基于rna测序的EST-SSR标记开发E. Sibiricus.并在系统发育关系分析中的应用Elymus.物种

背景

Elymus.L.是Tribe Triticeae Dumort中最大的属。包括大约150种广泛分布于世界的温带地区的多倍多年生物种。它被认为是改善谷物作物的重要基因库。然而，分子标记的短缺限制了遗传育种的效率和准确性Elymus.物种。高通量转录组测序数据对于基因发现和分子标记发育至关重要。

结果

我们获得了转录组数据集E西伯利亚，属的类型的种类披碱草，并确定总共8871个unigenes的推定EST-SSR。三核苷酸是主要的重复基序（4760,53.66％），其次是二核苷酸（1993,22.47％）和单核苷酸（1876,21.15％）。最占优势的三核苷酸重复基序是CCG / CGG（1119,23.5％）。PCR产品的测序显示来自不同的序列等位基因Elymus.物种与原始SSR基因座同源，设计了底漆的原始SSR基因座。在重复区域中观察到不同类型的三重复作为丰富的SSR主题。设计并选择两次EST-SSR引物对以扩增10个DNA样本Elymus.物种。87对引物(43.5%)扩增出清晰、可重复的条带，条带大小符合预期要求，且具有较好的可移植性Elymus.物种。最后，30个引物对成功扩大了十七九十五个Elymus.物种，并检测到大量多态性。一般来说，六倍体Elymus.具有基因组的物种StStHHYY具有相对较高的遗传多样性水平（H = 0.219，i = 0.330，％P= 63.7)，是四倍体Elymus.具有基因组的物种ststyy遗传多样性水平较低(H = 0.182, I = 0.272， %P = 50.4) in the study. The cluster analysis showed that all ninety-five accessions were clustered into three major clusters. The accessions were grouped mainly according to their genomic components and origins.

结论

这项研究表明，转录组测序是一种快速和经济有效的分子标记开发方法。这些EST-SSR标记是研究植物遗传多样性、进化和分子育种的重要工具E. Sibiricus.， 和别的Elymus.物种。

小麦族。,A.NEConomically important tribe in the grass family (Poaceae), contains three important cereal crops closely related to human life and civilization, namely, wheat (Triticum aestivum.l .),大麦(大麦芽和黑麦(Secale Cereale.L.)，以及许多有经济价值的牧草，如冠状麦草(Agropyron Cristatum.L.），瓶装草（hystrix patula.), sheepgrass [莱姆萨山(指标)。Tzvel。),和西伯利亚野生店（Elymus sibiricus.L.）[1.]．Elymus.L.是小麦族中最大的一个属。,ENCompassing approximately 150 polyploid perennial species widely distributed in the temperate regions of the world [2.,3.]．不同的起源和生态生境可能导致不同物种之间和内部的遗传变异Elymus.可以捕获和用于植物育种和改善计划的物种和种群[4.,5.]．

