破坏氨基酸转运蛋白GydF4y2Balht1.GydF4y2Ba导致水稻生长抑制和产量低GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

植物氨基酸转运蛋白的研究主要进行GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，虽然我们对它们的理解一般是稻米的痕迹。OSLHT1（赖氨酸/组氨酸转运蛋白）之前已被报告为酵母中的组氨酸转运蛋白，但其基材轮廓和功能GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba尚不清楚。本研究的目的是分析OSLHT1的底物选择性，并对水稻生长和繁殖力的破坏影响。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

分析了OsLHT1的衬底选择性GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞的双电极电压钳位技术。结果表明，OsLHT1能转运广泛的氨基酸，包括碱性、中性和酸性氨基酸，并表现出对中性和酸性氨基酸的偏好。两个GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba使用CRISPR / CAS9基因组编辑技术产生突变体，并且OSLHT1的损失抑制稻粒生长，从而显着降低谷物产量。QRT-PCR分析表明GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在各种稻米器官中表达，包括根，茎，旗叶，旗叶鞘和年轻穗。水稻原生质体中的瞬时表达表明OSLHT1局部化为血浆膜，其与其作为氨基酸转运蛋白的功能一致。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的结果表明，OSLHT1是具有宽底物特异性的氨基酸转运蛋白，并且优选中性和酸性氨基酸，并且OSLHT1的破坏明显抑制水稻生长和繁殖力。GydF4y2Ba

氮（N）是主要的矿物质营养素对植物生长发育必不可少的一个。植物吸收Ñ主要在从土壤中无机形式（硝酸盐和铵），而作为氨基酸的有机氮等也可以被吸收[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．无机氮进入植物后，在根或叶中转化为氨基酸。还原的N主要以氨基酸的形式运输到发育中的营养或生殖库器官，在那里它被用于生长和发育。有机氮和无机氮的摄取和转运是由多种转运载体介导的。目前，植物中硝酸盐和铵态氮转运体已被广泛研究[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]，而氨基酸转运仍知之甚少，尤其是在作物植物。GydF4y2Ba

使用孤立膜囊泡和植物组织的生理学研究表明植物中具有宽底族特异性的多个氨基酸转运蛋白[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．分子方法允许克隆负责氨基酸转运的基因。通过在氨基酸摄取中缺陷的酵母突变体的功能互补来鉴定第一植物氨基酸转运蛋白AAP1和NAT2GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BacDNA文库，两者都表现出宽的底物特异性[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．此后，从几种植物中报道了大量的氨基酸转运体[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．近年来，对不同植物全基因组的测序使我们有机会了解植物基因组中氨基酸转运体的丰度。至少有67,85和189个基因已被确定编码假定的氨基酸转运体GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，分别为大米和大豆[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．基于序列分析，迄今鉴定的氨基酸转运可分为两个家族：氨基酸/多胺/胆碱（APC）家族和氨基酸转运（ATF）家族。所述ATF家族也称为AAAP（氨基酸/生长素通透酶）家族，并且包括至少五个亚族：的AAP（氨基酸通透酶），LHTs（赖氨酸/组氨酸转运蛋白），ProTs（脯氨酸转运蛋白），蚂蚁（芳族化合物和中性氨基酸转运）和AUXs（生长素转运）GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．这些转运蛋白通常不同于底物特异性/亲和力和组织定位[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

ATLHT1，LHT家族中鉴定的第一构件最初被视为赖氨酸（Lys）和组氨酸（他的）选择性转运蛋白[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．然而，随后与其他LHT成员的研究表明，LHT可以运输广泛但不同的氨基酸[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．GydF4y2BaLHT.GydF4y2Ba基因在各种植物器官中表达，包括根、叶和花。它们不仅可以调节从土壤中吸收氨基酸，还可以调节植物中氨基酸的转运和分配[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．但是，应该指出的是，LHT转运仪的研究主要进行GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，虽然我们对大米LHT的理解一般是狭窄的。基因组调查确定了大米的6个LHT成员[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．刘等。[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba隔离了一个LHT家庭成员GydF4y2BaOsHT1GydF4y2Ba从水稻中筛选cDNA文库，可恢复His摄取缺陷酵母突变体的生长。由于最高的同一性GydF4y2BaAtLHT1GydF4y2Ba在10个LHT家庭成员中GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsHT1GydF4y2Ba被称为GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba以下。GydF4y2Ba

