比较蛋白质组分析为木瓜的调控机制提供了新的见解(gydF4y2Ba卡里卡番木瓜gydF4y2Ba果实成熟过程中的外果皮gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

木瓜(gydF4y2Ba卡里卡番木瓜gydF4y2Ba是一种常见的更年期水果，在成熟过程中经历各种理化变化。虽然木瓜被广泛种植和消费，但从蛋白酶体水平研究其成熟过程中代谢变化的研究却很少。采用新开发的TMT-LCMS分析方法，对木瓜果实不同成熟期的蛋白质组进行了研究。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

共鉴定了3220个蛋白，其中2818个蛋白进行了定量。差异积累蛋白(DAPs)表现出不同的生物学功能和不同的亚细胞定位。KEGG富集分析表明，不同代谢途径发生显著改变，特别是类黄酮和脂肪酸代谢。几种类黄酮生物合成相关蛋白的上调可能为色素生物合成提供更多的原料，加速木瓜果实颜色的变化。研究了果实成熟过程中脂肪酸代谢和细胞壁降解相关蛋白的变化。此外，还测定了几种重要脂肪酸的含量，不饱和脂肪酸的增加可能与木瓜果实挥发性成分的形成有关。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的数据可能会给木瓜果实成熟过程中代谢变化的内在解释。gydF4y2Ba

果实是一种成熟的卵巢，包括肉饼组织，几个肉质水果是人和动物饮食的重要组成部分[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．水果成熟是一个复杂的过程，其定义是剧烈的新陈代谢和结构转变、颜色变化、软化、营养成分积累和风味复合生产[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．虽然软化增加了水果的营养和风味特性，但它也会导致生物量损失和采后变质[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

水果软化是一个深入研究的过程，涉及细胞壁降解[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．水果细胞壁由果胶、聚半乳糖醛酸、纤维素和半纤维素组成，这些成分的降解是导致成熟过程中组织软化的主要原因[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．由线性和支链多糖组成的果胶基质主要积聚在主细胞壁中。几种特异性酶，例如果胶酶，聚半乳糖醛酸酯和果胶甲基酯酶，显示出在果胶基质的多糖链的水解中的基本作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

对于更年性的水果，软化现象也由复杂的一系列非酶活性控制[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在果实熟化期间，丰富的风味和营养代谢物显着变化，包括糖，有机酸，脂质和氨基酸，导致水果纹理的改性[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．例如，糖，杏果实的主要风味和香气成分，在发育和成熟过程中迅速增加[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．在富含淀粉的水果中，淀粉和有机酸通过代谢降解途径转化为糖[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．另外，假设果实的脂质组分增强了大多数血液果实中的香气和香料的形成[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．在不同的更年期果实中，已揭示了果实成熟过程中脂肪酸组成的变化[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．例如，在芒果果实的成熟过程中，大多数脂肪酸增加了[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

木瓜(gydF4y2Ba卡里卡番木瓜gydF4y2BaL.），一种广泛种植和消耗的更长性水果，显示出快速软化和短的保质期[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．一旦跃变型果实成熟后，其质地柔软和易受病原真菌使存储寿命短[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］．为了克服商业贸易问题，延长木瓜的保质期，人们进行了许多研究[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．在木瓜果实中，成熟过程中的理化变化受成熟相关基因表达的影响。之前的一个转录组鉴定出414个成熟相关基因，包括MADS-box、NAC和ERF家族的基因，提供了木瓜的分子信息[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．几年前，通过cDNA末端快速扩增和PCR引物行走技术，在木瓜中鉴定出了一个果实特异性表达的枯草酶基因[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．1-MCP(1-甲基环丙烯)的应用可以阻断乙烯信号，从而延长保质期[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．乙烯信号通路相关基因的表达分析表明低温损伤与木瓜乙烯信号通路的关系[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．研究了果胶在木瓜细胞壁中的生理降解。例如，PG、内聚糖酶和β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因表达水平上调与木瓜果实采后成熟呈正相关[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．然而，木瓜果实在成熟过程中软化的分子和酶机制仍然是未知的。gydF4y2Ba