作为物种的主要模式之一，多倍体（AutopolyPLoidy和AllopolyPLoidy）是一种自然的杂交过程[6.]．众所周知Elymus.通过不同属的代表杂交而产生[2.,7.]. 以前的细胞学研究表明，五个基本的基因组(英石,H,Y,P和W)由不同的二倍体物种构成Elymus.物种 [8.]．不同种类的基因组成案和不同物种的长期分化Elymus.形成一个网状演化的模式，具有富遗传基础，而不是他们的二倍体父母[9,10]．的Elymus.因此，物种是研究多倍体物种形成机制和进化模式的理想材料。亚洲是水稻的主要产地和遗传分化中心Elymus.[11,12]．许多Elymus.物种如E. Sibiricus.和大肠高寒草场在蒙古，喜马拉雅山和西部和北方的西部地区出现[13]．以前的研究主要专注于之间的分类Elymus.以及其亲缘关系、起源决定的祖先种类包括英石,H和Y基因组，基于细胞遗传学和分子序列的基础基因组之间的演化关系[12,14,15,16]．关于不同的分子系统发育和遗传结构的信息Elymus.物种是有限的，但种质收集，保护和利用是必要的。不同的系统发育关系和遗传成分Elymus.由于对特定或独特的核基因序列的检测能力有限，物种在很大程度上是未知的[9,10,12,17,18,19]．系统发生相关物种之间的遗传多样性分析是基于可转移和正交分子标记的发展。表达序列标签衍生的简单序列重复标记（EST-SSRS）是选择标记，因为它们是丰富的，共同占优势，高度多态性，并且在系统发生相关的物种中易于转移[13]．在先前的研究中，开发并注释了三个表达的序列标签（EST）文库Pseudoroegneria spicata，两者的混合物大wawawaiensis和E. lanceolatus.和A.Leymus cinereus×l . triticoides三种混合[20.]．从三个多年生二倍体妥哚种类开发的EST-SSR引物用于在这三种物种中产生扩增子，并且源自来自的EST-SSR引物薄胆汁Bessarabicum和Th。elongatum有更大的相互转移性比那些源自st -基因组Pseudoroegneria spicata由于J^B和J.^E基因组(21]．此外，EST-SSR标记在许多作物和牧草的亲缘关系分析、遗传作图和DNA指纹分析中具有重要意义[13,22,23,24,25,26,27]．Mott等人。基于的简单序列重复标记Elymus.表达序列标签序列，并使用了23个最多晶型SSR的子集来分析七北美的遗传多样性Elymus.,伪纪念碑和Pascopyrum物种 [28]．

近年来，新一代测序技术(NGS)的出现，特别是转录组测序技术的出现，为识别微卫星位点提供了一种经济有效的方法[23,29,30.]．你。在芋头确定了5278个SSR（香芋)转录组数据，最后利用62个多态性标记进行芋头遗传多样性研究[31]．我们之前的转录组测序E. Sibiricus.已经产生并确定了185,523个未成年人和超过30,000名差异表达的转录物（DETS），其为本研究中发育了EST-SSR标记的重要遗传资源和序列信息[32]．

该研究的目标是（i）开发EST-SSR标记E. Sibiricus.转录组测序并验证不同的转移性Elymus.物种;（ii）评估17个多倍体中的遗传多样性和遗传关系Elymus.基于发发EST-SSR标记的物种;（iii）阐明系统发育关系和遗传分化st,st和酸软基因组Elymus.物种。表征遗传成分内部Elymus.基因组将有助于了解多倍体物种中的起源和演化机制。

EST-SSR标记的频率和分布

在De Novo集会之后，总共获得了4,598,845个Contig。配对末端读数的未成年人数为135,433。unigenes的总长度为97,059,505，平均长度为716.66bp和n50值1269.在135,433个unigenes中，109,476个未成年人（80.83％）的长度为200至1000 bp，长度为21,630（15.97％））范围从1000〜3000 bp，4327个unigenes（3.20％）超过3000 bp。unigenes的长度分布显示在附加文件中1.：图S1。在135,433个上未进，57,756（42.65％）未在至少一个数据库中成功注释（表1.）.根据Nr注释，大多数BLAST命中是从Aegilops Tauschii.（22.38％），其次是大麦芽（18.01％）和Triticum Urartu.（12.88％）（附加文件2.:图S2)。

从6685个单基因中鉴定出8871个推测的EST-ssr（表1）2.）.每6.2 kB发现一个EST-SSR的平均值。在这些潜在的SSR中，鉴定了六种类型的基序，其中三核苷酸（4760,53.66％），二核苷酸（1993,22.47％）和单核苷酸（1876,21.15％）是最丰富的SSR（图。1）.具有五个串联重复的EST-SSRS（40.71％）是最常见的类型，其次是六（23.48％），十（12.95％），七（7.49％），十一（5.16％），八（3.29％），九（2.25％）和12（2.04％）串联重复。剩余的串联重复小于1％。在鉴定的SSR中，最常见的三核苷酸重复基序是CCG / CGG（1119,23.5％）和AAC / GTT（836,17.6％），而AG / CT（816,40.9％）和AC / GT的基序（796，在二核苷酸重复中表示39.9％（图。1 b）.

新型EST-SSRS的开发和可转让性

设计并选择两种EST-SSR引物对以扩增十种选定的DNA样品。87对引物(43.5%)扩增出清晰、可重复的条带，条带大小符合预期要求，且具有较好的可移植性Elymus.种44个引物（22%）产生非多态性条带。18个引物（9%）产生大小不一的条带，其余51个引物（25.5%）未产生条带。最后，利用30个多态性EST-ssr对480个玉米品种进行了遗传多样性分析Elymus.个体植物。

验证不同物种的重复主题类型

确定EST-SSR引物的真实性，从17种不同的扩增子Elymus.测序两个EST-SSR的物种。在所有情况下，来自不同的顺序等位基因Elymus.物种与原始SSR基因座同源，设计了底漆的原始SSR基因座。17个标记多态性Elymus.SSR序列重复次数的变化是导致种数变化的主要原因。根据引物c11036预期条带的测序结果，E. Sibiricus.有5个TAG重复，其余16个物种有2个TAG重复。底漆c69822,E.古董有8次GCA重复，大肠高寒草场,E. Ciliaris.和大肠panormitanus有三次GCA重复，E. Sibiricus.有五个gca重复，剩下的十二次Elymus.物种有六个GCA重复（图。2.和3.）.

StH、StHY和StY基因组组合的遗传多样性分析

30对EST-SSR引物共扩增出572个条带。扩增条带数从5个(c11036)到25个(c66150、c67290、c68713)，平均19.1个(表1)3.）.多态频段的百分比Elymus.物种100％。预期的杂合性（HE）的范围为0.73至0.95，平均为0.92。观察到的杂合性（HO）的范围为0.89至1.00，平均为0.98。多态性信息含量（PIC）值范围为0.28（C61134和C69822）至0.43（C68713），平均为0.36。

一般来说，六倍体Elymus.具有基因组的物种StStHHYY具有相对较高的遗传多样性水平（Na = 1.637，Ne = 1.369，H = 0.219，i = 0.330，％P= 63.7)，是四倍体Elymus.具有基因组的物种ststyy基因组的遗传多样性水平较低（Na = 1.504，Ne = 1.309，H = 0.182，I = 0.272，％P= 50.4)4.）.在物种级别，发现了最高水平的遗传多样性E. Clasindrics.(Na = 1.734, Ne = 1.398, H = 0.239, I = 0.363， %P = 73.4），然后是大肠高寒草场(Na = 1.633, Ne = 1.368, H = 0.218, I = 0.329， %P = 63.3) andE. Sibiricus.（Na = 1.573，Ne = 1.331，H = 0.197，i = 0.297，％P = 57.3). The lowest level of genetic diversity was found inE.古董只有两个人（Na = 1.309，Ne = 1.219，H = 0.128，i = 0.187，％P = 30.9). Further, we compared the genetic diversity among different geographical groups in大肠高寒草场和E西伯利亚。为了E西伯利亚，西天山类群具有较高的遗传多样性(Geo-7, H = 0.230， %P = 66.7%), the lowest level of genetic diversity was found in Mongolian Plateau group (Geo-2, H = 0.183, %P = 52.4%). For大肠高寒草场新疆天山（Geo-12，H = 0.234，％）发现了最高遗传多样性水平P= 68.9%)，遗传多样性最低的是青藏高原东南部类群(Geo-9, H = 0.208， %)P = 59.8%).

聚类分析表明，95份材料均聚为三大类（图1）。4.）.集群1包含30个st, 13酸软和1st基因组登记入册。集群2包含16个酸软基因组登记入册。集群3包含16st和19酸软基因组登记入册。在主坐标分析（PCOA）中观察到的结果与集群分析一致。前三个主要成分解释了总变异的23％。释放不同基因组之间的中等但清晰的分离（图。5.）.根据PCOA结果，两种物种，E. Nevskii.和E. longearistatus有一个紧密的遗传关系。四酸软基因组物种(E. Clasindrics.,E. Dahuricus.,E精益求精和E. Tanguteum.)形成一个群体，并与一些StY基因组物种有更密切的遗传关系(Figs。4.和5.）.

此外，利用分子方差分析(AMOVA)分析了不同品种、物种和基因组之间和内部的方差成分。结果表明，10%的变异发生在种间，90%的遗传变异存在于种内(90%)(表1)5.）.尽管基因组不同，但在内部存在超过80％的差异Elymus.登记入册(86%st，83％的人酸软81%的人st分别），虽然少于20％的遗传学中存在。

Mantel测试用于研究遗传信息与环境因素之间的相关性，包括地理距离，纬度和高度。9999排列的回归分析显示了NEI的遗传距离和地理距离之间的强正相关性（R = 0.2086,P< 0.01)(图6.）.在物种水平上，遗传多样性与纬度、海拔无显著相关性。有效等位基因数(Ne)、Nei’s遗传多样性(H)与纬度(H)呈正相关。R = 0.3608,P < 0.05 andR = 0.3734,P< 0.05)酸软基因组accessions。但是Ne和H与海拔地区进行了否定相关性（R=−0.3181,P < 0.05 andR=−0.3413,P< 0.05)。7.）.

遗传结构和遗传分化分析

来自95的480人的遗传结构Elymus.使用结构软件分析了附加。基于最大可能性和k（ΔK）值，最佳组数为2。

如图1所示。8A,E. Sibiricus.(st）可以轻松地与其他十六分离Elymus.物种st和酸软基因组。我们进一步研究了这些内部遗传结构Elymus.物种。E. Sibiricus.accessions被分配到四个子组。十一st基因组物种被分配到同一组。剩余的加入酸软基因组被分配到其他组。遗传结构与地理起源关系不明显Elymus.加入。例如，来自Geo-2地理团体的二十三个加入的人被聚集成两组。

基于结构分析的结果，使用饼图提出了每种加入的遗传分量（图。8B.）.基于不同基因组内的不同遗传成分，在介质中发现了最高的遗传距离st和st基因组（0.0416）（图。8C.）.尽管酸软基因组具有类似的遗传距离st（0.0253）和st（0.0208）。此外，我们进一步调查了七个中可能的祖先起源E. Sibiricus.七大肠高寒草场组（图。8D.）.地理群：Geo-1，Geo-4，Geo-5和Geo-7各有超过50％的相同遗传成分。特别，E. Sibiricus.兴江天山（Geo-5）集团的遗传组成部分的遗传组成部分。为了E. nutans，一些地理团体具有类似的祖先起源，例如，来自青藏高原东部的地理8和地理9，共用超过65％的遗传成分（Geo-8的65.2％，Geo-9的75.8％）。与其他地理群体相比，来自俄罗斯（Geo-14）的祖先的原产地不同。

基于MATLAB的EST-SSRS开发E. Sibiricus.转录组数据库

在E西伯利亚，由于缺乏有效的分子标记系统，在其他饲料物种后面的标记辅助选择（MAS）和分子育种。由于它们的高多态性，高丰度，共同主导和基因组分布，简单的序列重复（SSR）标记被认为是植物遗传和育种研究中最重要的标记系统之一。与基因组SSRS相比，表达序列标签衍生的简单重复标记（EST-SSR）由于该区域比非编码序列更具进化节保守而在相关物种之间容易地转移。一些先前的研究报告说，在Triticeae中的几草进行表达序列标签（EST）和简单序列重复（SSR）标记的开发。使用杂种的杂种制定了一个10,368个EST的图书馆，包括442个SSRSElymus lanceolatus.和E. Wawawaiensis.[20.]．到目前为止，只有45,580个EST序列Elymus.物种被纳入国家生物技术信息中心（NCBI）数据库。近年来，转录组测序（RNA-Seq）等新一代测序技术的出现，为大规模EST-SSR标记的鉴定和开发提供了一种快速、可靠、经济的工具[33]．这些来自RNA-Seq的EST-SSR标记可用于遗传多样性分析、构建遗传连锁图谱、标记辅助选择育种等[25,26]．转录组分析的研究较少E西伯利亚，物种的类型Elymus.属。在该研究中，在135,433个组装的Unigene序列中，确定了8871个潜在的EST-SSR。EST-SSR频率为4.94％，高于羊草（4.38％）和大米（3.57％）[30.,34]．每6.20 kB分布密度为每6.20 kB，高于之前的报告莱姆萨山（1 / 10.78 kB）和Medicago Sativa.（1/12.06 kB），但低于Paeonia suffruticosa.(1/9.24 kb)Melilotus Albus.（1 / 3.99 kB）[30.,33,35,36]．对于表达序列标签的SSRS频率差异的一些可能的解释可能是各种工厂物种，SSR搜索标准的不同遗传基础，以及所使用的采矿工具。在许多生物中，在编码序列中的缩放蛋白重复的广泛分布是选择效果的迹象，表明这些SSRS是针对可能的框架突变[30.]．在本研究中，从135,433个unigenes中检测到8871个潜在的SSRs，从单核苷酸到六核苷酸的核苷酸重复。三核苷酸重复序列是最丰富的SSR基序。其中CCG/CGG以三核苷酸重复序列为主，AAC/GTT次之，这与之前在水稻、大麦、小麦和羊草中的报道相似[30.,37]．Kantety等。据报道，二核苷酸重复基序在来自各种谷物种类的eST中存在于诸如Ga / Ct和GC / CG的诸如GA / CT和GC / CG的常见频率中[38]. 然而，在我们的研究中，AG/CT（40.9%）是最丰富的双核苷酸重复序列E西伯利亚，与年度黑麦草相同[39]．我们的结果表明，饲料草和其他谷物物种之间的大多数频繁的主题重复可能会有所不同。此外，这些ETS-SSR标记从E. Sibiricus.转录组数据具有较好的可移动性Elymus.物种，建议这些EST-SSR标记是进一步遗传多样性分析和分子育种的有用工具Elymus.物种。

StH、StHY和StY基因组组合的系统发育关系

Elymus.是一种不同的地理上广泛的异聚类属，包括多种不同的基因组合组合。细胞学研究表明，五个基本基因组，即英石,Y,H,P和W在各种组合中构成Elymus.物种 [11]．在五种基本基因组中英石基因组衍生自伪纪念碑一个基本的基因组存在于所有物种中吗Elymus.物种 [40]．的H,P和W基因组源自属大麦,Agropyron和Australopyrum分别为麦科[12]．然而，准确的起源Y尚未识别基因组，尽管这种基因组存在于大多数亚洲人中Elymus.物种。以前的研究表明st基因组Elymus.物种是异源四倍体，它结合了伪纪念碑(英石),大麦(H)[2.,10]．异源六倍物种，酸软，可能经历两个杂交事件，结合英石和Y基因组形成四倍体st基因组，第二个杂交事件涉及的结合st和H基因组(12,18]. 不同基因组组合的遗传多样性分析将有助于理解不同物种间的进化过程和遗传分化。植物的系统发育关系st,st和酸软基因组Elymus.通过使用分子序列报道了物种[9,10,12,17,18,19]．在这项研究中，我们使用新开发的EST-SSR标记来分析17的系统发育关系st,st和酸软基因组Elymus.来自不同地理区域的物种。根据我们的结果，是六倍体酸软种间遗传多样性较高(H = 0.219， %)P= 63.7)，比其他两个四倍体物种(st， h = 0.197， %P= 57.3,st，h = 0.182，％P = 50.4). Two hybridization events of the酸软基因组种类可能导致遗传多样性更高。刘等。据报道，六倍体有两个基因组类型的其序列，而所有四倍体Elymus.物种只有一种基因组类型的ITS序列，这表明六倍体Elymus.物种具有更高水平的遗传多样性[12]．此外，我们的结果表明三种基因组之间具有显着的异质性Elymus.基于est - ssr的物种。聚类分析显示，所有的供试材料被分为三个主要聚类。一般来说，根据不同的基因组构成，绝大多数的遗传材料都可以很容易地加以区分。而基于EST-SSR标记的系统发育树也显示了多倍体在进化过程中的多个起源Elymus.物种。例如，不同的accessions酸软基因组种类在不同的簇中聚集，这可能表明多倍体属的不同母体谱系。ST基因组的系统发育关系Elymus.L.基于一个核DNA和两种叶绿体基因的Sensu Lato显示出来伪纪念碑和大麦用作ST和H基因组二倍体祖先，伪纪念碑作为st基因组的母体供体Elymus.Sl[40,41]．同时，核苷酸多样性水平和模式的差异红细胞L基因意味着该物种的St基因组谱系Elymus.s。湖具有不同的进化潜力[41]．在这项研究中，所有95Elymus.由于共享的ST基因组，所以进入且遗传相似度伪纪念。所有E. Sibiricus.加入和十三大肠高寒草场进入群体1分为1，表明两种物种具有更接近的遗传关系。E. Sibiricus.和大肠高寒草场共享ST和H基因组。此外，之前的系统发育关系Elymus.基于其和叶绿体TRNL.-f序列还提出了英石和Y基因组可能具有相同的原点[12]．在这项研究中，几乎所有来自亚洲的STY基因组种类都被分组在一起。先前的研究表明，9种STStyy基因组种类包括E.Abolinii，E.Ciliaris，E.gmelinii，E. Longearistatus，E.Nevskii，E. Semoxtatus与100引导价值一起分组，并建议亚洲人ststyy四倍体可能代表一个单一的进化谱系和随后的渐渗[42]．杂交和多倍化是本体多样性和演变中的主要动力披碱草。不同祖传二倍体属之间的杂交形成了新的全多肽物种[7.,17]．多倍体是生物进化和物种形成的主要机制Elymus.物种通过诱导基因组复制、基因表达，增加调控网络的复杂性，形成不同的基因型和表型以适应不同的生态位(特别是在高海拔和高纬度地区)[43,44]．虽然这一点Elymus.物种具有不同的基因组组合，在不同物种之间存在基因流动（NM）（16.07st和酸软6.65,st和st， 11.72酸软和st)表明三个基因组之间不存在严格的生殖障碍。

保护的意义

表型和基因不同的种质是一种潜在的有价值的来源，用于改善所需的农艺特征[13]．野生种质可以提供有益的等位基因，如改善的应力耐受性，饲料质量和更高的产量，以通过杂交和渗入改变目前使用的品种。野生相对物种的丰富和特异性种质资源的收集和保存将有益于优异的性状和特殊抗性基因的利用[1.,4.,5.]．根据Amova分析，在内部发现较大的遗传变异Elymus.物种。这一结果与先前的遗传学研究一致Elymus.发现大多数变异的物种在群体或地理区域内分配[45]．因此，相当大量的整体遗传变异Elymus.在取样更多的植物时可以捕获物种Elymus.人口。同时，Mantel测试表明，Nei的遗传距离和地理距离之间具有强烈的正相关性（R = 0.2086,P < 0.01) was found forElymus.结果表明，在较宽的地理区域内可以捕获到更多的遗传多样性和变异。结果表明，青藏高原和天山地区的遗传多样性较高。因此，这些具有丰富遗传多样性的野生资源可以作为未来重要的遗传资源加以利用Elymus.育种计划。

本研究开发了87个多态性EST-SSR标记Elymus.物种。其次，30个EST-SSR标记用于分析17个遗传多样性的遗传多样性Elymus.物种。我们的结果表明六倍倍增Elymus.具有基因组的物种StStHHYY具有相对较高的遗传多样性水平，而四倍体Elymus.具有基因组的物种ststyy遗传多样性较低。群集分析表明，所有95种附加都集中成三个主要集群。载体主要根据其基因组成分和起源进行分组。通常，该研究表明转录组测序是一种快速且经济有效的分子标记发育方法。本研究开发的这些EST-SSR标记是遗传多样性，进化和分子育种的宝贵工具E. Sibiricus.， 和别的Elymus.物种。

源自转录组的EST-SSR标记的开发E. Sibiricus.

我们前期的研究构建了cDNA文库，并对脱落带组织样本进行了测序E. Sibiricus.基于下一代测序（NGS）[32]．获得的原始reads (NCBI SRA: SRX2617497)经过预处理，使用FASTX工具包过滤适配器序列、低质量序列和质量低于Q30的reads。使用Trinity程序组装从头转录组clean reads [46]. 在简单序列重复鉴定工具程序（MicroSatellite）中直接鉴定组装的单基因序列，其中单、二、三、四、五、六核苷酸基序的参数设置为最小重复数分别为12、6、5、5、4和4。利用引物3设计EST-ssr(http://primer3.sourceforge.net.)基于MISA结果。

植物材料用于遗传多样性分析

共有九十五的六十五Elymus.收集物种，其中包括基因组的30分泌物st（2N = 4× = 28), forty-eight accessions with genomes酸软（2N= 6× = 42)和17份基因组遗传st（2N = 4× = 28). A total of 480 individual plants were included. Materials were obtained from the U.S. Department of Agriculture Germplasm Resources Information Network (GRIN) and Lanzhou University. These accessions originated from their primary distribution areas in Asia with a broad latitudinal (29.2° to 54.8° N) and elevational (40 to 4460 m) range. Particularly, a total of 156E. Sibiricus.(st基因组）各个植物被分成七个地理群，具有不同地理起源，包括东海藏高原（Geo-1），蒙古高原（Geo-2），贝加尔湖（Geo-3），西阿尔泰山脉（Geo-4），新疆天山（Geo-5），俄罗斯东海岸（Geo-6）和西部山（Geo-7）（表格4.和无花果。8.）.共234岁大肠高寒草场(酸软青藏高原东北(Geo-8)、青藏高原东南(Geo-9)、青藏高原西南(Geo-10)、蒙古高原(Geo-11)、新疆天山(Geo-12)、巴基斯坦(Geo-13)和俄罗斯(Geo-14) 7个地理类群。

用于验证不同物种重复基序类型的植物材料

17个代表三种基因组的单个植物（st,st和酸软）用于验证EST-SSR标记。这些载体包括PI639859，PI619589，PI499585，PI564957，PI 63649，PI531575，PI65100，PI 410282，PI 564944，PI 632570，PI254866，PI564964，WETI4，WECY3，WEDA5，WEEX1和WETA2。

DNA提取和基因分型

所有材料的种子在温室（25/15°C昼/夜温度）中发芽至8 几周大了。收集480个个体的幼叶组织进行基因组DNA提取（十二烷基硫酸钠，SDS法）[13]．每次加入都以1到9个个人代表，平均为5.1（表中的详细信息4.）.使用NanoDrop ND1000分光光度计(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)和琼脂糖凝胶电泳测定DNA样品的数量和质量，然后稀释至25 ng/μL，在−20℃保存。

两百EST-SSR底漆对从8871个潜在的SSR中随机选择，并由上海桑松生物工程技术（中国上海）合成。共有20个单独的植物17Elymus.选择物种用于引物筛选。每次引物被扩增两次以检查它是否产生清晰可再现的带。最后，使用具有高可转移性，多态性和重复性的EST-SSR用于基因型480个个体植物。如谢等人所述，进行PCR扩增和EST-SSR基因分型以及Eletrophoresis。[47]．

数据分析

扩增的条带被认为是存在的（1），并且不存在（0），并且仅考虑透明和可重复的带。预期的杂合性（HE），观察到的杂合性（HO）和多态性信息含量（PIC）值被计算为先前的方法[13,48]．预期的杂合子配方如下：他 = 1- ∑PI.^2.,在那里PI.是频率我对等位基因。通过直接计数方法确定杂合子的数量。根据公式计算每个引物的PIC：pic= 1 -P^2.–Q^2.,在那里P现在频带的频率是多少Q是缺失频带的频率。采用POPGENE v 1.31程序(Edmonton, AB, Canada)计算观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s遗传多样性(H)、Shannon’s信息指数(I)和多态位点百分率(% P)等遗传多样性参数[49]．基于PowerMarker v 3.25支持的操作，使用MEGA v 5软件显示邻居连接(NJ)树，其中每个节点的概率通过使用1000个重复的引导分析进行评估[50,51]．在Genalex V 6.5中构建了主要坐标分析（PCOA）[52]．基于9999排列的Mantel试验，通过Genalex V 6.5计算成对遗传距离与调整成对地理距离之间的相关性。人物关系分析用于测试遗传参数（NE，有效数量和H，Nei的遗传多样性）和环境因素（纬度和高度）之间的相关性。使用Genalex v 6.5研究了分子方差（Amova）的分析来研究种类内和种群内的基因组的总遗传变异。程序结构V 2.3.4用于使用Markov链蒙特卡罗（MCMC）算法分析四百八十个体的遗传结构。假设混合物模型样本和相关等位基因频率，为所有人执行20个独立运行K值（范围为1到11），每个值为10,000 mcmc相互作用和10,000个复制。三角洲K采用方法来确定最佳方法K所有数据集的值[53]．

Amova：

分子方差分析

依据:

差异表达的成绩单

EST-SSR：

表达序列标记衍生的简单序列重复标记

H：

Nei的遗传多样性

他:

期望杂合度

何：

观察到的杂合性

一世：

香农信息指数

na：

等位基因数量

不:

有效等位基因数

ngs：

下一代测序

PCoA:

主坐标分析

照片：

多态性信息内容

这项工作得到了中国国家基础研究计划（2014CB138704）、长江学者和创新研究团队（IRT13019）、中国国家自然科学基金（31302023）和111计划（B12002）的支持。

资金

本研究得到了中国国家基础研究计划（973计划）（973年计划）（2014年第2014CB138704），中国国家自然科学基金会（第31302023号）的资金支持。

可用性数据和材料

用于EST-SSR标记开发的原始测序数据可在NCBI SRA: SRX2617497 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/6545378）.支持本文结论的其他数据集包含在文章及其附加文件中。

从属关系

1. 草原农业生态系统国家重点实验室;农业和农村畜牧业创新科学产业创新重点实验室;教育部草原工业工程研究中心;兰州大学田园农业科学技术学院，兰州，中华人民共和国730020

   张宗玉，谢文刚，赵永强，张俊超，王娜，Ntakirutimana &王艳荣

2. 四川草原科学学院，四川成都，611731，中华人民共和国

   Jiajun严

贡献

WX和YW构思和设计了研究，而WX也写过稿件。YZ执行了该研究，分析了数据，并写了这份手稿。YZ，JZ，NW和JY分析了数据。FN还写了这个手稿。所有作者均阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应于Wengang谢或者燕龙王．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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