基因组鉴定和分类术中的链子谱系谱系和表达分析，揭示了它们在兰花种子萌发中的作用

背景

MADS-box基因在植物花器官形成和生殖发育中起着重要作用。然而，在一些代表性植物中，MADS-box基因在全基因组范围内的鉴定和分类尚不清楚。兰花MIKC型基因的综合研究铁皮石斛仍然缺乏。

结果

在这里，我们对29个物种的MADS-box蛋白进行了全基因组分析。共鉴定出1689个MADS-box蛋白。在陆地植物中发现了两种MADS-box基因，称为Ⅰ型和Ⅱ型，但在苔类植物中没有发现。所有供试开花植物均存在SQUA、DEF/GLO、AG和SEP亚家族，裸子植物中无SQUA亚家族银杏在轮藻、苔藓、苔藓和石蒜中没有发现这四个亚科的基因。这有力地证实了花器官同一性基因的分支导致开花植物花发育进化的观点。MIKC的九个亚科^C基因存在于两种兰花中，铁皮石斛和蝴蝶兰氏菌，而TM8，FLC，AGL15和AGL12 Subfamilies可能会丢失。此外，两种兰花中的花器官身份基因的四片曲线显示了保守和发散的表达模式。冷应激诱导只有三种Mikc型基因铁皮石斛虽然在种子萌发过程中，15种MIC型基因显示出不同水平的表达。

结论

MIKC型基因是从链状植物谱系中鉴定出来的，揭示了其进化和发育关系的新见解。本研究结果揭示了MIKC基因在兰花种子萌发中的新作用，为今后兰花种子萌发的研究提供了有益的线索。

基因表达调控是一个复杂的调控机制，由转录因子（transcriptionfactors，TFs）等多种机制协同作用。TFs专门识别CIS.-目标基因的调控区域，然后以一种导致广泛生理生化过程的方式调控它们的表达。它们也调节植物的发育过程[1.］．MADS-box TFs是一种古老的TFs家族，在绿藻、黄藻和陆生植物中都有发现，它在花卉结构的进化中起着至关重要的作用[2.,3.］．MADS-box基因编码的蛋白质共享一个高度保守的DNA结合域，MADS域，识别类似的10 bp a / t丰富的DNA序列，CArG-box [4.］．

许多MADS-box蛋白已经从绿藻、苔藓、裸子植物和被子植物中鉴定出来[5.]. 在植物谱系中，MADS-box基因的数量因种而异，这表明它们参与了分支特异性功能的调控。在轮藻中[3.]，一个疯子盒基因多形性粘质肠杆菌[6.]，26英寸肺孢子虫[7.]19英寸江南卷柏[8.]已经有报道了。在被子植物中，在双子叶植物中发现了几十个甚至100多个MADS-box基因，包括拟南芥蒂利亚纳[9],油菜（大白菜）[10.]，和葡萄[11.]. 在单子叶植物中，发现了几十个MADS-box基因玉米（75）[12.],高粱（65）[12.],Broachypodium distachyon.(57) [13.]以及水稻（75）[14.］．

在植物中，MADS-box基因可分成两个不同的组，即I型和II型的谱系：I型MADS-box蛋白不具有角蛋白样（K）结构域和仅具有MADS（M）结构域，而类型II蛋白质还具有居间（I）结构域，A K结构域和C-末端区，接着的M域[15.］．II型MADS-box蛋白在植物中又称为MIKC型MADS-box蛋白，由MIKC组成^C和MIKC*蛋白[15.,16.］．MIKC.^C在系统发育分析的基础上，蛋白质可进一步细分为至少13个不同的亚家族（AG、AGL6、AGL12、AGL15、AGL17、BS、DEF/GLO、FLC、SEP、SQUA、SVP、TM3/SOC1和TM8）[15.］．

Ⅰ型MADS-box基因的功能尚不清楚。然而，Ⅱ型MADS基因已被广泛研究，在控制花的发育中起着重要作用。通过对Ⅱ型MADS基因的研究，已经建立了一个众所周知的花器官发育模型ABCDE模型。A. + E类基因建立了萼片的同一性 + B + E类基因建立了花瓣的同一性，B + C + E类基因建立了雄蕊的同一性，D + E类基因建立心皮的同一性。ABCDE同源异型基因在被子植物中已被广泛研究，特别是在植物中金鱼草和答:芥[17.]. 在拟南芥中，AP1.是A级基因，AP3.和圆周率是B类基因，银是C类基因，STK公司和上海医药1/2.是D类基因九月一日–4.是E类基因吗[18.］．ABCDE类基因的表达特异于不同的花卉器官。例如，AP3和PI同源物在花瓣和雄蕊中表达，AG同源物在雄蕊和心皮中表达，而SEP同源物在Anuiaperms的所有花器器官中表达，即使在基础上的Anuiaperms [18.,19.,20.,21］．Mads-Box基因通过将演变和开发联系起来，应帮助理解底层花卉形成机制，同时为分析植物花卉建筑的变化提供基础。因此，重要的是调查植物中的疯箱基因如何发展。

为了全面了解植物中的MADS-box基因，在这项研究中，我们对来自六个谱系的广泛植物的MADS-box基因进行了全基因组鉴定，包括绿藻、轮藻、苔藓、石蒜，裸子植物一种裸子植物和几种被子植物谱系的代表，其基因组是可用的。选择了6个植物谱系（绿藻、轮藻、苔类、苔藓、石蒜、裸子植物）的代表种，对其基因组进行了分析。由于被子植物在人类生活中的重要性，我们选择了被子植物谱系中的物种。基因组测序技术和生物信息学工具已经变得更快和更有效，因此越来越多的植物基因组序列目前可用。因此，有必要像本研究所做的那样，重新分析重要的和广泛的植物物种中的MADS-box基因，以鉴定其他植物物种中的MADS-box基因家族，揭示其进化。

兰花属于兰科西，并具有独特的花卉图案，特别是花卉结构和器官身份。Labellum（'唇'）和gynostemium（'柱'，由雄蕊和雌蕊组成的融合结构）反映了兰花花的独特发展。若干研究已经分离并分析了兰花中的Abce基因[22]. 例如，ABCE功能基因石斛[23,24,25]， B功能基因(AP3和PI谱系)金蝶兰属植物[26]、B和E功能基因大花蕙兰[27]和B (AP3谱系)蝴蝶兰[28]经RT-PCR鉴定并鉴定。铁皮石斛和蝴蝶兰氏菌是两个具有装饰价值的重要兰花。石斛和蝴蝶兰大约在4000万年前分离（Ma）[29］．两者的大小P马术和D．officinale.基因组是相似的，超过1.1千兆字节（GB）。大小P马术基因组长度为1.16gb，采用全基因组鸟枪测序和组装策略进行分析[30.]. 大小D．officinale.基因组是1.11 GB，并通过K-MER分析评估[31]. 本研究利用全基因组技术对两种兰花的ABCE基因进行了鉴定，并进行了系统发育和比较表达分析。MIKC基因在大肠杆菌中的表达模式铁皮石斛在冷应激和种子萌发期间也分析。这些结果可以提供重要信息，以了解这些基因的功能的保护和分歧，提供探索该基因家族的功能的线索。

多种植物MADS-box基因的鉴定

总共有1689个疯狂箱基因，包括684型和1001型Mads-Box基因，以及来自叶绿素的四种疯狂箱基因，从29种植物物种的整个基因组序列中鉴定出来（图。1.;附加文件1.：表S1）。低等植物（绿藻）在其基因组中没有或很少MADS-box基因。例如，没有发现MADS-box基因盐藻结果表明，该基因只存在一个MADS-box基因微单胞菌而且在莱茵衣藻，只有两个疯狂的盒子基因Volvox Carteri.(无花果。1.). 所有来自绿藻谱系的四个MADS-box基因都只包含M结构域，没有I、K或C结构域（附加文件）2.：图S1），这与属于绿藻谱系的其他绿藻中的发现一致[5.］．基底链子，K．硝仅具有一个MADS-box基因，这是一种II型MADS盒TF包含M，I，K，和C结构域（附加文件3.：图S2）。I型基因在所有苔藓、石蒜、裸子植物和被子植物的基因组中检测到，但在轮藻和苔类中没有检测到（图。1.）。然而，II型基因均streptophyte谱系中广泛存在（图1.). 此外，被子植物中MADS-box基因数目众多，从33个(A. Trichopoda.)至169 (M家蝇），但藻类中只有一两个（图。1.）。

链状植物的系统发育分析、Ⅱ型（MIKC型）基因分类和ABCDE基因分析

为了了解植物Mikc型基因的分类和演化，我们通过该研究中发现的所有1001种MIKC型基因从链子晶体谱系中进行了系统发育分析。基于全长MIC型蛋白序列的对准MIC型构件的系统发育重建，它们被分为MIKC *和MIKC^C组（附加文件）5.:图S3)。MIKC.^C该组又分为13个主要亚家族，即AGL6、AGL12、AGL15、AGL17、SQUA、DEF/GLO、AG、SEP、TM3/SOC1、BS、SVP、FLC和TM8（图。2.;附加文件6.：图S4），与先前的研究结果一致[15.]. 轮藻中只发现一个MADS-box基因（GAQ89767.1）K．硝，属于SVP分支，通过系统发育分析（附加文件），引导支持较弱（34%）7.：图S5）。而且，只有一个MIKC^C苔类中的基因属于SVP亚家族（附加文件8.：图S6）。这表明SVP基因的祖先同源物是在轮藻谱系与陆地植物谱系分化之前进化的，并提示轮藻的祖先起源于一个或几个MIKC^C基因，以及所有现代土地植物的MIKC蛋白通过基因重复从这些前辈辐射，如Tanabe等人所提出的那样。[3.］．

在13个亚科中，SQUA（A类）、DEF/GLO（B类）、AG（C/D类）和SEP（E类）基因在花发育中起着重要作用[35］．建议花本身的进化与相应谱系的演变相连。如预期的那样，植物分类学团体来自甲状腺物质，通过苔藓植物和溶血性，没有SQUA，DEF / GLO，AG和SEP亚家族基因，其存在于所有开花植物中，而裸子植物银杏只含DEF/GLO、AG和SEP亚家族基因(图1)。3.）。

兰花中MIKC型基因的系统发育分析

兰花中的Mikc型基因分析有助于了解花卉形成机制，并为分析花卉结构多样化提供基础。共鉴定了总共41和34种MIC型基因铁皮石斛和P马术，可分为MIKC*和MIKC^C组。有33和30个MIKC^C基因来自铁皮石斛和P马术分别是。系统发育分析表明MIKC^C两种兰花的基因可分为9个主要亚科：SQUA、DEF/GLO、AG、BS、SEP、AGL6、AGL17、TM3/SOC1和SVP（图。4.）。两个兰花的每个亚家族中的基因数量都是相似的。例如，DEF / GLO，AG，SEP和AGL6亚壳包含在两个兰花中相同数量的基因（分别为5,4,5和1）。没有找到TM8，FLC，AGL12和AGL15基因铁皮石斛或者P马术. 其它单子叶植物，如水稻和水稻B. Distachyon.无FLC成员或AG15亚家族成员，但含有AGL12亚家族基因[13.,14.］．

两种兰花ABCE基因的特征分析

核心单子叶和单子叶植物以及基础被子植物的遗传学和分子研究表明，ABCE类基因的表达模式和功能之间存在很强的相关性[17.,20.,36,37,38,39,40］．众所周知，ABCE函数基因在素质的花器器官中发挥关键作用，包括萼片，花瓣和雄蕊，兰花在兰花中与其他植物相差。通过比较和分析两个重要的兰花属中的Abce基因的表达将有助于理解其基因功能的分歧。

系统发育重建表明斯瓜基因可以分为分裂成分，单子叶植物片（图。5.所有兰花)。斯瓜基因并没有显示花特异性的表达模式，在某些情况下(Peagl11.–13.,DoAGL16.,DoAGL17.和DoAGL19)在萼片中的表达也相对较低。5.A） 是的。这个斯瓜基因（Peagl11.–13.)在P马术在所有器官中具有相对较低的表达水平和柱子中的相对强烈的表达（图。5.一种）。DoAGL18.和DoAGL19在所有器官中检测到并在茎和叶中强烈表达（图。5.一种）。DoAGL16.只在叶检测DoAGL17.在根和茎中强烈表达。5.一种）。

B类基因是建立花瓣和雄蕊同一性所必需的。AP3和PI同源物被认为是B功能基因的两个亚类。结果表明，在大肠杆菌中只发现一个PI同源基因铁皮石斛和P马术而在这两种兰花中至少存在四个AP3同源物（图。5.B） 是的。π同系物DoAGL34.和Peagl26.在所有四个花器官（萼片、花瓣、唇瓣和花柱）以及营养器官（根、茎和叶）中均有表达，表达模式相似（图。5.B） 是的。同样，π同系物OMADS3系统从金蝶兰属植物Gower-Ramsey在所有四个花器官以及营养组织（叶）中均有表达[26］．的AP3亚枝基因是特异于花和在两个兰花显示相似的表达模式。这表明在萼片，花瓣，唇和兰花柱形成的调控对AP3基因可能积极作用。

dooagl21.和DOAGL22从铁皮石斛，而Peagl17.和Peagl18.被识别为Ag-Lineage基因P马术(无花果。5.C）。dooagl21.只在花柱和花芽中表达，但DOAGL22和Peagl17.以花瓣表达，主要在柱中（图。5.C）。与正常雄蕊开发的AG谱系的要求一致[41]AG在两种兰花的雄蕊中均有表达。我们认为兰花的C功能基因高度保守，在雄蕊形成的调控中起着重要的作用。

在本研究中，SEP亚家族可分为两个分支：SEP1/2和SEP3（图。5.D） 是的。SEP基因DoAGL9公司–13.从铁皮石斛在生殖阶段的根，茎和叶中检测到繁殖阶段和花的叶子中，具有鲜花芽，萼片，花瓣，嘴唇和柱子中的强烈表达（图。5.d）。DoAGL10.在花蕾、萼片、花瓣、唇瓣和花柱中检测到，尽管唇瓣中的表达相对低于萼片、花瓣和花柱中的表达（图。5.D） 是的。四个SEP亚家族基因(Peagl5-8)P马术在所有花器官中均有表达，在花蕾、萼片和花瓣中的表达相对高于在唇瓣和雄蕊中的表达（图。5.D） 是的。另外两个九月基因（DoAGL9公司和DoAGL10.)属于SEP1/2分支，在茎和花器官中有相似的表达模式（图。5.D） 是的。这个结果表明DoAGL9公司和DoAGL10.可能监督类似的生物功能。

表达分析铁皮石斛冷应力下的Mikc型基因

番茄中的低温可以诱导一些疯箱基因的片状（Solanum lycopersicum.）[42]还有米饭[14.］．这刺激了我们的表征mikc型基因的表达模式铁皮石斛. 分析多格尔在冷胁迫下，转录组测序数据铁皮石斛从SRA数据库下载叶片并计算基因表达水平。只有来自SUQA、SOC1和DEF/GLO分支的三个MIKC型基因表现出冷反应性表达模式（图。6.),DoAGL18.在SUQA亚家族中下调了0.358倍，而其同源基因TM4.在西红柿里[42]，和LCMADS1和LCMADS2.在羊草里(羊草）[43]表现出相反的表达模式，被低温上调。两个基因，dooagl24在SoC1亚家族和DoAGL27.在DEF / GLO亚家族中，上调1.51-1.60倍，分别远远超过控制。该结果与DEF / GLO谱系一致LCMADS5来自羊草[44]以及TM6.来自番茄[42[响应于冷应激是否上调。在油菜，五SOC1级同源染色体(BrMADS36- - 38- - 39- - 40和 - 44）通过冷应激诱导的[45]. 这一结果提示MIKC型基因可能在细胞免疫应答中起一定作用铁皮石斛而低温胁迫诱导的基因在不同的植物种类间存在差异。八个MIKC型基因的表达(DoAGL07.- - 16.- - 17.- - 19.- - 25- - 28- - 29和DoAGL34.)与对照组在冷应激下无差异（另附文件）9：表S3）。最后，剩余的30个基因显示出非常低的表达或没有通过RNA-SEQ检测到的（附加文件）9：表S3）。

成绩单分析铁皮石斛种子萌发过程中的MIKC基因

虽然MIKC基因在花器官发育调控中的作用已被证实，但它们在种子萌发中的作用仍不清楚。只有两个MIKC基因FLC公司/AGL25型和AGL2型1英寸答:芥通过影响ABA分解代谢途径和调控ABA信号通路参与种子萌发[46,47］．然而，FLC亚家族基因尚未在兰花中发现，如Apostasia飞机草[48],P马术和铁皮石斛(无花果。4.). 这表明MIKC基因调控兰花种子萌发的方式可能与其它基因不同答:芥. 在此基础上，研究了MIKC基因在乳腺癌组织中的表达铁皮石斛在四种种子萌发阶段进行分析。六个mikc基因（DoAGL10.- - 13.- - 19.- - 21- - 25,30.和 - 37)四个MIKC基因表达下调(DoAGL17.- - 18.和 - 32)在S2-S4中上调（图。7.;附加文件10.：表S4）。SVP亚家族基因DoAGL27.在S1中未检测到，但在S2-4中检测到，S3中的最高表达（图。7.;附加文件10.：表S4）。S4是叶片首先出现和幼苗形成的阶段。两个SQUA亚家族基因DoAGL17.和DoAGL18.在S2-S4表达水平较高，而DoAGL19S2-S4表达下调（图。7.;附加文件10.：表S4）。这表明了SQUA亚家族基因在细胞中的多种功能铁皮石斛. 一个DEF/GLO分支基因DoAGL32.表达水平较低（FPKM） = 1） 在S1中，但在S2-S4（FPKM）中表现出高水平的表达_S2级 = 154; FPKM公司_S3级 = 168; FPKM_S4级 = 325），表明DoAGL32.可能在种子萌发中发挥重要作用。在这项研究中，一个mikc *基因DoAGL7公司S3和S4的变化是S1的1.5倍（图。7.），表明它可能在种子萌发过程中发挥作用。

植物中疯子箱基因的鉴定和分类

MADS-box基因在本研究中已在一些植物物种中重新鉴定（详细信息在附加文件中列出）4.：表S2）。共鉴定出108个MADS-box基因答:芥160从中国的白菜（B. Rapa.)，与以往报道的MADS-box基因数目一致[9,10.］．Arora等人。[14.据报道，使用TIGR PSEUDOMOLECULES第4份（2006年1月12日发布）的基因组 - 覆盖水稻疯子箱基因的注释[49]. 在我们的研究中，使用当前的基因组组装（MSU版本7）在水稻中发现了73个MADS盒基因[50]. 与以往对水稻MADS-box基因的注释相比，发现了4个未被注释的MADS-box基因（LOC_Os02g01355、LOC_Os02g01365、LOC_Os06g01890和LOC_Os11g12360）。同一染色体上具有相同氨基酸的LOC_Os02g01355和LOC_Os02g01355被认为是冗余的重复基因，因此去除了LOC_Os02g01355。此外，先前研究中发现的两个MADS-box基因（LOC泷Os12g31010和LOC泷Os08g20460）没有出现在最新的水稻肽文件中，因此被排除在我们的研究之外。此外，两个基因LOC_Os01g68420和LOC_Os02g01360以前被认为是MADS-box基因，但与其他MADS-box基因的同源性较低（低于38%），在NCBI数据库中BLAST分析后没有M域或K域，被排除在本研究之外。我们的研究结果为水稻MADS-box家族提供了更准确的信息，有助于理解MADS-box家族在生殖发育中的作用。在玉米中，先前的一项研究发现了75个MADS-box基因[12.]虽然我们的研究中有87名，但将列表扩展为12。

本研究从植物中鉴定出的MADS-box基因，除绿藻和轮藻外，可分为两种不同类型：Ⅰ型（SRF样）和Ⅱ型（MEF2样），如动物和真菌[51]. 从3种轮藻类绿藻中分离到Ⅱ型基因[3.]. 在动植物/真菌分化之前，MADS-box基因的两个主要谱系（Ⅰ型和Ⅱ型）已经存在[52］．

链状植物谱系中MIKC型基因的多样性

TM8亚家族存在于裸子植物中G. Biloba.基生被子植物A. Trichopoda.和Nelumbo Nucifera，还有一些真双子叶植物柑橘,苹果十家蝇,梨属十布雷奇尼和V. Vinifera.但在eudicots中却没有答:芥和大白菜（附加文件1.：表S1），与先前的研究结果一致答:芥[9]，大白菜[10.],V. Vinifera.[53],A. Trichopoda.[54]以及G. Biloba.[55]. 此外，独角兽玉米有一个专属基因TM8（GRMZM2G137289\ u P01；附加文件1.：表S1）。这表明，TM8亚科可能已被一些单子叶植物和一些真双子叶植物的进化过程中丢失。在不包括轮藻的藻类所有streptophyte谱系中发现的MIKC *型基因（附加文件1.：表S1）。苔类M多形类，被认为是最早的陆生植物[6.，只有一个MIKC*基因。AGL15亚家族基因存在于苔藓植物、石松植物、裸子植物、基部被子植物和单子叶植物中，但在单子叶植物中不存在1.：表S1）。这与在裸子植物中发现AGL15分支基因的报道一致[56,57]和eudicots [9]但在单子叶植物中不存在[58]. AGL15亚家族基因可能在单子叶植物谱系进化过程中丢失。DEF/GLO基因在其它裸子植物如针叶树中也有发现辐射松[59和一个金矿床灌状买麻藤[60]. 未发现SQUA亚家族基因银杏在这项研究中，他们在以前的研究中也没有发现[56,61]. SQUA亚家族基因在另外两种裸子植物中也不存在，火炬松和Pinus sylvestris.[56］．我们建议在服药培养物和裸子植物分歧后存在A函数基因，并且B-，C-和E-COUNTS基因出现在患有子植物和裸子植物的分歧之前。

Mikc的功能分歧和保护^C兰花的基因

AGL12和FLC都控制开花过渡，分别作为增强子和抑制子答:芥开花时间。XAL1（AGL12）在花期转换中起着重要的作用，其晚花期的表型在植物中也起着重要的作用XAL1突变体能够在漫长的日子里生长[62］．FLC在开花的启动中起着关键作用答:芥， IE。，FLC.突变有早开花的表型[63]. 谷物的同系物（小麦和大麦）VRN1型,英尺/VRN3， 和A.拟南芥AGL19，担任春化途径的关键球员，而那些发现的途径石斛兰鸟羽受到vernalization的监管[64］．该AGL12和FLC亚科基因在这两个兰花缺席铁皮石斛和P马术说明兰花开花过渡期的基因调控与普通兰花不同答:芥. 需要更多的分析来证实AGL12和FLC基因在兰花基因组中已经丢失，并确定这些基因的保存和进化的重要性。

在双子叶植物中，例如答:芥和A.马朱斯，萼片所需的类基因显示出萼片中最高的表达，但它们的表达在根，茎和叶中不存在[38,65］．而单子叶中SQUA亚家族基因在营养组织和叶片中均有表达。例如，水稻SQUA-like基因osmads18.广泛表达于根、叶、花序和发育中的籽粒中[66]. 我们的研究表明，在单子叶植物和双子叶植物中，甚至在兰花中，SQUA样基因都经历了功能分化。在植物的雄蕊发育过程中，C-谱系得到了很好的证实，在雄蕊和心皮中表现出特异性表达，如在植物中答:芥[67],尼科尼亚塔哈瓦姆[68]以及Lilium Longiflorum.[69]. 结果表明，该基因只有一个C功能基因答:芥[67]以及A.马朱斯[70]，这对生殖器官的规范是必不可少的。然而，至少有两个AG-谱系的兰花被发现并在列主要表达。一AG-谱系基因cemads1.从大花蕙兰只在专栏里发表过，而另一篇，cemads2.，在所有花器官中均检测到强表达，类似于2铁皮石斛银系基因[71］．基因和分子研究表明，SEP亚家族基因(九月一日/2./3./4.)所有四轮花器官的特征都需要[17.］．的花朵A. ThilanaA Sep1 Sep2 Sep3三重突变体产生没有任何花瓣，雄蕊和心皮的花，所有这些都被萼片取代，证明了拟南芥中花瓣，雄蕊和心皮的规范所必需的SEP基因[17.］．的九月(第2页)基因调控水稻小穗分生组织的特性和发育[44］．功能e直言基因铁皮石斛和P马术其他兰花如金蝶兰属植物高尔拉姆塞[72]以及皱皮石斛[24在所有的花器官进行检测]在花器官发育起到了保守的作用。

该MIKC型基因可能在种子萌发作用铁皮石斛

一些MIKC基因来自D．杂烩在种子萌发期间表现出不同的表达，包括SVP和SQUA亚家族基因以及MIKC *基因。SVP亚家族基因PKMADS1从川泡桐展示在芽形态发生中的重要作用[73]，表明SVP基因在铁皮石斛可能与其他SVP分支基因具有相似的功能，并可能在营养枝发育中发挥作用。MIKC*基因的功能尚未明确。表达分析提供了MIKC*基因在小鼠配子体发生中起作用的线索S．Moellendorffii.,Funaria hygrometrica和里氏金枪鱼[74,75]以及花粉发育答:芥[76］．刘等。[77]提供了水稻中MIKC*基因参与花粉成熟的证据。然而，一个MIKC*基因在种子萌发过程中表达上调，这可能在我们的研究中起重要作用。

对29种植物进行全基因组鉴定，共鉴定出1689个MADS-box基因。这些MADS-box基因分为Ⅰ型和Ⅱ型（MIKC型）两个亚型。MIKC公司^C-模式基因属于MIKC型分支，根据其系统发育关系可分为至少13个亚家族。对轮藻、地衣、苔藓、石蒜、裸子植物和被子植物的SQUA（A类）、AP/PI（B类）、AG（C/D类）和SEP（E类）基因亚家族进行了分析，提供了丰富我们对花器官发育和基因进化的新信息。研究了ABCE基因在两种兰花中的表达模式，以及在低温胁迫和种子萌发期的表达模式铁皮石斛，进行了分析。这些信息将加强我们对这些基因功能的保守性和差异性的理解，并使兰花的个体发育、胁迫反应和种子萌发得到进一步的解释。

植物材料和RNA分离

铁皮石斛在这项研究中使用的植物在中国南方植物园，中国院士，广州，中国中生长。进行基因表达分析铁皮石斛组织：根，茎，叶子，花蕾，嘴唇，花瓣，萼片和柱子。从10盆中收集根，茎，叶和花动器官铁皮石斛在生殖阶段，然后在液氮中冷冻5分钟并尽可能快地将 - 80℃冷冻于-80℃以进行RNA分离。根据操作手册，通过RNA提取试剂盒从各种器官中提取来自各种器官的RNA提取试剂盒，柱植物RNAOUT2.0（Tiandz，Inc。大连，中国）。

MADS-box基因的鉴定

从在线数据库下载29种物种的所有最新肽文件，以生成本地蛋白质数据库（版本的详细信息，并在附加文件中列出了网站11.：表S5）。从Pfam数据库获得SRF型TF域模型（PF00319）(http://pfam.xfam.org/)并利用HMMER3软件包在默认参数下建立隐马尔可夫模型（HMM）文件(http://hmmer.janelia.org/). 利用HMMER3检索的HMM文件，通过HMM搜索程序识别MADS-box基因。通过在Uniprot数据库中注释MADS-box蛋白，确认所鉴定的序列为MADS-box蛋白(https://www.uniprot.org/)或者在NCBI数据库中。为了保证结果的准确性，对所有候选MADS-box基因的染色体定位进行了检查，去除了相同染色体位置的冗余序列。

多重序列比对

MAFFT版本7软件[34]将MADS-box蛋白的多个序列与默认参数进行比对，生成FASTA格式的多序列比对文件。ClustalX 2.1软件[78用于对准序列并重新检查上述结果。

MADS-box基因的系统发育分类

使用MEGA版本7对MADS-box蛋白进行系统发育和分子进化分析[33]基于疯子箱蛋白的对齐。NJ方法用于构建本研究中的系统发育树。为了确定统计可靠性，我们通过Clustalx 2.1软件次导电了Bootstrap NJ树[78]对MADS-box基因的分类进行复核。根据MADS-box基因与拟南芥MADS-box基因的系统发育关系对MADS-box基因进行了分类。

基因表达分析

根据其协议，使用GoScript™逆转录系统（Promega，Madison，Wi，USA）进行总RNA逆转。通过半定量PCR使用Taq PCR主混合物试剂盒（Dreamtaq™Green PCR主混合套件，Takara，大连，中国）测定转录物水平。从RT反应中使用来自RT反应的一个微升CDNA样品（约400ng /μl），由95℃组成2分钟，然后在98℃（10秒）下的40个变性循环，在58℃下退火（30秒），72℃（60秒）延伸。通过电泳在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分析每种反应中的五微升PCR产物。使用PRIMER3.0软件设计MAD-BOX基因的引物（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 为了使引物具有更高的特异性，在设计引物时尽可能使用不含高度保守M结构域序列的序列。MADS-box基因的特异性引物在附加文件中列出12.：表S6。D药用肌动蛋白（NCBI检索号JX294908）作为内控基因。

目的：研究大鼠血清SQUA、DEF/GLO、AG和SEP亚家族基因的表达情况P马术，原始测序读取P马术样品（根、茎、叶、花蕾、萼片、花瓣、唇瓣和柱）取自Niu等人提供的NCBI SRA（保藏号SRR2080194、SRR2080204、SRR2080200、SRR3602300、SRR360229、SRR3600277和SRR3600816）[79]. 从原始芦苇中排除低质量的读取以产生干净的读取，用于分析基因表达。使用TopHat版本2.0.8，用SQUA、DEF/GLO、AG和SEP亚家族基因的核苷酸序列映射所有干净的读取[80]. 基因表达水平用FPKM法计算[81］．

对于冷胁迫下的基因表达分析，我们将D．Offficinale.冷胁迫下的叶片（4 °C）和控制（20 °C）（SRA，注册号SRR3210613、SRR3210621、SRR3210626、SRR3210630、SRR3210635和SRR3210636）从SRA下载，由Wu等人提供[82]. 如前所述，将生芦苇洗净并用于计算冷应激下的表达水平。平均FPKM> 用5片对照或处理叶片计算折皱变化（FPKM处理叶片平均值/FPKM对照叶片平均值）。基因与 ≥ 1.5倍的变化被认为是上调基因，而 ≤ 0.66倍的变化被定义为下调基因。

在种子萌发过程中，原始序列读取四个阶段的种子铁皮石斛种子萌发(S1, SRR1951787;S2, SRR1951788;S3, SRR1951789;下载S4、SRR1951790)，采用上述基因表达方法分析基因表达情况。Chen等人提供了SRA数据[83］．任何一个阶段中的FPKM> 5的基因被认为是有效基因，并用于计算折叠变化（FPKM_S2-4/FPKM公司_S1级). 基因与 ≥ 1.5倍的变化或与 ≤ 0.66倍的变化被定义为不同表达的基因。S1是种子在半强度Murashige和Skoog（MS）上播种前不发芽的阶段[84]培养基；S2期胚胎增大，种皮破裂；在S3中，原球茎形成；在S4中，随着第一片叶子的出现而建立幼苗。

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。在当前研究期间使用和分析的数据集可从合理的请求中获得相应的作者。

AG：

恶毒的

FLC：

开花基因座C.

FPKM：

每千个碱基的片段每百万个片段的外显子

隐马尔可夫模型：

隐藏的马尔可夫模型

NCBI：

国家生物技术信息中心

NJ：

邻居加入

RNA序列：

RNA测序

Squa：

Squamosa.

STK公司：

Serifstick.

TF：

转录因子

SRA:

序列读取存档

SEP1 / 2/3/4：

Sepallata1 / 2/3/4;

SHP1 / 2：

防碎1 / 2.

附录1/3：

无瓣1/3

我们感谢Hanghui Kong博士（中国科学院华南植物园），以获得进化分析的宝贵建议。

本研究得到了广东省自然科学基金项目（批准号2016A030310012）和广州科技计划（批准号201704020192和201704020010）的资助。资助机构没有参与研究设计、数据收集和分析，也没有参与手稿的准备。

从属关系

1. 华南农业植物分子分析与基因改良，华南植物园，中国科学院，广州，510650

   何春梅、残思、段俊

2. 2 .中国科学院大学，北京100049

   Can Si公司

3. 独立，米哈町，日本

   詹姆A。特谢拉·达席尔瓦

4. 基因先锋生物技术有限公司，南京，210014，中国

   李明志

贡献

JD监督了该项目。Ch构思了该研究并设计了实验。CS进行半定量RT-PCR。ML进行生物信息学分析。CH和Jatds统称地解释了结果并撰写了稿件的所有草稿。所有五位作者批准了最终提交的草案，并为稿件内容提供全面的公共责任。

通讯作者

通信段君．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商说明

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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