人们对木瓜果实成熟过程中的生理和基因组变异进行了许多研究[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．到目前为止，已经发表了一些木瓜的蛋白质组学数据集。利用2-DE方法，已经鉴定出在成熟过程中对1-MCP处理响应的差异积累蛋白[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．另一个比较蛋白质组学分析表明，某些蛋白质如烯醇酶，酯酶和ADH3，表明体细胞纸胚细胞成熟中的重要作用[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．近年来，病毒感染前开花的差异蛋白质组gydF4y2Ba番木瓜gydF4y2Ba与未受感染的植物的比较[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．本研究采用高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS /MS)相结合的方法，对木瓜果实成熟过程中2818个差异积累蛋白(DAPs)进行了鉴定。本研究结果为延长木瓜果实采后的保质期提供了重要信息。gydF4y2Ba

植物材料和抽样gydF4y2Ba

两岁的木瓜品种“日出”以4米× 4米的排列方式种植。木瓜树苗由中国湛江益新园艺公司购买，并获得许可用于我们的科研。该实验站位于中国湛江的岭南师范大学校园。根据岭南师范大学研究伦理委员会批准的植物方案，在岭南师范大学生命科学与技术学院进行植物实验。所有木瓜树每周用标准营养液施肥两次gydF4y2Ba_．gydF4y2Ba收获了类似颜色破裂阶段（5％≤剥离颜色≤10％黄色）的两组。果实着色指数定义和计算如下：gydF4y2Ba\(mathm {coloring}\ \ mathm {index}= sum \frac{left(\ mathm {coloring}\ \ mathm {grade}\times \ mathm {number}\ mathm {of}\ mathm {right)} \ mathm {total}\ mathm {number}\ mathm {of}\ mathm {fruit}}。\)gydF4y2Ba

一个样品中有三种番木瓜，一组三种样品。用去离子H清洗所选水果gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO，然后将0.2％的次氯化物溶液中浸入15分钟以消除我们实验室生长室中的潜在微生物。腔室的条件设定为：温度为26±1°C，光/暗循环为16/8 h和湿度为65-70％。gydF4y2Ba

生理参数测量gydF4y2Ba

木瓜果实的生理参数的测量是根据先前的研究中进行的[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］．使用了三个生物重复。简单地说，用GY-J微型水果测试仪(托普仪器有限公司，中国上海)测定了水果的硬度。总可溶性固形物(TSS)的测定，从三个独立的水果中手动粉碎5.0 g的果肉，用臼和杵提取果汁。TSS(%)用J1-3A折射仪(广东科学仪器公司，中国广州)测量。同样的果汁用0.1 N NaOH滴定，直到在终点得到淡粉色，可滴定酸度以百分比柠檬酸表示。为了测定呼吸速率，每组取三个独立的木瓜果实称重，并在25°C下密封在2 L容器中。CO浓度gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在每个容器中使用Li-6262 CO红外测量gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO气体分析仪(LI-COR，美国)。gydF4y2Ba

光学显微镜和扫描电子显微镜观察gydF4y2Ba

采集不同成熟期全果表面组织0.5 cm长的碎片。样品在福尔马林醋酸(FAA)中固定gydF4y2Ba_50.gydF4y2Ba转至70%乙醇中。组织样本在不同浓度的乙醇中脱水，然后包埋在蜡中。接下来，使用RM2255旋转切片机(德国Wetzlar徕卡)将水果样本切成12 μm厚的切片，并铺在玻片上。石蜡切片在二甲苯:乙醇(1:1,v/v)溶液中除去5分钟，并在不同浓度的乙醇(包括100、95、85和70%)中再水合1分钟。用3%藏红花素对载玻片进行染色24 h，然后用70、85和95%浓度的乙醇洗涤，每次洗涤5 s。然后，将载玻片浸入1%牢绿染料溶液中，每次浸泡3 s，用100%乙醇处理2次，每次浸泡5 s，再转移到二甲苯:乙醇(1:1,v/v)溶液中浸泡5 min。所有载玻片都用合成树脂安装，并在LSM510激光扫描系统(卡尔蔡司，Wetzlar，德国)下观察。gydF4y2Ba