虽然OSLHT1介导的他的运输在酵母中测定[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba[目前尚不清楚是否可以运输其他氨基酸。在本研究中，分析了OSLHT1的底物特异性GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞，并且我们发现OSLHT1能够以偏好的中性和酸性氨基酸偏好地传送广谱的氨基酸。此外，探索的角色GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在水稻生长发育方面，二GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba使用CRISPR-CAS9基因编辑技术构建突变体。它发现破坏GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba显着抑制水稻生长和繁殖力。此外，分析了OSLHT1的表达模式和亚细胞定位。本研究将进一步了解OsLHT1的底物特异性及其在水稻生长促进和产量形成中的作用。GydF4y2Ba

奥斯林的宽底物特异性GydF4y2Ba

分析OSLHT1的基材选择性，GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba注入cRNAGydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞和双电极电压钳（TEVC）用于记录不同氨基酸诱导的电流[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．符合其作为他的运输工具的功能[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]，OsLHT1可以在卵母细胞输送他（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。除了他，还可以通过OSLHT1有效地运输诸如Glu，Asp，Asn，Gly，Pro和Ser等其他其他氨基酸，而Lys，Gln和Ala仅略微运输（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa, b)。相反，注射水的对照卵母细胞对外源氨基酸没有电流反应(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。与atlht1不同[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba[中性氨基酸Asn是测试所有氨基酸中的OSLHT1的最佳底物（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa, b). Asn通过OsLHT1转运的动力学在GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞，可饱和aGydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2Ba值583±51μm（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。这些数据表明，OSLHT1是具有宽底物特异性的氨基酸转运蛋白，并且具有中性和酸性氨基酸的优先选择性。GydF4y2Ba

敲门声GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba导致生长抑制GydF4y2Ba

调查效果GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba对水稻生长受阻，被采用的CRISPR-Cas9方法来生成GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba突变体。一个CASP-CAS9向量表达指导RNA，其瞄准编码区GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba构造(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa）和转化到稻（GydF4y2Ba粳稻GydF4y2Ba简历Nipponbare)。两个突变体GydF4y2Baoslht1-1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baoslht1-2GydF4y2Ba，然后提取两个突变体的基因组DNA进行PCR扩增。PCR产物的测序分析显示，这两个突变体是纯合子的，分别在目标位点有1-bp腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)插入(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。因此，突变GydF4y2Baoslht1-1.GydF4y2Ba导致Pro10在OsLHT1转化成Leu和随后的移码;突变GydF4y2Baoslht1-2GydF4y2Ba导致了OsLHT1中的Phe32转化为Ser并随后发生帧移。我们还检测了潜在的脱靶分裂，通过搜索水稻基因组序列与高度相似GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba使用联机工具的目标序列(GydF4y2Bahttp://skl.scau.edu.cn/offtarget/GydF4y2Ba)．对于每种靶标，检查了四个最可能的偏离靶位点，没有检测到脱靶切割。另外，转录水平GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba被检测到，这两者明显减少GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba行与WT比较(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S1）。GydF4y2Ba

播种种子时，萌发率GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba播种（DAS）后2天突变体低于野生型（WT），而3-5 DAS的野生型和突变体之间的结果几乎相同（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2)。在5das时，突变体的茎部生长与野生型相同，但突变体的根比野生型短得多(图5)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac, d).这些结果表明，OsLHT1功能的丧失略微延迟了种子的萌发，但显著影响了根系的发育。为了评估OsLHT1干扰对整个生育期生长的影响，将野生型和突变体在土壤中生长。与野生型相比，两者都是突变体GydF4y2Baoslht1-1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baoslht1-2GydF4y2Ba表现出对不同范围的生长抑制（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bae，f）。然后是野生型的农艺性状GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba对植株进行株高、茎长和分蘖数分析。结果表明，与野生型相比，野生型的株高、茎长和分蘖数显著降低GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba植物（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bah，i，j）。另外，在生殖生长阶段，也观察到过早的衰老GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba植物（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaG）。这些结果表明，缺乏OSLHT1功能影响植物正常生长和发育。GydF4y2Ba

敲门声GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba导致谷物产量低GydF4y2Ba

评价…的影响GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba对粮食产量的影响，我们比较了粮食产量GydF4y2Baoslht1-1.GydF4y2Ba那GydF4y2Baoslht1-2GydF4y2Ba和野生型。我们发现玉米的单株粮食产量GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba取决于突变系（图42.5％67.8明显降低和。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba然后对单株穗数、每穗粒数、结实率和千粒重等产量构成因素进行了详细的检验。单株穗数无显著差异GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba和野生型植物(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC）。每穗的谷物数GydF4y2Baoslht1-1.GydF4y2Ba和GydF4y2Baoslht1-2GydF4y2Ba与野生型植物相比分别显着降低25％和14％（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad）。种子设定率大幅减少42.2％GydF4y2Baoslht1-1.GydF4y2Ba和34.7%GydF4y2Baoslht1-2GydF4y2Ba与WT相比(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae），而1000粒重的重量在5.8％和8.7％之间取决于突变体（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaF）。另外，在晶粒尺寸和形状中没有观察到显着变化GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba植物(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S3)。综上所述，这些结果表明GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba对每穗粒数和结实率影响较大，从而导致GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba植物。GydF4y2Ba

OSLHT1的空间表达和亚细胞定位GydF4y2Ba

检查空间表达GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba，采用实时荧光定量PCR分析GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在14周龄植物的不同器官中，包括根，茎（较低的间），旗叶鞘，旗叶和年轻穗。结果表明GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在测试的所有稻器官中表达，在较低的间隙中观察到的最低表达（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba进一步，一个更详细的表达GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在不同的发育阶段，从电子荧光象形文字（EFP）浏览器获得[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]，这表明GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在开发花序和种子中表现出高表达（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S4）。GydF4y2Ba

为了检查OSLHT1的亚细胞定位，在35S启动子的控制下的OSLHT1-GFP融合蛋白在水稻原生质体中构建和瞬时表达。16-20 H培养后，观察到GFP（绿色荧光蛋白）荧光信号。单独表达GFP的原生质体通常在整个细胞溶溶胶中显示出绿色荧光（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。相反，在表达OSLHT1-GFP的细胞中，将绿色荧光限制在血浆膜上，与质膜局部化的小GTPA酶OSRAC3（MCHERRY-OSRAC3）共定位（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．结果表明，OsLHT1以质膜为靶点。GydF4y2Ba

系统发育分析GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba

OSLHT1是LHT亚家族的成员，属于氨基酸转运蛋白（ATF）家族。6和10.GydF4y2BaLHT.GydF4y2Ba基因在水稻中鉴定出来GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba基因组分别[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．利用OsLHT1序列进行同源性查询，在玉米、高粱和其他单子叶植物中分别获得了16、14和9个同源性GydF4y2BaBroachypodium distachyon.GydF4y2Ba,分别。这些蛋白质，以及大米和GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，用于系统发育分析。生成的系统发生树主要分为两个进化枝，其中OsLHT1 ~ OsLHT4属于一个进化枝，OsLHT5和OsLHT6构成另一个进化枝(图4)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。在六个oslHT中，OSLHT1对OSLHT2具有最高的同源性，具有身份76％。OSLHT1的身份与其最近的玉米同源物（NP_001141364，90％），高粱（XP_021320860，92％）和GydF4y2BaBroachypodium distachyon.GydF4y2Ba（XP_003573326，91％）与此高得多GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba（ATLHT2,78％）。此外，使用MEME MOTIF搜索工具预测六个OSLHT的保守基板和OSLHT1的最近同源物。除了OSLHT5和OSLHT6之外，其他LHT具有相同的主题（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

AtLHT1处于LHT亚科属于氨基酸转运（ATF）家族中确定的第一构件[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．摄取酵母测量表明AtLHT1输送Lys和他的13种不同氨基酸中最有效地进行测试，并且GydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2BaLys（175μm）和他的（400μm）的值远低于第三最活性底物的leu（11mm），所以它被认为是Lys和他的选择性转运蛋白[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．然而，对LHT家族其他成员的转运特性的研究表明，LHT能够运输广泛的氨基酸，包括中性、碱性和酸性氨基酸，并对高亲和力的中性和酸性氨基酸表现出优先选择性[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．例如，酵母中的摄取分析显示，ATLHT2将天冬氨酸和脯氨酸的高亲和力（GydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2Ba= 72, 13 μM)，竞争实验表明，除碱性氨基酸外，其他中性和酸性氨基酸是脯氨酸和天冬氨酸的有效竞争对手[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．此外，Perchlik等。[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]研究AtLHT6功能GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba发现了那个被击倒的GydF4y2BaAtLHT6GydF4y2Ba显著减少的酸性和一些中性氨基酸，但不是基本的氨基酸的摄取。有存在于水稻6个LHT成员[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]但是现在尚未确定它们的衬底特异性。oslht1已被报告为他的运输商以前[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba，其底物特异性在GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba本研究中的卵母细胞。我们发现OSLHT1可以介导具有不同特征的各种氨基酸的运输（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa，b）。与酵母表达的atlht1不同[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba时，OsLHT1相对于His的Lys转运活性非常弱(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa，b）。此外，中性氨基酸ASN，但不是碱性氨基酸，是测试氨基酸中的OSLHT1的最佳底物（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA，B），因此OSLHT1的基板分布类似于ATLHT2和ATLHT6的[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．但是，应该注意的是，OSLHT1和ATLHT2在底物特异性和亲和力方面不同。这GydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2BaOSLHT1的最佳底物ASN的值为583±51μm（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac），这是Pro和ASP的ATLHT2的值高一阶数（GydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2Ba= 13,72 μM) [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．的差异GydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2BaOsLHT1和AtLHT2之间的值可能意味着它们的不同角色GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba，这将需要在未来的研究中进行进一步的分析。总的来说，鉴于到目前为止所鉴定的LHT的底物特异性，可以得出结论，LHT不是LYS和他的选择性转运蛋白，而是具有宽底物特异性的碱性和选择性转运蛋白，并且优选中性和酸性氨基酸。GydF4y2Ba

确定OSLHT1的底物轮廓GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2BapH为5.4条件下的卵母细胞。pH值为5.4时，碱性氨基酸(如His)带正电荷，酸性氨基酸(如Asp和Glu)主要带负电荷。然而，所有这些带相反电荷的氨基酸都可以通过OsLHT1转运(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa，b）。另一方面，作为他的Lys和Arg携带的电荷，因为他没有有效地通过OSLHT 1运输（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa，b）。因此，假设净电荷不是OSLHT1的基材识别的主要决定因素。除了电荷之外，个体氨基酸相对于几何形状而不同，这可能在oslht1上发挥基材识别中的至关重要作用。GydF4y2Ba

在水稻原生质体中，OsLHT1定位于质膜(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab），其与其作为氨基酸转运蛋白的功能一致，并且还通过Liu等人同意之前的工作。[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba和Whiteman等[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．在刘的学习中，GydF4y2BaOSLHT1-GFP.GydF4y2Ba融合构建物在洋葱表皮细胞中瞬时表达，几乎只在质膜上检测到绿色荧光[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．Whiteman等人。[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]孤立的水稻浆膜和仪表蛋白蛋白，发现OSLHT1特异性肽以质膜膜中存在，但不含调质子膜。GydF4y2Ba

oslht1在根中表示（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa，附加文件:图S4)，并能在酵母和酵母中运输氨基酸GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞(图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba) (GydF4y2Ba22GydF4y2Ba，这意味着它可能能够介导从土壤中获取氨基酸。但考虑到以下事实:(1)松散土壤溶液中游离氨基酸含量变化很大，很少超过50 μM [GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba];（2）GydF4y2BaK.GydF4y2Ba_mGydF4y2Ba最活性底物Asn的OsLHT1的值为583±51 μM(图3)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC)，远高于大多数土壤溶液中游离氨基酸的浓度;(3)土壤中存在大量微生物，与植物根系相比，微生物是获取游离氨基酸的优势竞争者，特别是在土壤氨基酸浓度较低的情况下[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]，我们推理oslht1的主要功能GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba可能不会从未来的研究中获得来自土壤的氨基酸。另一方面，将吸收的无机N转化为根部或成熟叶片（源）的氨基酸，其是植物中N的主要传输形式，并且被运输到各种代谢活性器官（水槽），如根尖，年轻的叶子，花和种子。氨基酸的源极分易位涉及几种方法，例如韧皮隆，进口到水槽和木质素到韧皮肌转移，这需要多个氨基酸转运蛋白的调解[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．据报道，氨基酸渗透(AAPs)参与了氨基酸从源到汇的运输[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．例如，GydF4y2BaAtAAP8GydF4y2Ba在源叶韧皮部中表达，和失功能AtAAP8的降低氨基酸韧皮部装载的广谱和分区到水槽，这又导致降低到长角果和种子数GydF4y2Baataap8GydF4y2Ba植物(GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．OsLHT1在叶片、叶片等茎器官中表达，并定位于质膜(图2)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa，b），暗示其在氨基酸易位中的功能GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba．此外，缺乏OSLHT1功能显着抑制植物发育和降低的种子产量（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bae，GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa），因此我们认为OSLHT1主要在植物内的氨基酸运输中，但它介导的过程将来需要进一步调查。GydF4y2Ba

氨基酸转运蛋白介导从土壤中摄取根氨基酸，并在植物中的易位。植物氨基酸输送器的研究强烈关注GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，虽然我们对它们的理解一般是稻米的痕迹。发现OSLHT1用作酵母中的组氨酸转运蛋白，但其基材曲线和功能GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba尚不清楚。在本研究中，我们分析了OSLHT1的基材选择性GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞，发现OSLHT1可以优选中性和酸性氨基酸来运输广谱的氨基酸。空间表达和亚细胞分析表明GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba在水稻各器官中表达，并以质膜为靶点。OsLHT1功能的丧失抑制了水稻根和茎的生长，显著降低了籽粒产量。本研究将进一步了解OsLHT1的底物特异性及其在水稻生长促进和产量形成中的作用。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

野生型水稻(简历。Nipponbare)和两个GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba本研究使用突变体。野生型水稻订购自广西大学水稻资源保护中心。这GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Ba本实验室采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建突变体(见下文)，其栽培符合我国转基因植物立法要求。GydF4y2Ba

一代的GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba淘汰赛线GydF4y2Ba

基于网络的工具CRISPR-P 2.0软件(GydF4y2Bahttp://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/GydF4y2Ba）用于设计目标网站GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba．目的序列分别为5 ' -TAACTACCCACCGGCCAAGG-3 '和5 ' -TTCCCATCACGTCGTCCAGG-3 '。pCRISPR -GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba质粒按照Ma等人的描述构建[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．简而言之，通过重叠PCR构建含有靶序列的两个SGRNA表达盒，并用甲基克拉/ Cas9pubi克隆到幽灵中GydF4y2BaBsaGydF4y2BaI限制性内切酶，产生了pCRISPR-GydF4y2BaOsLHT1。GydF4y2Ba由此产生的结构被引入到Nipponbare中GydF4y2Ba农杆菌肿瘤术GydF4y2Ba介导的转化。通过PCCR使用PRIMER对侧翼两个筛选T0和T1纯合突变体GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba您的目标网站。两个独立的淘汰赛线GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba选择进一步表型分析。GydF4y2Ba

形态特征GydF4y2Ba

野生型和GydF4y2Baoslht1.GydF4y2Baplants were exposed to 0.5 mM CaCl_2GydF4y2Ba在28℃下溶液5d（12-H光和12-H-暗条件），在不同天用尺子测量根长。在2018年广西大学的实验稻田进行稻米试验，野生型和突变体的发芽种子在该领域培养。三叶期后，植物于3月将植物移植到实验领域并在7月底收获。农艺性状包括植物高度，茎长，分蘖数，每株植物的籽粒产量，每株植物的穗数和每穗粒数被记录。称重糙米，计算每株1000粒重量和籽粒产量。GydF4y2Ba

RNA分离及基因表达分析GydF4y2Ba

调查表达式模式GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba总RNA，从使用Trizol试剂（Invitrogen公司）的14周龄WT水稻各器官提取。使用总RNA的1微克和第一链cDNA进行逆转录反转录使用根据制造商的说明书上标逆转录酶（Invitrogen）中。引物5'-TCTTCGGTGGATTCGCCTTC-3'和5'-ATGATGCAGATCCAGTTGGTG-3'GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba， 5 ' -GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCT-3 '和5 ' -AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3GydF4y2Ba组蛋白GydF4y2Ba进行qRT-PCR，定量分析的条件为:94℃2 min, 94℃15 s, 60℃20s, 72℃30s 35个循环，最后72℃延伸10 min。每个样本的基因转录水平被归一化到管家基因水平GydF4y2Ba组蛋白GydF4y2Ba．每个实验都是用三种生物学重复进行的。GydF4y2Ba

OsLHT1的亚细胞定位GydF4y2Ba

探讨OSLHT1的亚细胞位置，全长编码序列GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba（LOM_OS08G03350）用引物对扩增：5'-CCCAAGCTTCGATGGGAGGGGTGGCAGATTCGATGGGGGAGGAACTTGTATGTCT-3'，并被克隆到Pyl322-GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba向量和GydF4y2Ba后GydF4y2Ba三世和GydF4y2BaBamHGydF4y2Ba我限制地点生产GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba-GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba构造。质粒GydF4y2BaGFP-OsLHT1GydF4y2Ba或GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba单独(对照)，与mCherry-OsRac3作为质膜标记物[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba[如前所述，通过PEG介导的转化转化为水稻原生质体，如前所述[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．在转化12至16小时后，通过共聚焦激光扫描显微镜（TCS SP8; Leica）观察荧光信号图像。GydF4y2Ba

保守基序和系统发育分析GydF4y2Ba

使用OSLHT1序列作为查询，其在玉米，高粱和型材中的同源物GydF4y2BaBroachypodium distachyon.GydF4y2Ba通过BLAST计划从NCBI数据库获得。使用Clustalw Version1.83使用默认设置生成oSLHT1及其同源物的多个序列对齐，并且使用Mega 6.0的邻接（NJ）方法构造了邻居连接（NJ）树，具有1000个引导复制。为了更好地了解LHT家族蛋白的保守结构特征，使用在线工具MEME（MOTIF引发的多重预期最大化）来鉴定编码的LHT家族中的保守基序，并且每个基序宽度在3到50个残基之间受到约束。GydF4y2Ba

