新颖的单倍型和网络AVR-PIK.等位基因的Magnaporthe oryzae

背景

稻瘟病疾病是全球大米最具破坏性的真菌疾病之一。airulence（AVR.）基因Magnaporthe oryzae被同源抵抗（R）水稻基因和触发血液抗性。变异AVR.是新比赛的主要驱动因素之一。检测变化AVR.来自人口的分离物的基因Magnaporthe oryzae从水稻生产领域收集的数据将有助于评估R水稻生产区基因。的实物支付债券基因包含5R等位基因（实物支付债券，p，PIKP.，p和Piks.）对应于AVR.等位基因（AVR-PIK / KH / KP / KM / KS)M. Oryzae.．的实物支付债券基因特异性识别并通过分离株来预防感染M. Oryzae.包含AVR-PIK.．分子变异AVR.-实物支付债券等位基因的M. Oryzae.和实物支付债券水稻的等位基因还不清楚。

结果

我们研究了可能的进化途径AVR-PIK.通过分析其DNA序列变异并测定其对同源的失明来分析等位基因实物支付债券中国田间条件下抗性基因等位基因。来自基因组DNA的PCR产物的结果表明，366个分离物中的278个M. Oryzae.从中国云南省收集，携带AVR-PIK.等位基因。来自云南6个地区的分离株携带率为66.7% - 90.3%AVR-PIK.等位基因。而且，10AVR-PIK.单倍型编码五种新AVR-PIK.在201株分离株中发现了变异株。的AVR-PIK.等位基因通过逐步碱基替换从无毒形式进化为有毒。这些发现表明AVR-PIK.等位基因处于积极的选择中，突变是战胜种族特异性抗性的原因实物支付债券等位基因本质上。

结论

我们证明了多态性和分布AVR.-实物支付债券中国云南省的等位基因。用致病性测定法检测不同单倍型的功能AVR.-实物支付债券，首次，我们展示了避免和逐步演变AVR.-实物支付债券云南水稻产区水稻等位基因研究。的功能AVR-PIK.拥有多样化的序列结构，并在自然界中进行正选择。

在寄生的漫长历史中，宿主和病原体之间发生了适应性突变，而选择压力传统上被认为是驱动这种共同进化的主要力量。到目前为止，关于这些动态已经提出了两种假设:宿主抗性基因之间的军备竞赛和堑壕战进化(R)和病原体的无毒基因(AVR.)[1]．军备竞赛假设被认为是主要假设，其中宿主R基因和病原体AVR.基因在定向选择下，等位基因是通过突变来源的。简而言之，病原体演化了一种毒力基因以克服宿主防御，而宿主演化了一种新的抗性等位基因以击败病原体的毒力基因。相比之下，在沟渠战的假设中，两个宿主的演变R基因和病原体AVR.基因是非透明的。

稻瘟病是稻区最具破坏性的病害之一，由丝状子囊菌引起Magnaporthe oryzae(同义词Pyricularia oryzae）.选用具有主要抗性的抗病水稻品种(R)基因被认为是控制这种疾病和作物损失的最重要的策略，也是对环境友好和经济的。到目前为止,≤26R米饭中的基因已经克隆：Pb1，Pia，加以，Pid2，Pid3，实物支付债券，Pikh / Pi54，p，PIKP.，呸，坑，皮塔饼，Pizt.，₁，皮，各π，Pi9，pi21，Pi25，Pi36，Pi37，Pi56，PI63.，pico39.（http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm），PI64.［2),Pigm［3.]．