扫描电镜样品如上所述。将样品片段在45℃下轻轻浸入二甲苯中浸泡4小时，以清洁蜡。用二甲苯:乙醇(1:1,v/v)溶液和100%乙醇处理1 h，然后放入叔丁醇中。最后，将干燥的切片用金金属化，进行扫描电镜观察。gydF4y2Ba

蛋白质提取gydF4y2Ba

蛋白提取是根据之前的研究进行的[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．约0.5 g外果皮样品保存在NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和粉碎。将细粉末悬浮在预冷的裂解缓冲液，含有8M尿素，2mM EDTA，10mM DTT和1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒，过夜。在15,000下除去沉淀物 ggydF4y2Baby centrifugation at 4 °C for 15 min. The final supernatants were redissolved in buffer containing 8 M urea, and 100 mM triethylammonium bicarbonate (TEAB) and quantified by a 2-D Quant kit (GE Healthcare, Beijing, China).

消化和串联标签（TMT）标签gydF4y2Ba

The soluble samples were dissolved in 10 mM dithiothreitol buffer for 1 h at room temperature. The sample solution was alkylated with 20 mM iodoacetamide for 30 min at 25 °C in darkness. Then, the samples were redissolved in 100 μL of TEAB (100 mM). For the first digestion, trypsin (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5113, Promega) was added at 1:50 (trypsin:protein) overnight and 1:100 (trypsin:protein) for a second digestion for 4 h. Approximately 200 μg of protein for each sample was treated for further experiments. The digestion was carried out at 25 °C.

然后，样品通过Strata X 33 μm C18 SPE柱(8B-S100-AAK, Phenomenex, Torrance, CA, USA)脱盐，并使用6-plex TMT试剂盒(thermoscientific, Rockford, USA)重建。以10000 ×离心收集上清gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。最后，上清液随机标记不同的TMT试剂(thermoscientific)。具体地说，在24 μL乙腈中重建标记100 μg蛋白样品所需的tmt标记液量。将混合物在室温下培养2 h。最后，收集样品并进行干燥，以便进一步分析。gydF4y2Ba

分离和LC-MS /MS分析gydF4y2Ba

采用Agilent 300Extend C反相高效液相色谱法将多肽样品分离成不同的组分gydF4y2Ba_18.gydF4y2Bacolumn (5 μm particles, 4.6 mm ID, 250 mm length, Santa Clara, CA, USA). The samples were detected at wavelength 250 nm. Then, the peptides were combined into 18 fractions and dried.

将分离的样品溶解在0.1％甲酸（Fa）溶液中，并直接装载到Acclaim Pepmap 100反相前（25cm长，2μm，Thermo，Shanghai，China）。梯度占溶液B的增加，含有0.1％的Fa在98％ACN中，在8分钟内为4-22％，在8分钟内为22-35％，在3分钟内爬升至80％并保持80％3分钟，使用Easy-NLC 1000 UPLC系统（Thermo，Shanghai，China），恒定流速为320 nL / min。肽样品对纳米喷雾电离源进行纳米喷雾电离源，然后在Q. exactive™（Thermo，Shanghai，China）中的MS / MS耦合到在线UPLC [gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba］．MS蛋白质组学数据已由PRIDE合作伙伴存储库计划在标识符PXD008871下设置到ProteomeXchange联盟。gydF4y2Ba

平行反应监测(PRM)验证DAPsgydF4y2Ba

用PRM方法确认LC-MS-TMT分析中发现的DAPs的变化。在这个实验中，三个独立的样品被获得的质谱/质谱鉴定。使用了三个生物重复。将tryptic peptide溶解在0.1% FA溶液中，直接加载到反相分析柱(150 mm长，75 μm, Thermo, Shanghai, China)上。解决方案B含有0.1% FA和98%的梯度,由一个增加的内容在38分钟6 - 25%,在14分钟25至38%,攀升至80%的4分钟,4分钟,维持在80%,一个常数400 nL /分钟的流量。gydF4y2Ba

数据库搜索gydF4y2Ba

使用MaxQuant使用集成的Andromeda搜索引擎V.1.5.2.8进行处理MS / MS数据。对番木瓜基因组数据进行搜索MS / MS数据（gydF4y2Bahttp://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlgydF4y2Ba）与反向诱饵数据库连接。胰蛋白酶/ p用作切割酶，允许高达两种缺失的切割。对于前体离子，将质量误差设定为10ppm，对于片段离子，质量误差设定为0.02Da。对于蛋白质定量，在Maxquant中选择TMT 6-PLEX。对于肽和蛋白质鉴定，将假发现率（FDR）阈值调节至<1％，并且肽离子评分设定为≥20。gydF4y2Ba

注释方法gydF4y2Ba

我们的蛋白质组的基因本体论(GO)注释来源于UniProt-GOA数据库(www。gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/GOA/gydF4y2Ba)．首先，将所有鉴定的蛋白id转换为UniProt id，并将其映射到GO id。然后利用InterProScan软件基于蛋白质序列比对方法对UniProt-GOA数据库未标注的蛋白质进行标注。gydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组（KEGG）数据库（gydF4y2Bahttp://www.genome.jp/kegg/gydF4y2Ba)用来注释蛋白质途径。首先，KEGG在线服务工具KAAS (gydF4y2Bahttp://www.genome.jp/tools/kaas/gydF4y2Ba）用于注释蛋白质的Kegg描述。然后，注释结果使用在线工具Kegg Mapper映射到Kegg Pathway数据库（gydF4y2Bahttp://www.kegg.jp/kegg/mapper.htmlgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

亚细胞定位预测软件WOLFPSORT用于预测亚细胞定位(gydF4y2Bahttps://wolfpeort.hgc.jp/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

功能富集分析gydF4y2Ba

在DAP站内，费舍尔的检验来分析GO和KEGG功能富集。校正假说进行了使用的FDR控制方法。GO和KEGG类别与校正gydF4y2BaPgydF4y2Ba-Value <0.05被认为是显着的。使用MEV软件分析K-Means集群。为了满足分层聚类方法的要求[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

脂肪酸含量测定gydF4y2Ba

根据前期研究制备脂肪酸甲酯[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba只做了几处小的改动。使用了三个生物重复。将40毫克的水果样本放入15毫升的试管中。然后，向玻璃管中加入乙醚和正己烷(1:1,v/v)的混合物2ml，甲醇溶液中2-mol/l KOH的2ml和甲醇的2ml。混合溶液在50°C的水浴中摇匀30分钟。当溶液冷却后，向试管中加入2ml去离子水。收集上层样品，进行气相色谱-质谱分析。以0.8 mL/min的恒定流速作为载气。烤箱温度最初设置在170°C，持续30秒，然后以5°C/min的速度提高到230°C，并保持在230°C 13分钟。质谱在70 eV的电子模式下使用，扫描范围为30-450 m/z。gydF4y2Ba

成熟过程中木瓜果实的微晶和生理变化gydF4y2Ba

收集并分析了两组在收获后0和8 D的两组番木瓜水果（每组五个）。在成熟过程中番木瓜剥离表现出表皮和亚表皮细胞的形态变化。0d的果实有光泽表面，并且在8 d处有不规则的表面（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba广告）。在0天，Peel由具有牛形状的表皮细胞组成（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae)。第8天，上层细胞呈水平伸长，细胞高度相应降低(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).果实的硬度在成熟过程中迅速下降。果实呼吸速率在8 d显著高于0 d。果实成熟过程中，木瓜的TSS显著升高，TA显著降低。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba胃肠道)。gydF4y2Ba

质量控制和定量蛋白质组分析gydF4y2Ba

定量分析了两个不同成熟期木瓜果实蛋白质组的变化。2个阶段× 3个重复的相关系数表明MS数据具有良好的重复性(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个)。测量鉴定的肽的质量误差 - 大多数质量误差<0.02da，它们的分布接近0（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).所鉴定的多肽长度均在8-16 Aa范围内(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。为了在额外的文件中显示所有蛋白质的更多详细信息，GO，Kegg，Domain和亚细胞定位注释都显示出所有蛋白质gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

果实成熟过程中DAPs的鉴定gydF4y2Ba

共有960层的DAP，包括425上调和535下调的蛋白质，鉴定了（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．在DAPs中，上调幅度最大的5个蛋白是三磷酸水解酶超家族蛋白(9.3倍)，其次是胰蛋白酶抑制剂和哈格曼因子样蛋白(8.4倍)，生长样锌结合脱氢酶家族蛋白(7.7倍)，1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(7.6倍)和谷氨酰胺转氨酶(7.6倍)。下调幅度最大的5个蛋白分别为3个叶绿素a - b结合蛋白(34.5倍、21.2倍和14.7倍)、1个PsaB蛋白(16.7倍)和1个光系统I 11 K家族蛋白(15.6倍)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．预先预测点的亚细胞位置（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．对于诱导蛋白，共鉴定了11个不同的组，如叶绿体-(146个)，胞质-(122个)，核-(58个)，线粒体-(29个)和质膜定位蛋白(28个)(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．对于降低的蛋白质，鉴定了14个组分，包括叶绿体 - （193蛋白），细胞溶质 - （167），细胞核 - （58），细胞外 - （25）和质膜膜 - 局部化蛋白（25）（附加档案gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

果实成熟过程中腐蚀分析gydF4y2Ba

总共有332个dap被分配到至少一个GO学期。对于上调的蛋白质，高度富集的“分子功能”GO术语是“α -氨基酸生物合成过程”、“细胞氨基酸生物合成过程”、“羧酸生物合成过程”、“色素代谢过程”、“细胞脂质代谢过程”、“类异戊二烯代谢过程”、“有机酸生物合成过程”和“小分子生物合成过程”;显著富集的“生物过程”GO项分别为“光系统I”、“光系统II”、“类囊体膜”、“膜的外部组分”、“光合膜”和“类囊体部分”(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).对于下调的蛋白，高度富集的‘Biological Process’GO项与‘光系统I’、‘光系统II’和‘类囊体膜’相关;在“分子功能”中，富集最显著的术语是“钙离子结合”、“肽酶抑制活性”和“肽酶调节活性”;在“细胞成分”中最丰富的术语是“细胞壁修饰”、“光合电子传递链”和“光合作用，光反应”(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

上调蛋白多与“次生代谢产物的生物合成”和“脂肪酸的生物合成”有关;下调的蛋白主要参与“光合作用”和“乙醛酸盐和二羧酸盐代谢”gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

上调蛋白主要包含一个“异openicillin N合成酶样”结构域，下调蛋白主要包含一个“叶绿素a/b结合蛋白”结构域gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

果实成熟过程中病原菌防御相关蛋白的参与gydF4y2Ba

我们确定了一些病原体防御相关蛋白：五个致病相关（PR）蛋白，四微管蛋白（TUB）蛋白家族，SKP1（SUGT）蛋白质的G2等位基因的一个抑制，一种植物病原体相互作用（PTI）的蛋白质，4个核仁（NCL）蛋白，五个热休克蛋白（HSP），一个甘油激酶（GLPK）蛋白，四钙依赖性蛋白激酶（CPK）的蛋白质，三个核苷酸门控通道（CNGF）蛋白，五钙结合蛋白（CMLS），两个钙调素（CALM）蛋白和油菜素类固醇一个不敏感的1相关受体激酶1（BAK1）（附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．然后，这些病原体防御相关蛋白的亚细胞定位进行了预测，主要是在叶绿体，细胞质和细胞核。此外，二CNGFs和一个CML被预测为位于质膜，一个PR蛋白位于细胞外和一个HSP90蛋白定位于液泡膜（图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

在这些病原体防御相关的蛋白质中，九颗被定量为脂肪果实成熟期间的点，有趣的是，大多数明显下调（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

脂肪酸代谢参与果实成熟过程gydF4y2Ba

在木瓜果实成熟过程中，脂肪酸相关的3个代谢途径发生了显著变化:“脂肪酸生物合成”、“脂肪酸代谢”和“脂肪酸降解”。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个)。对于“脂肪酸生物合成”途径，鉴定了两个下调和11个上调的蛋白质（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab);在“脂肪酸代谢”途径中，有4个表达下调，13个表达上调(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC）;并为“脂肪酸降解”途径，四下调和五个上调（图gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。参与脂肪酸代谢的酶被列入额外的文件中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

同时测定了果实成熟过程中几种重要脂肪酸的含量。在0 d和8 d时，共鉴定和定量了16种脂肪酸(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．值得注意的是，与0 d相比，四种脂肪酸 - 癸酸甲酯 - 甲基 - 癸酸甲酯，月桂酸甲酯，甲基棕榈酸甲酯和α-十二烷酸甲酸 -和四种脂肪酸 - 硬脂酸甲酯，甲酯，甲基磺酸和甲基LINOLEATE显着下调。剩余八种脂肪酸的含量没有显着改变。gydF4y2Ba

细胞壁相关蛋白在果实成熟过程中的参与gydF4y2Ba

许多酶，包括PG、果胶酯酶(PE)、α-半乳糖苷酶(α-GAL)、β-GAL、β-木糖苷酶、PL、expansin (EXP)、木葡聚糖内转糖基酶(XET)和内切葡聚糖酶(EG)，已知参与细胞壁代谢[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，3个PGs, 6个PEs, 2个α- gal, 1个β-GAL, 2个EXPs, 2个XETs和2个EGs被鉴定为DAPs。分析了成熟过程中细胞壁代谢相关蛋白的表达模式:除Unigene0023139外，所有PGs、α-GALs和大部分PEs均显著下调;所有β-GAL、exs、EGs和一个EXT (Unigene0032975)均显著上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

使用PRM验证果实成熟相关蛋白质的变化gydF4y2Ba

由于水果成熟过程极其复杂，很难确定一个单一的敏感生物标志物。相反，鉴定一组反映水果成熟过程的候选酶将有助于更好地理解这个复杂的过程。为了验证木瓜果实成熟过程中几个关键酶的差异表达，我们使用了PRM。共筛选出16个关键蛋白进行PRM验证，包括5个脂肪酸代谢相关蛋白、2个病原体防御相关蛋白、2个乙烯生物合成相关蛋白和7个细胞壁生物合成相关蛋白gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba)．来自不同样品组的几个关键蛋白的相对丰度在图1和2中示出。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．这些通过的DAP PRM确定的趋势与我们的TMT-标签定量结果一致。gydF4y2Ba

果实成熟涉及多种修饰过程，包括淀粉-糖转化、细胞壁降解、风味物质和色素生物合成以及代谢重排[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．木瓜作为一种极具可塑性的水果，其软化特性是决定其市场价值的重要因素[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．越来越多的研究集中在调控果实更年期成熟的分子和生化机制上。在我们的研究中，对参与成熟过程的DAPs进行了综合分析。gydF4y2Ba

使用2DE方法进行了番木瓜果实的几种蛋白质组学分析。例如，PMEV感染的番木瓜的蛋白质组学分析鉴定了总共486个可重复的斑点，其中钙霉素和蛋白酶体亚基20s和RPT5a在感染期间上调[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba］．对更年期和非更年期木瓜果实蛋白质组的差异分析显示，有27种蛋白质在成熟过程中存在高度差异[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．体细胞胚胎的比较蛋白质组学分析确定了76个斑点，表明聚乙二醇在木瓜体细胞胚胎发育中的作用[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．我们共鉴定了3220个蛋白质，并对2818个蛋白质进行了量化，这比之前发表的木瓜果实蛋白质组数据要多[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．拥抱综合信息允许我们探索熟练过程中可能涉及，直接和间接地涉及的新蛋白质/基因。gydF4y2Ba

乙烯产量的急剧增加被认为是在成熟的初始阶段的更严重果实的标记特征[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．在高等植物中，ACC合酶和ACC氧化酶在乙烯生物合成中的重要作用已经得到了很好的研究[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．在番木瓜中，将两种不同的ACO基因鉴定为参与木瓜果实成熟[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．在上调的蛋白列表中，最显著的是两种ACC氧化酶，在成熟过程中分别上调了7.6倍和1.8倍(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在2DE-Dige分析中还报告了类似的结果[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．我们的数据确认了乙烯在番木瓜果实成熟中的关键作用。gydF4y2Ba

肉质果实成熟与病原菌侵染敏感性的变化有关，在成熟过程中对病原菌侵染的抗性显著降低[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．病原体相关蛋白(PRs)在多种功能中发挥作用，特别是在防御病原体方面[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．在木瓜果实中，8个病原体相关因素显着降低，只有一个显着诱导（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab），表明番木瓜果实在成熟期间可能会降低番木瓜抗性。gydF4y2Ba

在成熟过程中的代谢变化导致初级和次级代谢产物的改变，如氨基酸、脂肪酸、糖、多酚和肉桂酸[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．我们的KEGG富集分析显示，在成熟过程中，各种代谢途径发生了显著变化，表明代谢与木瓜果实成熟密切相关。黄酮类化合物是果实中普遍存在的次生代谢产物，在果实着色、非生物胁迫防御等生物学功能中发挥重要作用[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］．在枣椰树中，花青素生物合成相关的蛋白质在成熟开始和成熟过程中被上调[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．同样，在木瓜成熟过程中，几种类黄酮生物合成相关蛋白上调:肉桂酸-4-羟化酶、香豆素-3-羟化酶和黄酮-3-羟化酶(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．黄酮类化合物的增加可能为色素生物合成提供原料，加速木瓜果实的颜色变化[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

有趣的是，我们的KEGG富集分析突出了三个脂肪酸代谢途径，一些脂肪酸代谢相关酶也被鉴定为DAPs(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．对各种水果植物果实发育和成熟过程中脂肪酸组成的变化进行了研究。例如，ω-6和ω-3脂肪酸水平在芒果果实发育和成熟过程中发生了显著变化[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．催熟提出的多不饱和脂肪酸的含量在番茄果实[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，评估和分析了木瓜果实成熟过程中脂肪酸的变化(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．在16种量化的脂肪酸中，8在熟化过程中显示出显着的变化（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．在番茄果实中，成熟增加了不饱和脂肪酸的含量[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．木瓜中棕榈油酸甲酯和α-十八碳三烯酸甲酯两种不饱和脂肪酸在成熟过程中显著上调。不饱和脂肪酸的增加可能与木瓜果实挥发性的形成有关[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

综上所述，共检测到3220个蛋白，其中2828个进行了定量。其中，大部分病原菌相关蛋白在成熟过程中下调。此外，黄酮类化合物和脂肪酸代谢在成熟过程中也发生了很大的变化;而不饱和脂肪酸可能与木瓜果实挥发性成分的形成有关。我们的数据可能会给出新陈代谢变化的内在解释，并为如何延长采后木瓜的保质期提供重要信息。gydF4y2Ba

在目前的研究中生成和分析的数据集可在PRIDE合作伙伴存储库计划的ProteomeXchange联盟中获得，识别码为PXD008871。gydF4y2Ba

1-MCP:gydF4y2Ba

1-methylcyclopropenegydF4y2Ba

二:gydF4y2Ba

二维凝胶电泳gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

华:gydF4y2Ba

ACC氧化酶gydF4y2Ba

BAK1:gydF4y2Ba

油菜素类固醇不敏感的1相关受体激酶1gydF4y2Ba

冷静的：gydF4y2Ba

钙调蛋白gydF4y2Ba

CML:gydF4y2Ba

钙结合蛋白gydF4y2Ba

CNGF:gydF4y2Ba

环核苷酸门控通道gydF4y2Ba

CPK：gydF4y2Ba

calcium-Dependent蛋白激酶gydF4y2Ba

衣冠楚楚的:gydF4y2Ba

微分积累蛋白质gydF4y2Ba

例如:gydF4y2Ba

内切葡聚糖酶gydF4y2Ba

exp：gydF4y2Ba

棒曲霉素gydF4y2Ba

F A：gydF4y2Ba

甲酸gydF4y2Ba

FAA：gydF4y2Ba

福尔马林醋酸gydF4y2Ba

glpK:gydF4y2Ba

甘油激酶gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

高效液相色谱法:gydF4y2Ba

高效液相色谱法gydF4y2Ba

HSP:gydF4y2Ba

热休克蛋白gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书gydF4y2Ba

质/女士:gydF4y2Ba

液相色谱-分光计gydF4y2Ba

NCL:gydF4y2Ba

nucleolingydF4y2Ba

体育:gydF4y2Ba

果胶酯酶gydF4y2Ba

PR：gydF4y2Ba

pathogenesis-relatedgydF4y2Ba

人口、难民和移民事务局:gydF4y2Ba

平行反应监测gydF4y2Ba

PTI：gydF4y2Ba

植物与互动gydF4y2Ba

sugt：gydF4y2Ba

SKP1的G2等位基因抑制子gydF4y2Ba

TEAB:gydF4y2Ba

三乙基碳酸氢铵gydF4y2Ba

TUB：gydF4y2Ba

管蛋白gydF4y2Ba

XET：gydF4y2Ba

xyloglucan-endotransglycosylasegydF4y2Ba

α加:gydF4y2Ba

α牛乳糖gydF4y2Ba

β加:gydF4y2Ba

β牛乳糖gydF4y2Ba

感谢郑晓琳博士(浙江工商大学)、邓志平博士(浙江农业科学院)、田江博士(华南农业大学)对我们的技术支持。两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

广东省科技计划项目(no . 2015A020208018; no . 2017A040403069);广东省自然科学基金项目(2016A030307016和2018A0303130161);湛江市科技项目(2016A03016)和广东省大学生登山项目(pdjh2019b0299)资助还有关于资助机构在设计研究、收集、分析和解释数据以及撰写手稿方面的作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 江边、欧思彦、徐玲、麦万一等人对这项工作贡献巨大。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 岭南师范大学生命科学与技术学院，广东湛江524048gydF4y2Ba

   江边，徐玲，麦万一，叶美君，顾海平，张涛，袁长春，刘开东gydF4y2Ba

2. 华南农业大学资源与环境学院根系生物研究中心，广州510642gydF4y2Ba

   欧思燕，王金祥gydF4y2Ba

3. 杭州师范大学生活与环境科学学院，杭州310036gydF4y2Ba

   Chenjia沈gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

所有作者都已阅读并批准了最终版本。JW, LX和KL构思并设计了本研究。BJ, LX, TZ, CY, JW负责采集和保管植物样品。BJ、LX、SO、WM、MY和HG进行实验。CY分析了数据。CS和KL写了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba金乡王gydF4y2Ba或gydF4y2Ba凯东柳gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

该项目使用植物材料，不利用转基因技术。木瓜树苗由中国湛江益新园艺公司购买，并获得许可用于我们的科研。植物材料的集合符合“濒危野生动物群和植物群”贸易公约：gydF4y2Bahttps://www.cites.org/gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba