156通过蔗糖和ABA的协同作用正调控玉米淀粉生物合成[62］．在蔗糖代谢中，编码液泡转化，己糖激酶，和糖转运基因显著由ABA诱导，表明ABA促进蔗糖降解但维持葡萄糖和果糖的含量，而这些基因的表达NDGA处理后抑制。这se results suggest a putative role of ABA in regulating sucrose metabolism, and genes related to sucrose metabolism were also found to be activated after 44 h in grape fruit treated with exogenous ABA [14］．总的来说，我们的研究提供了全面深入了解ABA的作用，在调节枣树果实成熟相关的代谢，仍需要进一步的研究来阐明所涉及的复杂的监管机制。

ABA在调节中国冬枣果实成熟的调控网络

本研究通过转录组数据分析了ABA与其他植物激素和转录因子之间的串扰(图2)。12)．外源ABA促进了处理果实内源ABA的快速积累，但抑制了外源ABA的表达ZjNCED2，表明响应外源ABA的负反馈调节，就像这样的情况CsNCED1在柑橘类和LeNCED2在番茄20.，54］．ZjBG4和ZjBG5而这两个基因在果实成熟过程中对ABA积累表现出正响应，这对调节ABA含量至关重要[11，23］．相反，NDGA治疗促进了表达zjcyp707a1.但抑制ZjBG5，从而抑制了3dat ABA含量的增加。这些结果证实了转录平衡的作用数控，CYP707A,BG维持ABA积累[11，19］．

我们还发现参与乙烯生物合成和感知的基因，包括ZjACS7，ZjACO3,ZjERS2， ABA上调;在番茄(LeACS2，LeACS4,LeACO1)和葡萄(vvaco1.)，提示ABA可能是乙烯途径的上游调控因子[8，25，55］．关于乙烯信号通路，ZjERS2ABA上调。表达量的增加是对与乙烯结合引起的受体降解的反应[63，64］．信号通路相关的基因很少被治疗诱导，尽管表达ZjEBF2ABA上调基因表达。此外,EBF调节ethylene-insensitive存在（EIL.)在转录后水平上[65，66];因此，该结果也表明ABA间接调控乙烯信号通路。

在我们的研究中，涉及GA、生长素和细胞分裂素的生物合成、代谢和信号转导的几个基因的表达;Ga0ox.，CYP735A,日志，参与GA和细胞分裂素的生物合成;一个德拉参与GA信号转导的蛋白AHP.响应于外源ABA的涉及细胞素素信号传导的基因是下调的。阿巴也上调了表达GA2ox,这调节了GA的降解。此外，NDGA抑制基因的表达（TAA和GH3）参与生长素生物合成。有证据表明，GA，生长素，细胞分裂素和水果中减少草莓，葡萄成熟，和番茄[67，68，69］．此外，用这些植物激素治疗的荔枝，草莓和甜樱桃果实抑制或延迟果实成熟过程[15，19，22，70］．因此，ABA会与与成熟负相关的激素发生串扰。

在ABA和NDGA诱导的转录因子中，DEGs与AP2 /小块土地，n，WRKY，Bhlh.，Bzip.，乙肝，my，锌指蛋白,Hsf鉴定了TFS。这些TFS广泛参与果实代谢，例如植物激素代谢和信号传导，黄酮类化合物和花青素的积累，以及对压力的反应[6，71］．外源ABA抑制了ABA的表达ZjERF34和ZjERF52，而在我们的上一项研究中，这些基因在成熟过程中被下调zjdreb1.被ABA上调，也被发现与成熟呈正相关[72］．此外,两个Bzip.s被ABA下调，Zj。jz037039133作为ABA响应因子可能位于ABA信号的末端;该因子被认为参与调控葡萄中ABA和酚的积累[73］．我们的研究还确定了由ABA和TF下调的6个MYB TFS，在调制果实着色和质地方面具有广泛的作用[74］．大量的锌指蛋白是由外源性治疗所致，而c2hc锌指蛋白可以应对外源ABA诱导的氧化应激的抵抗力[75］．我们还发现n基因被ABA上调，并被发现参与调控乙烯信号、果实色素沉着和果实软化[76］．总体而言，这些TFS的鉴定为我们提供了广泛的了解ABA参与调节枣果实成熟的复杂调控，并且应在未来优先研究这些TFS的潜在机制。

本研究全面揭示了ABA在枣树果实成熟中的作用，揭示了果实成熟的开始与内源ABA的积累呈正相关关系，内源ABA的积累受内源ABA表达之间的互作调控数控（ZjNCED3），CYP707A（zjcyp707a2.),BGs (ZjBG4，ZjBG5，ZjBG8,ZjBG9)．由受体(Zjpyl8.），PP2Cs (ZjPP2C4，ZjPP2C5，ZjPP2C6，ZjPP2C7,ZjPP2C8),SnRK2s (ZjSnRK2-2和ZjSnRK2-5)在调节果实对ABA的敏感性方面起重要作用。此外，ABA在调节枣果实成熟过程中起主导作用，本研究进一步阐明了ABA相关代谢，并预测了枣果实成熟调控网络。这些发现将有助于进一步改进枣果实的贮藏策略，并有助于了解复杂的非更年期果实成熟过程。

植物材料，治疗和储存

大众的水果z jujuba栽培品种‘东枣’，采自我们在中国大理徐庄的实验果园(N34.52, E109.56)的成年树。根据开花期(DAB)和果皮颜色的变化选择采样周期:15 DAB，幼果(YF);30 DAB，放大水果(E1);40轻拍,E2;55轻拍,E3;70轻拍,E4;85 DAB，白色成熟(WM);100 DAB，起始红(BR);110 DAB，半红(HR);115 DAB，全红色水果(FR)。 Three biological replicates of fifteen fruits were collected, and their weights were measured at each sampling period. The fruits were cut into small cubes, immediately frozen in liquid nitrogen, and stored at − 80 °C for subsequent experiments.

在WM期(成熟开始期)，用手采收5株冬枣肉质果实。将果实置于15℃保存6 h，转移至实验室，用水清洗，室温(20℃)风干30 min。然后，将果实随机分为三组，浸泡在50 mg L的溶液中⁻¹(±)-ABA (Sigma-Aldrich)， 50 mg L⁻¹NDGA (Sigma-Aldrich)或蒸馏水(对照)10分钟。处理后，每组果实均置于10 L无盖塑料容器中，20℃黑暗保存。取处理后第1、3、5、7、9天的果实切片，液氮冷冻，−80℃保存。

提取与内源ABA的判定

内源性ABA在4℃下萃取两次，使12小时从1.0g碎果，4ml 80％含有200mg L的甲醇⁻¹500mg L⁻¹一水柠檬酸[77］．离心后上清混合，35℃氮气干燥_．残留物溶解在0.8 mL的80%甲醇中，通过0.22 μm滤膜过滤。

ABA水平的定量是在以前发表的方法的基础上修改的[78]，并采用高效液相色谱(LC-20AT，岛津，日本京都)和电喷雾串联质谱(QTRAP 5500, AB SCIEX，美国)进行测定。具体来说，采用C18色谱柱(2.1 × 150 mm, 5 μm, Eclipse XDB, Agilent, USA)在40℃分离ABA，溶剂梯度如下(溶剂a，甲醇;溶剂B, 0.05%甲酸):0-8分钟，30% B;8-15 min，线性增加至100% B;15-17分钟，100% B;17-22 min，线性降至30% B，流速为0.50 mL s⁻¹进样量为10.0 μL。对于质谱分析，使用以下条件:IS, Turbo Spray(−)，−4000;FP,−400;EP,−10;−4级;坏蛋,10;CAD、5;TEM, 450;GS1, 50;GS2, 55岁; and ihe, ON. The retention time and mass spectrometry information concerning ABA were determined with a standard substance ((±) ABA, Sigma-Aldrich), and the following conditions were ultimately selected: Q1, 263.3; Q3, 153.2; DP, − 24; and CE, − 16. External calibration curves were prepared using different concentrations of standard ABA dilution. Three independent biological replicates were prepared for each sample.

果实贮藏过程中呼吸速率和乙烯生成的测定

采用LI-6400XT光合作用系统(Lincoln, NE, USA)，在0.45 L的圆柱形室内，空气流速为700 μmol s，测定每天14:00储存期间的呼吸速率⁻¹．在ΔCO稳定变化₂大约100克的水果被用来计算呼吸速率[79.］．每个样品测量三个独立的生物学重复。

乙烯生产的萃取和测定是按照我们以前公布的方法进行的[7］．乙烯收集方法:在室温下将约100克水果密封在0.5 L玻璃瓶中2小时，并将5ml顶空气体吸入20ml盛满水的青霉素瓶中[7］．气体样品在储存期间每天采集，收集后一起测定。从青霉素瓶中取出一毫升气体注入气相色谱仪(Trace GC ULTRA2010, Thermo, USA)，该色谱仪装有火焰电离检测器和Porapak 80-100填充柱(200 × 3 mm)。烘箱、进样器和检测器的温度分别为70、70和150℃。载气(N₂H₂流速分别为35、35和350 ml min⁻¹,分别。每个样品测量三个独立的生物学重复。

ABA生物合成、代谢及信号通路相关基因的鉴定

基于红枣基因组数据集(https://doi.org/10.5061/dryad.83fr7) ［80[ABA生物合成，代谢和信号通路基因被BLASTN和SMART分析鉴定并确认[81.］．这些基因的序列信息列在附加文件中10．预测的蛋白质用葡萄，番茄的已知蛋白质序列对齐，并且拟南芥，对其序列进行KEGG分析(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)．系统发育树数控，CYP707A，BG，PYR /所有/ RCAR，PP2C,SnRK2通过MEGA 7.0进行1000次bootstrap复制，使用邻居连接方法生成基因[82.］．

RNA分离、cDNA文库构建及Illumina测序

在1 DAT（两个生物学重复）控制和ABA-和NDGA处理水果进行转录组测序。总RNA，使用植物的RNA提取试剂盒（Takara，大连，中国）分离，并用无RNA酶的DNA酶I其后，RNA的量通过分光光度分析测量消化，且其质量通过琼脂糖凝胶电泳进一步验证。A total of 3 μg of RNA per sample was used for cDNA library preparation with a NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit (NEB, USA), and the resulting PCR products were purified and quantified on an Agilent Bioanalyzer 2100 system. Sample labeling was performed on a cBot Cluster Generation System using a TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS. Afterwards, the libraries were sequenced on an Illumina HiSeq PE150 platform. The raw sequencing data were subsequently submitted to the Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/)(额外的文件11)．

转录组测序数据的生物信息学处理

使用内部Perl脚本处理Illumina HiSeq X平台生成的原始测序数据，以去除包含适配器和poly-N高比率(> 10%)的低质量读取。同时计算干净数据的Q20、Q30和GC含量。随后，利用TopHat v2.0.9软件将洁净数据与参考枣树基因组序列进行比对[83.]并用于基因表达水平的定量通过HTSeq V0.6.1进一步处理[84.］．相对基因表达丰度由外显子模型每千碱基每百万映射reads (RPKM)值估算，该值来自两个生物重复的平均值[85.］．用于鉴定差异表达基因（DEGS），EDGER计划[86.在免费的在线数据分析平台OmicShare工具(http://www.omicshare.com/tools.)，变化率(FC)阈值≥2，假发现率(FDR)≤0.05。edgeR的使用允许在两个重复内进行比较分析，它已在之前的几篇论文中使用[12，87.，88.］．DEGs的功能富集是通过OmicShare平台上的基因本体(GO)和途径分析工具确定的[89.］．我们还使用MapMan 3.6.0RC1软件来丰富deg假定的功能注释[90.，91.］．

转录组表达水平的定量实时PCR验证

使用植物RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取总RNA，然后使用PrimeScript RT试剂试剂盒和gDNA Eraser (TaKaRa)制备200 ng高质量RNA，合成第一链cDNA。采用总体积为10 μL的SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(TaKaRa)进行qPCR，包含1.0 μL cDNA、5.0 μL SYBR Premix溶液、0.4 μL正向/反向引物和3.2 μL dH₂O.使用以下条件设定roche LightCycler 96系统中的QPCR的热程序：95°C为30秒;40循环在95℃，58℃下的95℃，30秒和72℃的30秒的扩增循环;和默认的解离阶段。将每个基因的相对表达标准化为参考基因的相对化，Zjubq.(Zhang et al. 2015)，最终采用2^-△Ct方法（Livak和Schmittgen，2001）。用于定量PCR的引物序列中的其他文件中列出10．

统计分析

采用Duncan多量程检验(MRT)进行统计学分析p< 0.05水平，SPSS 19.0。图中的误差柱代表三个生物重复的标准差。

阳极氧化铝:

脱落醛氧化酶

阿坝:

脱盐酸

ABA2:

黄氧脱氢酶

ABA3:

钼辅因子sulfurtransferase

华:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate氧化酶

ACS:

1-aminocyclopropane-1-carboxylate合酶

AHP：

histidine-containing磷酸转移酶

AOG:

ABA-glucosyltransferase

AP2 /小块土地:

APETALA2 / ethylene-responsive元素

BG:

β-葡萄糖苷酶

BR:

开始红色

CYP707A:

ABA-8”-hydraxylase

轻拍:

盛开后的一天

DAT：

天治疗后

DEG：

差异表达基因

艾凡:

放大水果

EBF:

乙烯不敏感的3-结合F-box

EIN3 /面纱:

乙烯不敏感的存在

人:

乙烯反应

ETR:

乙烯受体

FC：

褶皱变化

罗斯福:

错误发现率

FR:

全红色

GA：

Gibberenllin

GA20ox:

GA-20-氧化酶

GA2ox:

GA-2-oxidase

GH3:

格雷琴哈根3

去：

基因本体论

HB:

同源框转录因子

人力资源:

有的则

HSF:

热休克转录因子的

花王:

ent-kaurenoic酸羟化酶

日志:

细胞分裂素核苷5 ' -单磷酸磷酸水解酶

MRT：

多个范围测试

nc:

Nine-cis-epoxycarotenoid加双氧酶

NDGA:

去甲二氢愈创木酸

PP2C:

蛋白磷酸酶2摄氏度

PYR /所有/ RCAR:

Pyrabatin电阻/电阻pyrabatin 1样/调控元件

SnRK2:

蔗糖非发酵相关蛋白激酶2

TAA:

色氨酸转氨酶

TF：

转录因子

WM:

白色的成熟

YF:

幼果

齐柏林飞艇:

玉米黄质环氧酶

不适用。

资金

科技部国家重点研发计划项目(no . 2018YFD1000607)。关键词:岩石力学，蠕变，蠕变特性，蠕变特性支持者在设计、收集、分析、解释相关数据或撰写手稿中没有发挥任何作用。

数据和材料的可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

从属关系

1. 西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100

   张忠，康晨轩，张淑义，李新刚

2. 2 .西北农林科技大学陕西省林业综合重点实验室，陕西杨凌712100

   钟张李丽

3. 西北A＆F大学国家林业与草地管理枣工程研究中心，杨凌，陕西712100

   新港李

4. 临渭区，渭南，714000，陕西，中国林业局

   Shuyi张

贡献

ZZ和XL构思和设计了实验。ZZ进行了样品准备并进行了所有实验，数据分析并写了稿件。CK和SZ参与了采后储存期间的水果呼吸和乙烯生产的测定。ZZ和XL促成了讨论。所有作者均认批准了最终手稿。

相应的作者

对应到新港李．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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再版和权限