水稻抗病基因可以识别相应的AVR.的M. Oryzae.并开始他们的免疫反应。迄今为止，12AVR.基因M. Oryzae.克隆:AVR-PI54.［4]，AVR-Pi9［5]，AVR-PIB［6]，AVR-PIA.［7]，AVR-PII.［7]，AVR-PIK / KM / KP［7]，AVR-Pizt［8]，傻乎乎［9]，Avr-pita.［10]，AVR1-CO39［11]，PWL1.［12),而PWL2.［13]．的AVR-PIK / KM / KP基因的M. Oryzae.决定了效果R基因PIK / KM / KP．AVR-PIK / KM / KP用113个氨基酸和两个保守的基序编码诱导的分泌蛋白：MOTIF-1，[LI] XAR [DSE] [DSE]和MOTIF-2，[RK] CXXCXXXXXXXXXXXH（类似于C2H2锌指丝绸）[7]．的AVR-PIK / KM / KP基因从Ina168的分离物中克隆，但发现在组装的分离物70-15的组装序列中，其被宿主Pik抗性蛋白识别并触发防御反应[7]．五个AVR-PIK.等位基因（AVR-Pik-A，AVR-Pik-B，AVR-Pik-C，AVR-Pik-D， 和AVR-Pik-E)被发现[7),而AVR-Pik-D（20.5％）和AVR-Pik-E(1.4%)在77株分离株中检出[14]．四个AVR-PIK.等位基因（AVR-Pik-A，AVR-Pik-C，AVR-Pik-D， 和AVR-Pik-E)在全球39株(3株来自欧洲，6株来自美洲，7株来自非洲，23株来自亚洲)中发现AVR-Pik-D是最常见的等位基因(15 out 39)，而AVR-Pik-A，AVR-Pik-C， 和AVR-Pik-E等位基因有类似的频率（39分中为7-9）[15]．AVR-PIK / KM / KP是通过基因的增加/减少而进化的[7]，虽然在编码区域中观察到替代突变AVR-PIK / KM / KP在M. Oryzae.在中国水稻稻瘟病分离株中，在无信号域区域发现了16个单核苷酸多态性[16]．

的实物支付债券位点位于11号染色体的长臂上，已知具有抵抗功能[17，18，19，20.]．当实物支付债券轨迹，五种稻瘟病R基因（实物支付债券，Pik-m，Pik-p，Pik-h和Pik-s)，其中4R基因（实物支付债券，Pik-m，Pik-p和Pik-h)已被隔离[18，21，22，23，24),实物支付债券被认为是最年轻的等位基因[22]．实物支付债券，Pik-m，Pik-p和Pik-h被克隆并发现编码一个假定的CC-NBS-LRR蛋白[18，23，25，26]．的CC域Pik-1物理上与AVR-PIK.效应的M. Oryzae.触发实物支付债券特殊电阻(15，23]．水稻抗病基因Pik-s仍然没有被克隆。包含24个抗稻瘟病基因的单基因系，包括实物支付债券，Pik-m，Pik-p，Pik-h和Pik-s，并将用于鉴定稻瘟病菌的致病性[27]．

p和PIKP.对福建省稻瘟病菌表现出高度的抗性，可作为福建省抗性育种的亲本[28]．p，Piks.， 和PIKP.在中国四川和贵州均有中度抗药性[29]．p，Piks.， 和实物支付债券是中度耐药性，而p在中国广东省表现出高抗药性[30.]， 82份水稻种质资源中携带率为35.4%p通过分子分析[31]．八十九大水稻品种和育种材料携带实物支付债券基于PCR检测的福建省基因座[32]．不同的电阻谱实物支付债券，p，PIKP.，p和Piks.当实物支付债券从云南省收集的282次爆炸分离物中检测到轨迹[33]．的R基因的实物支付债券基因座对中国稻瘟病真菌具有高抗性。

进一步了解分子的进化AVR.该基因对抗病育种的发展、抗病基因在生产中的合理利用以及更有效的防治策略的部署具有潜在的意义。对于病原与寄主的长期互作，寄主利用抗性基因防止病原侵染;然而，病原体试图克服它们，并且病原体和宿主的共同进化在基因组水平上变得可辨[34，35]．病原体利用突变来适应新的宿主等位基因和环境，而其基因组结构是高度可变的并且受宿主选择的影响[15，36，37]．DNA序列变异分析AVR-PIK / KM / KP等位基因的M. Oryzae.田间分离将有助于了解抗性基因的有效性和持久性实物支付债券中国等位基因。

本研究的目的是分析DNA序列的变异AVR-PIK / KM / KP现场隔离等位基因M. Oryzae.了解的变化和共同机制m . oryzae AVR-Pik /公里/ kp等位基因和稻米实物支付债券云南省等位基因。

功效实物支付债券基因和检测频率AVR-PIK.等位基因

根据疾病的反应，疗效实物支付债券基因实物支付债券，p，PIKP.，p和Piks.被检查。从云南省不同水稻产区采集的366株分离株中，筛选出具有代表性的276株和83株，其中223株、256株、154株、276株和83株对稻瘟病菌均有毒力实物支付债券，p，PIKP.，p和Piks.含IRBLk-K、IRBLkm-Ts、IRBLkp-K60、IRBLkh-K3和IRBLks-F5的水稻单基因系1）.对实物支付债券，p，PIKP.，p和Piks.分别为60.9、69.9、42.1、75.4和22.7%，其余143、110、212、90和283株菌株对相应的R基因（表格1）.366年的隔离,AVR-PIK / KM / KP278的等位基因被扩增AVR-PIK / KM / KP（AVR-PIK.引物(pex31F/pex31R)1）和平均百分比AVR-PIK / KM / KP等位基因为76.0％。最高百分比AVR-PIK / KM / KP90.3％是90.3％M. Oryzae.从云南东北北部收集的人口，而云南西北部的最低百分比为66.7％（表1）.的百分比AVR-PIK / KM / KP中央，东北，西北，东南，西南，西南，西南，云南，77.8，90.3,66.7,72.7,89.3和68.3％。同样，百分比AVR-PIK / KM / KP是74.5和77.0％Xian./籼稻（西） 和耿/粳稻（GJ)云南的水稻种植区。这些发现表明实物支付债券在云南大部分水稻产区，基因座在防治稻瘟病方面有不同的有效用途。

一本小说AVR-Pikh确定基因与之相关AVR-PIK / KM / KP等位基因

的AVR-PIK / KM / KP基因是一种具有342个核苷酸的效应基因，编码一个假定的分泌蛋白，在开放阅读框(ORF)的第一个外显子中具有一个57个核苷酸的信号肽[7]．总共10个AVR-PIK.单倍型，包括五个原始型AVR-PIK.等位基因AVR-PIK_D.（Genbank登录号AB498875）（H01），AVR-PIK_A.(AB498876) (H02),AVR-PIK_B.(AB498877) (H03),AVR-PIK_C.(AB498878) (H04),AVR-PIK_E.（AB498879）（H05）是基于201分离株的DNA序列组件（表2）.测序剩余的77个分离物，但它们具有双峰，并被除去以进一步分析。五个小说AVR-PIK / KM / KP鉴定出单倍型(H06-H10)。DNA序列装配的比对AVR-PIK / KM / KP来自201分离物的基因显示出外显子区域中的六个多态性位点，并且它们都不是信号肽区域（表2）.外显子区域的6个位点导致氨基酸替换(见表)3.）.而且，这是AVR-PIK / KM / KP预计201分离株中的等位基因序列组件以产生10个功能蛋白（表3.）.在这10个蛋白中，预测氨基酸变化在五个位置发生。除了具有[RK] CXXCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHXXXXXXXXHXXXXXXXXHXXXXXXXHH]基序的推定的分泌蛋白外，所有蛋白质发生了所有变化。3.；额外的文件1：图S1）。M78K的氨基酸变化是在六个分离物中发现的，所有这些都是在单体内线IRBLK-K中的毒性（用实物支付债券），irblkm-ts（与p），IRBLKP-K60（与PIKP.), IRBLkh-K3 (p）和irblks-f5（与Piks.） （桌子3.）.这一发现表明78 M氨基酸在毒力作用中起关键作用AVR-PIK / KM / KP / KH位点。H01、H07和H09单倍型分离株均含有毒力基因AVR-PIK / KM / KP / KH， H05和H08的分离株携带AVR-PIK / KM / KH在美国，H06的分离株存在AVR-PIKM / KH， H02和H03的分离株也存在AVR-Pikh因为这些分离物是对应的R基因（S）（表3.）.H04和H10菌株均克服了抗性实物支付债券等位基因在位点(表3.）.因此，新型的毒力基因AVR-Pikh是确定的，而AVR-PIK.等位基因的M. Oryzae.参与。10个单倍型并没有藏匿AVR-Piks因为分离物是单一的线IRBLKS-F5毒性（窝水Pi-ks.） （桌子3.）.包含的大约75个孤立物AVR-PIK / KM / KP / KH（频率为36.4％），包含55个分离物AVR-PIK / KM / KH(发病率为26.7%)，含4株AVR-PIKM / KH(发病率为1.9%)，50株菌株被控制AVR-Pikh（频率为24.9％）。大约17个分离物没有包含这些无流动基因（附加文件1：表S1）。总之，五个小说AVR-PIK.经基因座鉴定，91.5%的菌株被分离AVR-Pikh，广泛分布于中国西南部。

逐步进化和单倍型多样性AVR-PIK.基因座M. Oryzae.

在这10AVR-PIK.单倍型H01、H02、H03、H04、H05与原型相同AVR-PIK.等位基因的AVR-PIK_D.(加入基因库。AB498875),AVR-PIK_A.(AB498876),AVR-PIK_B.(AB498877),AVR-PIK_C.(AB498878),AVR-PIK_E.(AB498879)(表2),分别。88、37和39检出7个单倍型M. Oryzae.分别来自云南西部、中部和东北部。17例中检出6个单倍型M. Oryzae.10株云南分离菌株中检出3个单倍型M. Oryzae.10株单倍型中仅检测到1株M. Oryzae.云南西北部的孤立（表4）.发现10个和8个单倍型GJ和西多样性指数(DI)分别为0.79和0.75。云南东北、中部、西部、东南部、西南部和西北部的DI分别为0.78、0.68、0.65、0.62、0.54和04）.总之，DIAVR-PIK.云南的等位基因排序为:东北>中部>西部>东南部>西南>西北。的迪AVR-PIK.等位基因的GJ水稻种植区的情况与西稻米生长地区。

外显子中有六个核苷酸变异AVR-PIK.观察到等位基因（附加文件1：展开了图S1和表S2），并且开发了基于序列变化的单倍型网络（图。1）.四个微进化簇AVR-PIK.，AVR-Pikm，AVR-Pikp， 和AVR-Pikh在201株田间分离株中观察到(图。1）.五个原始AVR-PIK.等位基因AVR-PIK_D.(H01),AVR-PIK_A.（H02），AVR-PIK_B.(H03),AVR-PIK_C.(H04),AVR-PIK_E.(H05)参与网络。H01、H05、H07、H08和H09菌株对IRBLk-K均有较强的毒力实物支付债券)，而H02、H03、H04、H06和H10分离株对菌株均有强毒力实物支付债券（桌子3.；无花果。1）.H01，H05，H06，H07，H08和H09的分离物是IRBLKM-TS的无毒（有p)，而H02、H03、H04、H10分离株对菌株均有强毒力p（桌子3.；无花果。1）.H01、H07和H09分离株对IRBLkp-K60均有较强的毒力PIKP.），而H02，H03，H04，H05，H06，H08和H10的分离株是毒性的PIKP.（桌子3.；无花果。1）.H01、H02、H03、H05、H06、H07、H08和H09菌株对IRBLkh-K3均具有较强的毒力p)，而H04和H10分离株对p（桌子3.；无花果。1）.这些发现表明有四种不同的逐步进化模式(AVR-Pik、AVR-Pikm AVR-Pikp,和AVR-Pikh)。

可能的场景M. Oryzae AVR-PIK等级赖米实物支付债券等位基因相互作用和共同进化被构建(图。2）.的AVR-PIK.同族体H01 (AVR-Pik-D）来自祖先的M. Oryzae.基因。的实物支付债券等位基因,Piks.他不能识别这三个等位基因AVR-Pik-D(H01)、H07及H09;因此,其他实物支付债券等位基因,PIKP.，可以识别这三个等位基因，而改变等位基因H05 (AVR-Pik-E)和H08通过核苷酸取代而避免被识别，由无毒进化为毒力PIKP.（桌子2；无花果。2）.对于这种情况，另一个实物支付债券等位基因,实物支付债券可以识别5个等位基因，即，AVR-Pik-D(H01) 07, 09AVR-Pik-E（H05）和H08。然后，另一个AVR-PIK.等位基因H06是无法被识别的PIKP.和实物支付债券．接下来，米饭R基因p被识别出来AVR-Pik-D(H01) 07, 09AVR-Pik-E(H05)， H08和H06。然后,两个AVR-PIK.等位基因，即，AVR-Pik-A（H02）和AVR-Pik-B（H03）被推导出来无法识别PIKP.，实物支付债券和p．接下来，米饭R基因p被识别出来AVR-Pik-D(H01) 07, 09AVR-Pik-E(H05)进行,下半年,AVR-Pik-A（H02）和AVR-Pik-B(H03)。然后,两个AVR-PIK.等位基因，即，AVR-Pik-C(H04)和H10进化到五种生物都无法识别实物支付债券等位基因(表2；无花果。2）.这些模式显示了逐步演变AVR-PIK.和实物支付债券互动和共同进化。有趣的是,AVR-PIK.等位基因H07来源于H01，可被识别PIKP.，实物支付债券和p．因此，H07的改变的等位基因H06可以避免识别PIKP.和实物支付债券；接下来，H06的改变的等位基因H08可以避免识别PIKP.而从H08变异的H04等位基因则不会被这5种基因中的任何一种识别实物支付债券等位基因。同样，H09等位基因来源于H07，可以被识别PIKP.，实物支付债券，p和p；因此，改变的H09等位基因H02可以避免被识别PIKP.，实物支付债券， 和p（桌子2；无花果。2）.H05等位基因可以通过实物支付债券，p和p，而H05的改变的等位基因H04可以避免识别PIKP.，实物支付债券， 和p（桌子2；无花果。2）.这些结果表明AVR-PIK.位点的M. Oryzae.参与了互动和共同实物支付债券位点的M. Oryzae.在自然界。

选择压力AVR-PIK.在M. Oryzae.

确定自然选择压力AVR-PIK.在M. Oryzae.在云南，田岛的中立AVR-PIK.在M. Oryzae.基于201AVR-PIK.DNA序列，还有田岛的D被发现是1.19854（附加文件1:表S2)。结果表明AVR-PIK.可能是在强大的人口扩张或积极选择下。三种阳性选择模型的结果高度一致(图2)。3.）.滑动窗口显示了M8、M8a和M7模型下所有113个氨基酸的Ka/Ks值的分布(图4)。3.）.结果表明，46,47,48，第67和第78位点的Ka / ks值> 1，表明这些位点可能进行纯化选择。仅在201的成熟蛋白质区中观察到正面选择的位点 M. Oryzae.分离AVR-PIK.（图。3.）.结果表明，该氨基酸序列在信号肽中相对保守AVR-PIK.在M. Oryzae.．

来确认…的阻力实物支付债券本领域的等位基因，我们测定了幼苗和胰穗爆炸疾病，单身携带实物支付债券，p，PIKP.， 和p，由日本国际农业科学研究中心(JIRCAS)和国际水稻研究所(IRRI)于2015年在芒市、陆丰和彝良县的田间开发(补充文件)1:表S3)。结果表明，IRBLkm-Ts(与p），IRBLKP-K60（与PIKP.）和irblkh-k3（与p而IRBLks-F5(与Piks.)和IRBLk-Ka(与实物支付债券芒市县易感(附文件)1:表S3)。这些结果表明M. Oryzae.在人群中保持隔离AVR-PIKM / KP / KH基因。IRBLkh-K3 (p）在鲁丰和伊良耐药，单身系IRBLKS-F5（与Piks.），irblk-ka（与实物支付债券），irblkm-ts（与p）和irblkp-k60（与PIKP.)在陆丰县和宜良县易感，提示M. Oryzae.分离在人口港口AVR-Pikh．这些结果与PCR检测和致病性测定结果一致。

在这项研究中，我们发现了5个新的单倍型AVR-PIK.田间分离菌株的DNA序列M. Oryzae.来自云南各种水稻产区。许多毒性的分离物实物支付债券在云南采集的田间分离株中鉴定出含基因的水稻品种实物支付债券在一些水稻产区，由于广泛发展实物支付债券在中国。的实物支付债券已经部署了等位基因并在中国展示了高稻瘟病抗性[20.，22，32，39]．完全删除已发生AVR-PIK.野外孤立之间的序列M. Oryzae.来自不同的产米国家[15，16，这与我们的结果一致。从商品稻田中检测到的许多菌株含有AVR-PIK.表明,实物支付债券已经有效地预防稻瘟病疾病。在云南，水稻品种p，PIKP.，p，Piks.， 和实物支付债券分别对81.7、62.8、51.9、43.4和39.4%的分离株(282株)产生耐药性[33]．广东省146个分离株的相应值分别为88.4,39.0,0,1.4和57.5％[40]．这些结果表明实物支付债券等位基因在这些大米生产区域的影响有限。继续分析AVR-PIK.这些隔离物中的等位基因将有助于我们了解的进化机制AVR-PIK.并预测稳定性和有效性实物支付债券等位基因介导的自然条件下的抗性。

有效的DNA序列变异已经在几个端粒区域观察到AVR.基因（AVR-Pita1，AVR-PIA.， 和AVR-PII.)[7，41，42]．转座元件(TE)插入的最后一个外显子傻乎乎基因[9插入的pot3AVR-Pizt和AVR-Pita1所有这些都产生了新的有毒等位基因。根据DNA序列分析[8，43，44]，发现4种变异，分别为点突变、节段缺失、完全缺失(6.7%)和TE插入AVR-PIB，所有这些都会导致毒性功能的丧失[6]．在16个功能核苷酸多态性中的七种中发现了三种不同的表达曲线AVR-PIB基因[6]．这些发现表明M. Oryzae.使用转座子来改变的表达AVR.克服基因R基因。在本研究中，AVR-PIK.在云南大部分稻瘟病群体(76.0%)中均存在该基因1)，与湖南省稻瘟病分离株相似[45]．我们发现在蛋白编码区有更多的核苷酸变异AVR-PIK.等位基因，导致氨基酸的变化，表明存在强烈的选择压力AVR-PIK.云南等位基因。

在外显子区发现DNA序列变异AVR-PIK.根据6个变异核苷酸从云南采集的201株分离株中鉴定出10个单倍型(见表2)2）.五种新的变异氨基酸AVR-PIK.在本研究中鉴定了201个分离株的位点变异，从而发现了5个新的单倍型。根据对该变异株的毒力分析，H01、H02、H05和H07单倍型在现场分离株中较为常见。这一结果表明，这些单倍型的损失可能比其他等位基因的损失有更大的适应度损失M. Oryzae.人口。这些新的等位基因允许我们在不同的等位基因中构建一个更加正式的网络AVR-PIK.，发现了一些新的单倍型。我们还鉴定了201株具有[LI]xAR[SE][DSE]和[RK]CxxCxxxxxxxxxxxxH]基元的推定分泌蛋白AVR-PIK.等位基因(表3.)，这与Yoshida等人的结果一致[7]．分别有126、59、94和15个分离株在氨基酸位置H46N、P47A、G48D和A67D出现变异，分别有4个和6个分离株在氨基酸位置M78I和M78K出现变异(表1)3.）.结果表明，AVR-Pik/km/kp/kh蛋白中氨基酸位点变异最大的依次为第46、47、48、67和78位。

在植物和病原体的长期共同进化中，病原体AVR.基因已被同源植物所识别R基因并引发有效的防御反应。的分歧AVR.病原体的基因是由宿主塑造的R基因和改变环境条件。我们观察到DIAVR-PIK.是相似的西和GJ区域(表4）和变化AVR-PIK.之间的不同西- - -GJ越来越多的地区(表4）.这些结果表明，云南商品稻发生了适应性变异。

云南是亚洲水稻栽培品种多样化的中心之一栽培稻．三个野生物种由，O．officinalis和O．meyeriana也存在于该地区[46]．从田地收集超过5000种水稻种质并保存。其中，通过一组差分稻瘟病分离株表征了227种水稻，38和25中，含有稻瘟病抗性基因实物支付债券和p， 分别 [46]．观察到的日本田岛的D第1.19854号(补充档案1：表S2）表明AVR-PIK / KM / KP / KH基因座可能处于种群扩张或由同源物形成的纯化选择之下实物支付债券云南水稻种植区的基因座。大多数隔离进行AVR-Pikh和p在云南和广东两省均有高抗性。这种模式可能是由于p在水稻品种中广泛分布的抗病基因。这些结果与Zhai等人的结果一致[22]．

AVR-PIK.专门认识到实物支付债券和AVR-Pik直接物理结合Pik的n端螺旋结构域。这些观察结果被酵母双杂交和共免疫沉淀试验证实[15]．四个等位基因AVR-PIK.（AVR-PIK_D.，AVR-PIK_E.，AVR-PIK_A.， 和AVR-PIK_C.）在日本孤立的人群与米饭共存实物支付债券等位基因PIKP.，实物支付债券和p［15]．四个等位基因AVR-PIK.在中文中M. Oryzae.种群随水稻逐步进化实物支付债券等位基因PIKP.，实物支付债券，帕克姆，和Pkh［16]．高度可变实物支付债券观察到等位基因，并在两个AVR-PIK.的M. Oryzae.和实物支付债券在田野里发现了大量的水稻16]．这些观察结果表明AVR-PIK.已被主持人强烈针对[16]．在目前的研究中，我们发现了回避和逐步进化AVR-PIK.等级赖米实物支付债券等位基因相互作用和共同效果（表3.；无花果。2)，表明云南水稻品种多样性较高。的AVR-PIK.在寄主群体中，等位基因经常受到拮抗等位基因的选择。同样，来自巴西和孟加拉国的小麦感染谱系似乎在遗传上不同，并在转录组snp的群体基因组分析中显示出网状进化[47]．

逐步突变过程已被证明可以获得毒力尖孢镰刀菌f . sp。ciceris和柄锈菌striiformisf . sp。Tritici.［48，49，50.]．在本研究中，我们发现了一个重要的突变演变剧集AVR-PIK.等位基因和七个小突变演化模式（图。2）.替代的突变模式似乎通过偶尔突变似乎从毒力转化为毒力，并且效率更高（图。2）.这些结果可能是由于强烈的正选择压力施加的相应实物支付债券宿主和环境的等位基因。同样的,AVRL567可以通过导致氨基酸的一组逐步突变从无毒转换为毒力替换(51.]．逐步进化已经被观察到AVR-PIK.［15，16]．可能的演变AVR-PIK.本研究发现云南水稻种植区的水稻生长比预期的复杂。

我们通过使用201个分离液检测到现场群体中的五种新型单倍型，构建了一个复杂的网络AVR-PIK.等位基因，并评估其有效性实物支付债券云南水稻产区水稻等位基因研究。我们的发现支持功能性的前提AVR-PIK.拥有多样化的序列结构，可以通过多个站点变体避免主机识别。单倍型H10源自常用的H2单倍型，H4源自H5和/或H8。这些单倍型可以克服所有检测到的实物支付债券迄今为止的等位基因。虽然H4和H10单倍型具有低频率，但由于其在背景中丰富的高度增加，因此野外群体中这两种等位基因的监测是至关重要的实物支付债券包含水稻品种。管理必须延缓对等位基因的选择，可能通过避免其在农业实践中的增殖来实现。blast发生的预测应基于多位点等位基因的频率和分布，如:实物支付债券和AVR-PIK.，在现场条件下的孤立群体中。

水稻品种，真菌分离，培养和致病性测定

的实物支付债券，p，PIKP.，p， 和Piks.结果表明，含IRBLk-K、IRBLkm-Ts、IRBLkp-K60、IRBLkh-K3和IRBLks-F5的水稻单基因系和易感回交亲本李江新团黑谷(LTH，不含实物支付债券)用于致病性测定(种子原购自日本国际农业科学研究中心，该中心对植物材料进行了正式鉴定。种子保存于云南省农业科学院植物种质资源库。共收集366株菌株，纯化单孢子并进行检测。所有分离株在−20℃的滤纸上储存，并在室温下在含有燕麦琼脂的培养皿中生长，在蓝色和白色荧光灯下产生孢子。如Jia等人所述，疾病反应是用改进的标准致病性测定法测定的。[52.]．具体地，在3-4-叶阶段的水稻幼苗置于塑料袋中并用1-5×10的孢子悬浮液洗涤⁵孢子/毫升。接种后，将塑料袋密封以保持较高的相对湿度(90-100%)24小时，然后将植株从塑料袋中取出。随后，这些植物在温室中再保存6天，以使其出现疾病症状。根据第二小叶片上的病变数量和程度，使用0-5级疾病级别对疾病反应进行视觉评级。0-1表示抗性，2表示中抗性，3-5表示敏感。每次使用5棵幼苗，重复试验1次，用平均病害评分来确定抗性和敏感性。

DNA制备，PCR扩增和DNA测序

真菌分离株在25℃下在完全液体培养基中生长六至8天，以在暗条件下产生菌丝体。然后使用十六烷基三甲基铵（CTAB）方法从菌丝体中分离DNA [53.]．引物PEX31F（5'-TCGCCTTCCCTTTTTA-3'）和PEX31R（5'-GCCCATGCATTTTTTAT-3'）用于放大AVR-PIK.使用Yoshida等人的方法进行测序[7]．具体来说，采用2× Taq PCR MasterMix(天根生物技术有限公司，北京，中国)进行PCR。每个PCR包括以下组件:25μl Taq PCR反应混合液(包含25 U的Taq DNA聚合酶,10 x Tiangen PCR缓冲,MgCl2 15毫米,和每个核苷酸)200μM, 1μl每10μM底漆,2μl真菌的基因组DNA, 21μl蒸馏水(Tiangen工具包中提供)。反应进行Bio-Rad热循环(C1000 Bio-Rad实验室、生命科学研究、钙、美国)与PCR程序如下:1在95°C周期3分钟首次变性,紧随其后的是29日周期在95°C 30年代,60°C 30年代,30年代和72°C和最后一个在72°C变性7分钟。所有pcr检测重复3次(检测20 μl，测序50 μl)。扩增片段的大小用DL2000 DNA Ladder(天根生物技术有限公司，北京，中国)进行估算。PCR产物用上述引物测序，进行PCR扩增。DNA由上海生命科技生物技术有限公司(中国上海)进行测序。每个分离物的扩增子测序三次。

电阻的评价实物支付债券领域的等位基因

单基因系IRBLk-Ka、IRBLkm-Ts、IRBLks-F5、IRBLkp-K60和IRBLkh-K3(携带实物支付债券，p，Piks.，PIKP.， 和p分别于2015年分别种植在云南省云南省鹿府和宜良县的田间。幼苗和茎被爆炸疾病进行调查，评价抵抗力。

数据分析

DNA序列的AVR-PIK.采用Vector NTI V.10软件套件(Invitrogen公司，Carlsbad, California, USA)组装，并使用DNASTAR V7.10软件(http://www.dnastar.com/）.DNA单倍型和多态位点的数目(π)，滑动窗口采用dnnasp v5.10.01软件计算[54.]．单倍型网络分析采用TCS1.21 (http://darwin.uvigo.es/)[55.]．DI按照Fontaine等人的方法计算稻瘟病菌群体中单倍型或蛋白型的频率[38: di =(1-∑.ⁿ_{i = 1}p_我²），其中PI是人口中单倍型I的频率。使用Mega V5.10进行Tajima的中性测试。使用选择服务器程序进行阳性选择的分析（http://selecton.tau.ac.IL.）.在AVR-Pik查询下，采用3个模型进行正向选择位点识别:M8 (positive selection enabled, beta + w≥1)、M8a (beta + w = 1, null模型)和M7 (beta, null模型)。然后将数据导入Microsoft Excel进行统计分析和绘制滑动窗口。

AVR:

非病原性基因

CTAB:

溴化十六烷基trimethylammonium

迪:

多样性指数

GJ：

耿/粳稻

K a：

非同义替换的速度

ks：

同义词替换的速度

摘要:

Lijiangxintuanheigu

子:

开放阅读框架

接待员:

电阻

TE:

可转换元素

xi：

西安/籼

作者感谢Michael A Fullen教授(伍尔弗汉普顿大学)的有益讨论和对手稿的校对。

资金

国家自然科学基金资助项目(no . 31460454);云南省科学技术厅项目(no . 2015HB076, no . 2017FA013);国家重点研发计划项目(no . 2017YFD0200400)。资助方不参与研究设计、数据收集、数据分析、数据解释、手稿撰写或决定发表。

可用性数据和材料

新颖的核苷酸序列AVR-PIK.来自这些分离株的等位基因已被沉积在GenBank（登录号：MK327186至MK327190; J. Li等，未发表）。

从属关系

1. 云南农业科学院农业环境与资源研究所，昆明，昆明

   金斌李，宫王，云清碧，薛富罗泉王

2. 云南农业大学农业生物多样性与有害生物防治教育部重点实验室，昆明

   Chengyun李

贡献

JL构思了这个想法并进行了实验和分析;QW，YB，XF和RW进行实验和分析;JL和QW起草了手稿;和CL修订了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于Jinbin李．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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