通过比较转录组分析，揭示了基因差异和驯化基因Diospyros.

背景

柿子（Diospyros Kaki.）是属于属的最经济栽培的物种Diospyros.．但是，迄今为止众所周知，驯化的差异多样性和机制，部分是由于缺乏可用于密切相关的物种的基因组信息D. Kaki.（DK）。在这里，我们在九个样品上进行转录组测序，包括DK，各种DK和七个密切相关的物种，以评估三种遗传分歧，并鉴定参与柿子驯化的候选基因。

结果

我们在九个中获得了483,421名的ungenes，N50在九个中的1490年Diospyros.使用Orthomcl分析在所有样品中共享的样品并确定2603个Orthogroups。基于串联2603一对一的单拷贝基因对准建立了系统发育树，表明DK与之密切相关D. Kaki.var。silvestri(DKV)，它聚集在枝D. deyangnsis.（DD）并距离酒店最远D. Cathayensis.（DC）物种。通过同义替代（KS）比率，无非用替换（KA）与不同物种的遗传关系成正比。Ka / Ks比率越高，距离越长。此外，鉴定和分离出涉及碳水化合物代谢和酚醛代谢的31种阳性选择的基因（PSG），除外，几乎所有PSG伴侣基因在DK或DKV物种中高表达。推测这些基因可能有助于DK的驯化。最后，利用EST-SSR建立了表达序列标记-简单序列重复序列(tag-simple sequence repeat, EST-SSR)，并鉴定出2个独特的扩增子DKSSR10和DKSSR39:前者在DC种中不存在，而在其他物种中存在，后者在DJ种中有较长的扩增产物。

结论

本研究为柿子近缘种提供了首个转录组资源，揭示了种间的遗传分化。推测DK来源于DD和DO的杂交。此外，我们的分析还表明，DKSSR10和DKSSSR39可能是柿子近缘种适应、驯化和形成的重要候选分子标记。

Diospyros.林恩。，which belongs to the Ebenaceae family, is the largest, most widely distributed and economically important genus, with over 500 species [1]．亚洲和太平洋地区，其中约有300种属Diospyros.分布，代表多样性中心[2，3.]．柿子（D. Kaki.，dk，2n = 6x = 90;2n = 9x = 135），被认为是在中国起源的，是最经济上最重要的属植物栽培物种Diospyros.．目前，除中国、日本和韩国等主要种植国外，以色列、意大利和西班牙的柿子种植正在迅速扩大。d .莲花(DL, 2n = 2x = 30)常作为DK的砧木，对扩大栽培范围和提高果实品质具有重要意义。此外，还有一些其他种类的Diospyros.从古代的应用范围内。例如，D. Oleifera.（DO，2n = 2x = 30）由于其高含量的单宁，而且是木材涂料。D. Jinzaoshi.（DJ，2n = 2x = 30）和D. Cathayensis.（DC，2n = 6x = 90）被培养以用于装饰目的。D.弗吉尼亚州(DV, 2n = 6x = 90)D. Glaucifolia.（DG，2N = 2x = 30）通常用作木材木材。但是，少数关于属属中的特异性遗传关系的研究Diospyros.与DK的种内系统发育关系进行了比较。前期研究表明DK与基于do的叶绿体基因组序列和分子标记密切相关，包括逆转录转座子扩增多态性(IRAPs)和逆转录转座子微卫星扩增多态性(REMAPs) [4，5]．然而，分析序列特异性扩增多态性（SSAP）和扩增的片段长度多态性（AFLP），表明DK与DL物种更密切相关[4]．此外，一些新的属Diospyros.是近年来被发现的。Tang等报道DJ可能是一种新的物种，基于形态学和内部转录序列(ITS)和垫k序列分析[6]．在我们以前的研究中，D. deyangnsis.（DD，2N = 4x = 60），分布在四川省德阳市（中国），也被认为是根据染色体数量和SRAP标记的新特殊物种[7]．最近，李等人。建议DK与DD有更接近的遗传关系，而不是DD [8]．因此，关于DK与属的其他物种之间的系统发育关系Diospyros.，需要进一步研究。

柿子在中国至少有2600年的种植历史，根据古籍《利集·内泽》中最早的记载[9]．柿子树已经收集和驯化以来自由BC 1000。随着嫁接技术的发展，唐代和宋代柿子的大规模培养出现（ad 618-1279）。值得注意的是，在明清时期（AD 1368-1911）进一步发展柿树的培养，因为这种时期的柿子被认为是有价值的“木质收益”[9]．目前，中国柿子种植面积达到93.32万公顷，占世界种植面积的91.34%。韩国、日本和西班牙的耕地面积分别为2.73、2.08和1.30% (FAO, 2017)。

是该属中最重要和最具经济价值的种Diospyros.， DK的品质和商业价值较大，果实中可溶性糖含量较高，单宁含量较低。驯化的分子机制已经研究了一个多世纪，但以往的研究大多集中在模型系统中的单个或少数候选基因上[10.，11.]．基于参考基因组和下一代测序(NGS)技术，共鉴定出67个基因位点作为苹果驯化过程中的潜在适应靶点[12.]．另外，基于使用RNASEQ技术的序列分歧检测番茄中超过50个阳性选择的基因[10.]．然而，由于具有复杂的遗传性状和DK物种中的参考基因组的限制，已经进行了很少的研究，则已经进行了关注适应基因的研究。

假设与驯化果实中剩余的基因相比具有较高的差异，因此被认为是归因于人工选择的力量[12.，13.]．通过评估同源编码区之间的非同义置换(Ka)和同义置换(Ks)的比例来检测快速进化的基因[14.，15.]．据说带有Ka / Ks> 1的配对基因通过自然或人工选择经历了快速发展[16.]．驯化相关表型的遗传机制已在几种模式植物中进行了研究，最显著的是在玉米、水稻和番茄中[10.，17.，18.]．结果表明，与驯化相关的快速表型分歧通常是由于一些遗传基因座19.]．鉴定非模型生物中快速发展的基因通常受到序列信息的可用性和成本的限制。最近的NGS发展提供了一种为非模型物种，尤其是转录组序列获得丰富和经济的基因组数据的方法。RNA测序越来越多地用于研究自适应演化和检测自适应基因座[10.，20.]．针对各种植物进行了密切相关物种的比较转录组研究，例如番茄[10.]，Berberidaceae [20.]，报春花[21.]， 和菊花［22.]，不仅提供属特异性SSR引物或单拷贝正交组，还能检测到一些驯化相关基因。

在本研究中，我们深排序九个样品的转录组，以确定其遗传关系并鉴定驯化相关基因。来自属的九个样本Diospyros.包括一种驯化的柿子(DK种)，多种柿子命名D. Kaki.var。silvestri（DKV，也称为野生柿子，2n = 6x = 90），七种野生物种（DJ，DC，DV，DO，DG，DD和DL）。进行了九个样品的比较转录组分析以鉴定正交组并评估遗传距离。接下来，用于每个正交对的Ka和Ks的比率用于鉴定九个样品和归际相关基因之间的正选择基因。最后，检测来自推定单拷贝基因的特异性表达的序列标签 - 简单序列重复（EST-SSR）标记。我们的分析为柿子亲属的人工选择提供候选基因，并揭示了一些可能用作特异性分子标记的EST-SSR。

形态特征和生理学评价

包括果实，叶子和种子大小的形态特征存在九个样品之间的显着差异（图。1和表格1）.与其他样品相比，DK和表现出较大的果实大小。DK和DKV以及DL和DG分别具有类似的叶状性状性状。DC有刺的树枝，果实最长的果梗，最小的水果和叶子，显示了九个样品中的特定角色。

缩合单宁又称原花青素(PAs)，可分为可溶性和不溶性PAs。由于可溶性PAs的积累引起涩味，这往往是作为参考基础的可食性的果实Diospyros.用作人类食物的物种。可溶性PAs和不溶性PAs含量分别以DD和DJ品种最高。DC和DK的可溶性和不溶性PAs含量分别最低和次最低。一般情况下，软质果肉的TSS水平高于硬质果肉Diospyros.．值得注意的是，对于DK物种观察到最低的TSS内容物，这可能是果实硬度效应的结果（图。2）.DC和DL物种更容易软化，在成熟阶段具有低水平的坚固性。

测序和转录组件

RNA测序文库由每个组织（叶，茎，果花）的不同组织（叶，茎，果花）制备Diospyros.物种或品种。使用Illumina成对的排序技术，九个样品总共产生了大约40025万清洁读数，每个样本平均为4447万读（附加文件）5：表S1）。这些高质量读数的DE Novo组装总共产生483,421个unigenes，其九个均为884 bp和N50的平均长度为1490英镑Diospyros.样本。在九个样品中，DKV物种最多具有90,605个unigenes，其平均N50长度为1225bp，平均长度为702bp。DG物种至少为28,719个unigenes，平均N50长度为1722bp，平均长度为1145 bp（表2）.

功能注释

来自九个样本的完整的unigenes通过同源性搜索使用BLASTX对NR，Swiss-Prot，Kegg和Cog蛋白质数据库进行注释，施加1E-5的电子值阈值。来自DG，22501（78.35％）的22,770（79.37％）来自DG，28649（70.37％）的DC，27384（60.37％）来自DD，30543（52.37％）的DD，30543（52.37％）来自DK，33.245（49。10.%) from DO, 35543 (47.27%) from DV, and 42,190 (46.56%) from DKV yielded at least one significant match to an existing gene model in the BLASTX searches (Table3.）.除了DV物种外，其中两个最热门的是基于基因组的vitis Vinifera,Cajanus Cajan.在美国，排名靠前的物种有8种Diospyros.样本vitis Vinifera和Theobroma可可在NR数据库中，其中具有最高级别的成功注释（附加文件6:表S2)。

对于基因本体（GO）功能注释，分布和百分比揭示了物种之间的一些分歧，尽管它们是相似的（附加文件2：图S1）。在“生物过程”划分中，在所有样品中突出分享细胞过程和代谢过程，而DD，DK和DKV在细胞过程和细胞组织组织/生物生成类别中具有更高的比例。在分子函数类别中，与其他物种相比，DK物种中，作为转运物活性（702 ungigenes）和抗氧化活性（113个unigenes）注释的基因的数量最高，暗示了与各种环境压力源的可能关系。此外，DK（353个UNENES）和DD（343个UNEGES）物种中，在细胞组分类别下作为膜封闭的腔内注释为膜封闭的内部的基因（附加档案2：图S1）。

利用COG数据库对各物种的unigenes进行功能预测和系统发育分类。“仅用于一般功能预测”的类群基因最多，其中DK的类群基因最多(9091)。在全部25个COG组中，DK在“复制、重组”、“修复转录”和“辅酶运输和代谢”三个类别中所占比例最高，而DL物种中，最具代表性的类别是“细胞壁/膜/包膜生物发生”(326个基因)(补充文件)7:表S3)。

正牙鉴定和系统发育分析

基于Orthomcl分析，确定了总共31,242个推定的正交组，包括196,619个unigenes [23.]（附加文件8：表S4）。在31,242正交组中，通过所有九个样品共享2603个Orthogroup，并且在DK中检测到含有58,325个基因的22,923个OrthoOcs（含有20,320和2603组）（图。3.）.表示最多24,080个Orthogroups，DJ至少显示了至少18,941个Orthogroups。

为了进一步确定柿子的系统发育位置，根据861,013条氨基酸序列建立了9个柿子的系统发育树1），其由串联2603一对一单拷贝基因对准构成。进化树组成包括三个簇（图。4一种）。在Cluster-1组中，DK与DKV密切相关，然后它与DO和DD的片状聚集。Cluster-3包括DV和DC，后者显示距离DK物种最远的距离。与其他分类群相比，DC具有明显更小，更窄和常绿叶片叶片Diospyros.，这与形态特征一致（图。1）.

Ka/Ks和阳性选择基因(PSGs)分析

用Kaks_calculator进行9种物种之间的成对比较[24.]，并获得总共36kA / ks比率。其中，重点分析了8kA / ks比率，其中将DK与其他物种进行比较。从低到高的Ka / Ks比的平均值如下：DK-VS-DJ = 0.37，DK-VS-DG = 0.37，DK-VS-DD = 0.38，DK-VS-DO = 0.38，DK-VS-DL = 0.39，DK-VS-DV = 0.40，DK-VS-DKV = 0.42和DK-VS-DC = 0.49（表4）.来自DK-VS-DKV和DK-VS-DO共有的总共534和547 Ortholog对，分别具有≥1，并且DKV和DO物种与DK在集群分析中具有密切的关系．Ka / ks比率≥1的最高和最低的次数对分别是DK-VS-DD（830）和DK-VS-DC（449）。ka / ks比的最高和最低的ka / ks比例在0.5和1之间分别为DK-Vs-D1（2219）和DK-VS-DKV（1279）（表4）.Ka/Ks比值大于0.5是一个保守的截断值，但它也被证明对识别中等阳性选择的基因有价值[25.]．此外，Ka / ks> 1被设定为正选择基因的截止[16.]．总的来说，0到0.1之间的Ka / ks比具有最大数量，并且0.6和0.7之间的比率在0.6和0.7之间具有最低数量（图。5）.

2603年单一副本orthogroups共享的所有9个样品具有产生和同义替换,Ka / Ks的比率,这是当时DK与其他物种相比,从低到高,如下:DK-vs-DC, DK-vs-DV, DK-vs-DG, DK-vs-DL, DK-vs - DJ, DK-vs-DO, DK-vs-DD和DK-vs-DKV(表5）.虽然DK-vs-DO的Ka/Ks比值略高于DK-vs-DD，但其值分别为0.214和0.209(图1)。4b）。来自2603个单拷贝序列的Ka / Ks比率的结果与先前的聚类分析的结果一致。Ka / Ks比率与不同物种的遗传关系成正比。Ka / Ks比率越高，距离越长。例如，DK-VS-DC的KA / KS比率最高，0.32，DK和DC物种之间的系统发育关系是最远的。相比之下，DK和DKV物种显示最接近的关系，其对应于0.20的最低Ka / ks比率（图。4b）。此外，总共16和39个单拷贝序列，分别从DK-VS-DKV比较的Unigene数据中获得了Ka / Ks比例> 1和0.5和1之间的单拷贝序列（表5）.

DK物种阳性选择下候选基因的检测

鉴定可能参与培养物种驯化的基因D. Kaki.，我们首先对Ka/Ks比值进行简单的两两比较，以获得候选PSGs;然后，应用严格的标准恶作剧(Probabilistic Alignment Kit)对同源物进行对齐，这被认为是更准确和有很少的假阳性。以DK为对照，共获得152条单拷贝序列(Ka/Ks > 1)，其中与碳水化合物代谢和酚类代谢相关的PSGs所占比例较高。选取与驯化相关的31个PSGs进行进一步分析。

利用“火关”柿的RNA-seq数据，利用同源克隆和RACE-PCR策略成功分离出31个PSGs基因的cDNA9：表S5）。在这些基因中，25例是全长编码序列（CDS），而其他基因是部分CDS。31候选PSG的功能集中在碳水化合物代谢和酚醛代谢上，大多数与驯化具有潜在的关系。几乎所有碳水化合物代谢相关基因的11个PSG都集中在果胶，木糖葡聚糖和二次细胞壁的代谢上，这对柿子果实的成熟具有显着影响。该数据集包含果酸酯酶（PE，EC 3.1.1.11），果胶裂解酶（PL，EC 4.2.2.10），β-半乳糖苷酶（β-加仑，EC 3.2.1.23），糖基转移酶（GT，EC 2.4）的全长CD．x.y), two PSGs of xyloglucan galactosyltransferase (XGT, EC 2.4.1.-), and five full-length PSGs of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH, EC 2.4.1.207). For the remaining 20 PSGs, almost all were involved in phenolic metabolism and contained the 18 full-length and 2 partial cDNA sequences and were associated with the reduction of soluble PAs. The astringency of persimmon fruit is usually caused by the accumulation of soluble PAs in the vacuoles. Thus, the astringency removal in the persimmon fruit is the important characteristic for cultivation and consumption. Acetaldehyde is thought to be directly involved in tannin coagulation, resulting in the loss of astringency in persimmon fruit [26.鉴定了3种丙酮醛代谢相关基因，包括醇脱氢酶（ADH，EC 1.1.1.1），丙酮酸脱羧酶（PDC，EC 4.1.1.1）和丙酮酸激酶（PK，EC 2.7.1.40）基因。此外，发现了14种乙醛代谢调节剂，含有5种乙烯响应转录因子（ERF）和9种NAC转录因子。最后，获得了Pa生物合成相关基因，例如白藻藻蛋白还原酶（Lar，EC 1.17.1.1）基因和2个多药和有毒复合挤出（配偶）转运蛋白基因。

为进一步分析31个PSG基因与DK驯化的关系，采用qRT-PCR方法对9个PSG基因进行分析Diospyros.样本（附加文件9：表S5和图3。6）.总共23个PSG的基因显示DK物种中的高丰度转录水平。有趣的是表达了这个PDC.，PK,守护神，抗利尿激素,和4小块土地（UNIGENE0021478，UNIGENE0029490，UNIGENE0033066和UNIGENE0029047）和NAC（UNIGENE0039221，UNIGENE0018681，UNIGENE0045523，UNIGENE0045523，UNIGENE0045523，UNIGENE00171117）基因最高，在DKV物种中是第二高的，并且在DC物种中最低。它们的表现出类似的模式，总体而言，具有系统发育分析，表明DK与DKV，DD，DO，DJ，DL，DG，DV和DC物种最接近最远的关系（图。4答和图。6）.对于其余的8个psgMAET（Unigene0023564）基因在DJ物种中具有最高的转录水平，而其他基因在DKV样品中表现出最高的表达。DK物种中的相对随机表达可能是由于allohexaproidy的复杂遗传特征是缺陷的。通常，大多数PSG基因在DK物种中具有高转录物水平，表明这些基因大多数与栽培物种的驯化或调整有关。

另外，构建了基于31psg的表达的九个样品的系统发育树（图。6）.它表现出类似的模式，其具有从串联2603一对一单拷贝基因对准构成的系统发育分析（图。4一种）。DK和DKV聚集在一起，他们与DO和DD的片状有着密切的关系。而DK距离DC和DV物种群体最远的距离（图。6）.

DK种单拷贝基因est - ssr的鉴定

通常，est - ssr比随机基因组ssr在揭示遗传多样性方面更具有可移动性和优势，因为它们可能更高度保守[27.]．基于9个Diospyros.未成年人，共发现了53,387个SSR，最大和最小数量来自DK（9601）和DJ（3342）种（附加文件10.：表S6）。对于九个样本中共享的2603个单拷贝Orthogroups，共有3901个SSRS从3322个unigenes获得。最丰富的重复类型是三核苷酸，其次是二核苷酸（表6)，最主要的重复图案是AG/CT，其次是AAG/CTT和CCG/CGG(附加文件3.：图S2）。基于来自DK物种中的2603个单拷贝基因的361个含有SSR的未成熟，鉴定了432个SSR引物，选择120SSR以设计EST-SSR引物（表6和额外的文件11.：表S7）。为EST-SSR底漆设计选择的所有矫形器具有至少16bp的重复单元长度。为了评估这些引物的可靠性和可转移性，我们测试了50对18个个体的引物，代表九个样本Diospyros。在100个EST-SSRS中，66个SSR引物产生预期长度的清晰条带，而其他PCR产物表现出多于一个带，这可能是由高杂合子引起的。总共检测到168个扩增子。此外，我们确定了2个独特的扩增子DKSSR10和DKSSR39：前者在DC物种中不存在，但在其他物种中存在，后者在DJ物种中具有长扩增产物（附加文件4:图S3)。因此，DKSSR10和DKSSR39可以作为DK与其他物种的特异性分子标记。

DK是最经济上最重要的属植物Diospyros.它被认为起源于中国。但对该属植物的适应基因和种间亲缘关系的研究较少Diospyros.．在研究中，九个DK样品，从中国柿子（NFGP）的国家田间基因库中取样了一种变异和七种密切相关的物种。NFGP目前是最大的柿子种质银行之一，其中该属的1000多个遗传资源Diospyros.，来自中国、日本、韩国、以色列和美国，包括DK及其近缘种，均已保存[28.，29.]．然而，Genus没有可用于基因组测序数据Diospyros.，仅有少数DK物种的转录组序列被报道[30.］．这里，综合转录组资源为九Diospyros.产生样品并注释以研究其遗传关系并响应人工选择检测相关归化基因。我们生成了31,242个推定的正交组，包括来自九个样本的196,619名未成年人（附加档案8：表S4）和2603个Orthogroups由所有九个样本共享（图。3.）.9个样本的系统发育树，组成串联2603个一对一的单拷贝基因比对(序列数据S1)(图。4a)，表明DK和DKV物种聚集在一起，与DD和DO物种接近。这些结果与之前报道的模式相似，表明DK与基于DD和do的叶绿体基因组序列密切相关[5，8]．进一步推测，六倍体柿子可能是由四倍体DD和二倍体DO杂交而成。DK与DC的遗传距离最远，这与之前发表的结果一致[8]．

栽培物种最重要的品质性状是其商业价值大尺寸，高可溶性糖含量和低鞣含量。根据柿子编码区之间的Ka和Ks的比例检测参与柿子果实质量的基因[14.，15.]．具有Ka / ks> 1的配对基因被确定为通过自然或人工选择经历了快速发展[16.]．高于0.5的Ka / ks比是保守的截止值，但它也证明了在适度阳性选择下识别基因的有价值[25.]．在本研究中，由所有九个样品共享的2603个单拷贝Orthogous，当DK与其他物种进行比较时，总152个单拷贝序列具有Ka / Ks比> 1。在手动去除一些候选PSG后，由于潜在的误差，使用同源克隆和基于“霍轩柿子样本的RNA-SEQ数据的同源克隆和种族PCR策略成功地分离了31个PSGS基因（附加档案9：表S5）。阳性选择下最有趣的基因组与细胞壁降解和酚类代谢有关，与其他样品相比，DK物种中的最高表达也存在。编码PE蛋白的一种基因（UNIGENE0027789）涉及催化影响细胞壁组分之间相互作用的去甲基酯，这与柿子果实的软化和成熟相关[31.]．PL通过β消除反应降解果胶，在裂解多糖的末端形成4,5-不饱和键[32.]．XGT的两个PSGs，包括一个全长(Unigene0031115)和一个部分CDS (Unigene0029190)，参与了木葡聚糖的生物合成，木葡聚糖是纤维素微原纤维的主要交联组分[33.]．GT催化糖渣从活化的核苷酸糖转移到一系列与植物次生代谢物相关的受体分子，如次生细胞壁的生物合成和酚类挥发性物质的产生[34.]．

在这项研究中，基因PDC.，PK,小块土地,守护神与酚醛代谢有关的DK物种表达最高，其在柿子果实中具有低于除DC样品的其他物种中的PA含量，通常（图。2）.这一发现与先前报道的基因高表达相一致PDC.，PK,小块土地,守护神促进柿子果实的脱模[35.，36.]．应该注意的是，这些基因表现出类似的图案（图。6)，并进行系统发育分析(图5)。4a），表明DK具有与最远最近的关系，DKV，DD，DO，DJ，DL，DG，DV和DC物种。此外，与果实成熟或软化有关的其他基因也在阳性选择下，包括编码xth的基因（Unigene0031138，Unigene0031226，Unigene0031140，Unigene0022492，Unigene0031139），以及β-加热基因。XTH被认为通过放松细胞壁和加速果实软化在果实成熟中起主要作用[37.]．β-半乳糖通过裂解β-半乳糖键参与细胞壁生物发生和果实软化过程中的修饰[38.]．它们的高表达可能导致柿子比其他品种早熟。但在DK物种中存在x个低表达基因，这可能是由于异源六倍体遗传特性复杂，有待进一步研究。总体而言，DK物种中大部分PSG基因的转录水平较高，这进一步证明这些基因大多与栽培物种的驯化或适应有关。

在属的SSR的发展Diospyros.主要专注于使用传统富集的基因组图书馆的DK物种[39.]．最近，据报道，使用Roche 454测序技术发现42,711个SSR基因座，98个揭示了15个DK基因型之间的多态性[40]．但是，有些与DK的密切相关的物种仍然缺乏SSR信息。在这项研究中，我们根据RNA-SEQ数据在九个中开发了EST-SSRDiospyros.样品，包括各种柿子和七种野生物种。共有53,387个SSRS从九个样品中的41,586个unigenes获得。那些新的SSR标记来自Diospyros.物种对遗传学研究和育种应用更有用。三核苷酸重复是最丰富的重复基序，然后是二核苷酸重复，与之前的报告一致[41.]．

选取100个ssr引物进行EST-SSR引物设计(表1)6和额外的文件11.：表S7）从九个样本共享的2603个单拷贝Orthogoups，66％的产品在所有九个样本中展出了多个乐队。我们的PCR成功率高于前一项研究中的[40]但它略低于橡胶中报告的那些[42.]．34对引物无法产生扩增子可能是由于引物在剪接位点的位置、嵌合引物、序列质量差或杂合度高。大多数产物仅呈现一条条带，这可能是由于基因座的纯合性Diospyros.样品，所有引物来自单拷贝基因。此外，我们的研究发现，DKSSR10和DKSSR39分别在DC和DJ物种中是唯一的（附加文件7：图S3），它们可能用作特定物种的分子标记，以区分Diospyros.物种。

在这项研究中，我们在九个样品上进行了转录组测序，包括DK，各种DK（DKV）和七种密切相关的物种（DJ，DC，DV，DO，DG，DD和DL），以评估三种遗传分歧并识别参与柿子驯化的候选基因。总共483,421个未完成40025万张清洁读数，并获得2603个在所有样品中共享的Orthogroups。基于串联2603一对一的单一拷贝基因对准建立了系统发育树，表明DK与DKV密切相关，与DD的疏口和DO物种聚集。进一步支持这些发现，柿子是从DD和Do种之间的交叉开发的。此外，鉴定和分离出31psg，其参与碳水化合物代谢和酚类代谢，并在DK或DKV物种中具有更高的表达。确定这些基因可能导致DK物种的驯化。最后，我们确定了2个独特的扩增子（DKSSR10和DKSSR39），其可能潜入特定的分子标记以区分Diospyros.物种。我们的分析表明候选人PSG可能对柿子亲属的适应，驯化和形态至关重要。

材料

9个样本包含8个Diospyros.物种，即DJ，DC，DV，DO，DG，DD，DL，DK和DKV（各种DK（也称为野外柿子）是从NFGP，陕西省陕西省陕西省（34°17'42.80）获得“N，108°04'8.21”e）（图。1和表格1）.不同组织，包括叶，茎，水果和花，从每种物种的至少10个中取样。所有样品均用液氮快速冷冻，并储存在-85℃。2018年10月31日在NFGP中收集了生理评估和形态特征的样品。

水果生理学评价

根据我们之前的报告，使用Folin-Ciocalteu方法测量可溶性和不溶性的原花青素（PAS）[31.]．使用UV-2450分光光度计（日本Shimadzu，日本）在725nm下测量吸光度。使用Atago PR-101的数字折射计（PR-101，Atago，Japan）的数字折射仪测量可溶性固体含量（SSC）。根据教学手册，由GY-4硬度测试仪（顶级仪器有限公司）确定了坚定性。将直径的圆柱形探针11.1mm压在剥离的果实中以深度为10mm。渗透试验以5mm / s（2秒至最大深度）的速率进行。在水果赤道上每次治疗中的每一个果实中的每一个测量SSC和固定性。

RNA提取和Illumina测序

根据制造商的协议，使用RNAPLANT Plus试剂（天根生物科技有限公司）分离来自每种样品的总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，USA）和RNase - 无琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量和数量。合并每个物种的不同组织（叶，茎，水果和花）的等量的高质量mRNA用于cDNA文库构建和Illumina测序。对于测序，使用NEBNEXT Ultra™RNA库预备套件为Illumina Inc.（Neb，USA），根据制造商的协议根据制造商的协议产生CDNA文库。然后，使用Illumina Hiseq PE150平台（Illumina，San Diego，CA）测序文库制剂。图书馆施工和illumina测序在Sagene Biotech Co.，Ltd。（中国广州）进行。

DE NOVO集装和功能注释

Illumina公司测序产生的原始数据被过滤删除适配器序列,不到20基点的读取,读取的未知的基本要求(Ns)的比例高于5%,和读取劣质基地(Q < 5)的比例超过50%。每个文库的转录组从头组装都是通过Trinity项目进行的[43.]．

来自最终转录组组的组装的unigenes通过使用基本局部对准搜索工具（BlastX）对NR（NCBI NOREDURMATEM数据库，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)， Swiss-Prot(一个手动注释和回顾的蛋白质序列数据库，http://www.expasy.ch/sprot/)、KEGG(京都基因和基因组百科全书，http://www.genome.jp/kegg/）和COG（蛋白质群体群体，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）蛋白质数据库，施加1E-5的电子值阈值。基于高分辨率对准或最佳对准结果确定Unigene序列的方向。从不同的数据库中生成的不一致对齐结果是按照NR，Swiss-Prot，Kegg和Cog的优先顺序结算。当Unigene在任何数据库中不匹配条目时，Esscan程序[44.用于识别编码区和序列方向性。

使用BLAST2GO获得unigenes的基因本体（GO）术语[45.]并且通过Web基因本体注释图（Wego）软件计算Go功能分类[46.]查看物种在宏观层面的基因功能的分布。COG分类和KEGG代谢路径注释是使用BLASTALL软件对抗COG进行的[47.]和KEGG [48.]数据库分别。丰富分析使用了自定义Perl脚本。

正牙鉴定和系统发育分析

9个体系中同源物的鉴定Diospyros.样品采用正thomcl分析。OrthoMCL软件[23.选择用E值<1E-15和2.0的充气参数计算矫形器的簇。排除了少于150bp的unigenes。仅用于每种物种至少一个序列的直晶基因簇用于Ka / Ks和Psg的进一步分析。用肌肉软件对准，具有所有样品共享的单拷贝基因（一对一的Orhologs）的推定的正非群体[49.使用默认参数。单拷贝基因是指在同源组中每个样本中只有一个基因。然后，在ClustalX程序中使用Neighbor-Joining方法构建了一棵系统发育树(unroot phylp tree)，用于假定的只有单拷贝基因的同源群。50.)(1000年白手起家)。

KA / KS和PSG的分析

在KaKs_Calculator中，估计每一对同源编码区之间的Ka和Ks的比值[24.]使用具有YN模型的最大似然方法。在这项研究中，计算了同义和非同义网站，KA / KS比率，GC内容和序列长度去除终止终止密码子和每个orthologog对的间隙[51.]．一系列严格的标准用于确保PSG的可靠性[51.，52.，53.，54.，55.]．首先，术语序列对P-value (Fisher test) > 0.05或a Ks率> 0.1，被排除在PSGs的识别之外，以避免潜在的谬误[52.，53.]．其次，当通过Megablast方法彼此展示时，保留了地外序列的进一步分析，并且它们的对齐长度超过150bp [54.，55.]．第三，从进一步的分析中排除了与意外止屠密码子的对齐序列[51.]．最后，Ka / Ks> 1被设定为PSG的截止，表明基因通过自然或人工选择经历了快速发展[16.]．在中度阳性选择下，建议Ka / ks比例> 0.5作为基因的适当阈值[25.]．

定量逆转录PCR（QRT-PCR）

QRT-PCR在ABI一步加上实时PCR系统（Applied Biosystems，CA，USA）中进行。PCR反应混合物（总体积为20μL总体积）包括10μLSYBR®预混物EXQ™II（TLI RNASEH PLUS）（TARI RNASEH Plus）（Takara，大连，中国），7.4μlDDH₂o，1.0μl稀释的cDNA，每种底漆（10μm）0.8μl。标准PCR条件有三个步骤如下：在95°C时4分钟;然后45个循环为95°C;57°C 30秒;和72°C 30秒。DKACTIN.［56.]被设置为内部参考，每个样本都以四套进行，并且所有引物都列在附加文件中9:表S5。

抗利尿激素:

醇脱氢酶

CDSS：

编码序列

DC:

Diospyros Cathayensis.

DD：

Diospyros deyangnsis

DG:

Diospyros glaucifolia

DJ：

Diospyros Jinzaoshi.

DK：

Diospyros Kaki.

健康险公司:

Diospyros Kaki.var。Silvestris（各种DK，也称为野性柿子）

DL：

Diospyros Lotus.

做：

Diospyros.oleifera.

DV：

Diospyros Virginiana.

EST-SSR：

表达序列标签 - 简单序列重复

走:

基因本体论

GT：

糖基转移酶

iRAPS：

再横向跨越多态性

它的：

内部转录序列

卡:

非唯一的替代

Ks:

同义替代

LAR：

Leucoanthocyanidin还原酶

配偶:

多药和有毒复合挤出

ngs：

新一代测序

PAS：

原花青素

PDC:

丙酮酸脱羧酶

pe：

果胶酯酶

PK:

丙酮酸激酶

PL：

果胶裂解酶

Psgs：

肯定选择基因

refaps：

Retrotransposon微卫星扩增多态性

XGT:

Xyloglucan半乳糖基转移酶

xth：

Xyloglucan endotransglucosylase /水解酶

β-gal：

苷酶

不适用。

资金

中国国家自然科学基金（31701877），中国（2018YFD1000606），中国陕西省自然科学基础研究计划（2017JJ33018）和中国农业作物种质保护项目的支持部（2018NWB035）。

可用性数据和材料

为九个生成的Illumina测序读数Diospyros.使用生物摄取中沉积在NCBI中的沉积SAMN10319678（DD），SAMN10319679（DD），SAMN10319681（DG），SAMN10319682（DG），SAMN10319683（DV），SAMN10319684（DC）和SAMN10319685（DKV）.

作者指出

1. 昌福关和蜀元刘同等为这项工作贡献。

从属关系

1. 陕西712100，陕西712100，园艺学院作物压力生物学作物应力生物学作物重点实验室

   关长飞，刘树元，王梦珂，纪浩，阮晓峰，王仁子，杨勇

贡献

Y-Y, G-CF, L-SY构思设计实验;G-CF、W-MK进行了实验;G-CF、L-SY W-MK、J-H参与数据分析;G-CF和L-SY撰写稿件;R-XF和W-RZ帮助审阅和编辑稿件。所有作者阅读并批准最终稿件。

相应的作者

对应于永阳．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

开放访问本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并说明是否有更改。“创作共用公共领域”豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

重印和权限