电生理学GydF4y2Ba

全长编码序列GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2Ba（LOM_OS08G03350）通过使用基因特异性引物5'-CGCTCAACTTGGCAGAGATCT通过Nipponbare cDNA的高保真PCR扩增GydF4y2Ba阿格GydF4y2BaGggactcaggtggcagataac-3'（启动密码子下划线）和5'-agatcctagtcagtcactagtGydF4y2BaCTAGydF4y2Bacgagtagaacttgtatgtc-3'（终止密码子下划线）。得到的PCR产物和GydF4y2BaBGLGydF4y2Ba2 /GydF4y2BaSpeGydF4y2Ba在制造商的说明之后，我用无缝组件克隆试剂盒（Vazyme）重组了线性化载体PT7。然后将连接的产品引入GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH5α并通过测序验证。重组质粒DNA用含量线性化GydF4y2BaXBA.GydF4y2BaI和cRNA的体外使用mMessage mMachine T7试剂盒（Ambion）中的转录。GydF4y2Ba非洲爪蟾蜍GydF4y2Ba卵母细胞的制备如前所述[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．用23.0 ng注射卵母细胞GydF4y2BaOsLHT1GydF4y2BaCRNA or an equivalent volume of nuclease-free water, using Nanoliter 2000 microinjector, and then incubated for 2–4 days at 19 °C in ND96 solution containing 96 mmGydF4y2Ba氯化钠,2米GydF4y2BamGydF4y2Ba氯化钾,1.8GydF4y2BamGydF4y2BaCaClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba, 1米GydF4y2BamGydF4y2BaMgcl.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，5 mm Hepes（pH7.4）和50 mg / l庆大霉素。使用TEVC技术（Axoclamp 900A，分子装置）和数据采集记录全电池电流，使用软件Clampex，Clampfit 10.3（Molecular Devices）和Sigmaplot 12.0（Systat软件）进行数据分析。对于如图1中的电流录制。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA和B，卵母细胞在-70mV处被电压夹紧。对于如图1中的电流录制。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC，保持潜力为-40mV，并且在20mV的20mV中，在-140至+ 20mV的膜电位下测量ASN诱导的电流。包含的基底超级溶液：90毫米NaCl，2mm CaClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，2 mm mgclGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba那和4. mM MES, and amino acids were added at desired concentrations. The pH of all solutions was adjusted to 5.4 using Tris/MES.

统计分析GydF4y2Ba

所有治疗都至少重复两次，并用星号表示统计分析差异。显著级别定义GydF4y2Ba^*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05,GydF4y2Ba^**GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.01, ***P.GydF4y2Ba < 0.001.

本研究期间生成或分析的所有数据和材料都包含在本文中，或者可以从合理的请求中获取相应的作者。GydF4y2Ba

爆炸:GydF4y2Ba

基本的局部比对搜索工具GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

LHT：GydF4y2Ba

赖氨酸和组氨酸转运体GydF4y2Ba

PCR：GydF4y2Ba

聚合酶链反应GydF4y2Ba

Tevc：GydF4y2Ba

二电极电压钳位GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(31760065);广西自然科学基金项目(2016GXNSFFA380013);广西研究生教育创新项目(YCSW2018044);广西百人计划(2014)、广西高校高层次创新团队和优秀学者项目(2016)。资助方没有在研究的设计、收集、分析和解释相关数据以及撰写手稿中发挥任何作用。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 萧湖王和广州杨同等贡献了这项工作。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 广西大学生命科学与技术学院亚热带农业学研究的国家重点实验室，南宁530005GydF4y2Ba

   王小虎，杨光哲，施明星，魏秋星，王志刚，傅山，夏吉兴GydF4y2Ba

2. 土壤的国家重点实验室和农业可持续发展的土壤科学研究所，中国院士，71号，北京东路，南京，210008，中国GydF4y2Ba

   郝东丽，苏艳华GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JX构思和设计实验。XW执行大部分的实验。GY，MS，HD，QW，ZW，SF和YS参加了调研。GY起草的手稿。GY和JX校订手稿。所有作者讨论的结果和评论稿件。所有作者阅读并同意最终的文本。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba嘉兴夏GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba