鉴定TaPPH-7A普通小麦重要农艺性状的单倍型及其分子标记的建立

背景

旗叶早衰严重影响小麦产量和品质。叶绿素（Chl）降解是叶片衰老过程中最明显的症状，受到一系列酶的催化。脱镁叶绿酸脱镁叶绿酸水解酶基因编码叶绿素降解水解酶。

结果

本研究对小麦的编码、基因组和启动子序列进行了研究Tapph-A.克隆基因。相应的长度分别为1467 bp，4479 bp和3666 bp。序列结构分析显示Tapph-A.含有五个外显子和四个内含子。在多个序列对齐之后Tapph-A.从36种牧草中的基因组，观察到四个SNP和一个2-BP Indel，形成了两种单倍型，Tapph-7a-1和tapph-7a-2．基于1299bp（a / g）的SNP，分子标记物TaPPH-7A-dCAPS用于区分等位变异(A/G)。利用13个SSR标记和116个SNP标记，构建了7A染色体的连锁图谱。Tapph-A.被映射在染色体区域Xwmc9(0.94厘米)ax - 95634545(1.04 cM）在DH群体中。关联分析TaPPH-7A等位基因变异和农艺性状发现TaPPH-7A以323份材料组成的1号群体为研究对象，分析了12个环境中11个环境的TGW和干旱胁迫下灌浆期Chl含量。到达拥有Tapph-7a-1（A） 白芍总苷和叶绿素含量均高于对照组tapph-7a-2（g），因此Tapph-7a-1(A)为有利的等位变异。通过对有利等位基因变异频率的分析Tapph-7a-1（a）在人口2中，157个地位和348名现代品种，我们发现它从1950年（0）到20世纪60年代（54.5％）增加到20世纪60年代，从20世纪60年代到20世纪90年代保持相对稳定的水平约为56％。

结论

这些结果表明等位变异是有利的Tapph-7a-1(A)通过同时改善源(叶绿素含量)和库(发育中的籽粒)，对提高籽粒产量具有重要价值。此外，新开发的分子标记TaPPH-7A可将-dCAPS集成到高TGW小麦筛选的育种试剂盒中，用于标记辅助选择。

小麦(小麦L.）为世界上30％的人口提供主食来源[1］．据估计，由于世界人口增加，全球对小麦的需求将在2020年之前进一步增加40％，因为世界人口增加了[2］．因此，高产品种的育种仍然是小麦育种计划的主要目标[3.］．千粒重是一项重要的产量贡献性状。小麦籽粒产量显著的遗传改良部分归因于TGW的增加[4］．

延迟衰老或留绿色，使叶片能够在开花后保持更长的绿色，并有助于更长的籽粒灌装时期[5，6]. Gregersen等人[7据报道，延迟作物衰老与籽粒产量之间的正相关性。衰老的两天延迟增加了11％的碳固定淡黑麦草l [8]. 此外，小麦的产量保持绿色突变体TASG1.比野生类型高9.5％[9］．因此，它被认为是生产包括小麦的许多作物的理想特征。叶绿素（CHL）降解是叶片衰老的主要指示剂，并由一系列酶催化[10，11，12，13，14.］．苯酚肽水解酶（苯酚丁酶，PPH）是CHL降解中的关键酶，特异性水解苯酚肽A至苯酚肽A [15.，16.］．诱变或过度表达PPH.可以导致拟南芥和水稻保持绿色或早衰表型[15.，16.］．此外,overexpressingLPPP.也加速了Chl的降解，且表达量与叶片衰老正相关[17.］．因此，表达了PPH.基因影响CHL降解，进一步影响庄稼的产量和质量。

标记辅助选择被认为是加速小麦育种过程的潜在方法[18.，19.］．单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)主要是指由单核苷酸变化和小插入/缺失引起的DNA序列多态性[20.，21.]. 与RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR等标记类型相比，SNP具有丰度高、相对稳定性好、成本效益高、高通量等优点，是一种很有价值的标记[22.，23.］．此外，SNP还被证明是一种高密度遗传造型地图结构中的一种非常有效的分子标记，精细的映射，遗传多样性，关联分析，功能性标记开发和标记辅助选择育种[24.，25.］．随着SNPs高密度遗传图谱的发展，关联分析已被证明是鉴定目的基因多态性位点与重要数量性状之间关系的有效工具，并已广泛应用于拟南芥等植物[26.，27.)、大米(28.，29.]，玉米[30.，31.，32.和小麦[33.，34.］．

的PPH.在Chl降解过程中起着重要作用。但是基因的序列、结构和多态性TaPPH在小麦方面仍不清楚。本研究的目的是(i)分离编码序列、基因组序列和启动子序列Tapph-A.，（ii）鉴定多态性位点并从中开发分子标记Tapph-A.（iii）鉴定有利的等位基因变异，（iv）通过分析有利的等位基因变异的地理分布和频率来评估新分子标记的价值。旨在为利用分子标记辅助选择选育高产小麦品种提供一个新的、有效的分子标记。整个研究工作的方案如下（图。1)．

克隆和表征Tapph-A.基因

的可能参考序列TaPPH基因的核苷酸序列OsNYC3型（OS06G0354700）被用作URGI中患有中国春季基因组序列数据库的查询（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php.php.)．选择具有高相似性（> 80％）的三种中国春小麦脚手架序列（IWGSC_V3_CHR7AL_SCAFFOLD_1626，IWGSC_V3_CHR7BL_SCAFFOLD_507，IWGSC_V3_CHR7DL_SCAFFOLD_2847）并识别为潜在的候选序列。下载了三个支架序列，并用于通过SEQMAN的核苷酸对齐。设计了一种基因组特异性引物对G-F / R和启动子特异性引物对P-F / R，并用于克隆基因组和启动子序列Tapph-A.在CHAN 4738中。扩增片段的相应长度分别为4125bp和4138bp。序列分析表明基因组和启动子序列Tapph-A.分别为4479英镑和3666英镑。分析基因结构Tapph-A.用一对长度为1467的引物C-F/R克隆编码序列 英国石油公司。与编码序列比较，其基因组序列为Tapph-A.由五个外显子和四个内含子组成（图。2一种）。

序列多态性和分子标记发育Tapph-A.

的基因组和启动子序列的多态性检测Tapph-A.，小麦多样性面板中的所有含义都用于放大Tapph-A.基因，并测序扩增的片段。发现多个序列对准发现，在基因组序列中观察到四个SNP（G / A，A / G，C / T，A / C）和2-BP indel，而在启动子序列中没有检测到序列变异Tapph-A.（图。2从起始密码子(ATG)开始，分别在1038 bp、1299 bp、1468 bp和3790 bp处有4个snp位点，其中2-bp InDel在1902 ~ 1903 bp处得到。4个SNPs和2-bp InDel共同形成2个单倍型，Tapph-7a-1和tapph-7a-2（图。2b）。

基于1299bp（a / g）的SNP，开发了分子标记并命名TaPPH-7A-DCAPS。它含有在下游底漆中不匹配的基础g生态RI-R和限制性内切酶生态国际扶轮网站(无花果。2c） 是的。描述观察到的Tapph-A.大小麦种群的等位基因变异，进行以下三个实验：首先，使用基因组特异性引物对，G-F / R扩增基因组序列Tapph-A.，获得4125 bp片段。其次，以4125 bp的0.2 μL PCR产物为模板，利用分子标记引物对扩增出202 bp的片段;生态RI-F / R。第三，202bp的PCR产物具有等位基因变异Tapph-7a-1（a）形成了一个生态RI位点GAATTC(图。2C)，用限制性内切酶切至174 bp和28 bp生态RI（图。2d） 是的。而相应的PCR产物具有等位基因变异tapph-7a-2(G)为GGATTC(图。2c），相应的产品仍保持202bp（图。2d）。

遗传的映射TaPPH

不同倍增性的十五个小麦种类和一组中国春季无躯体细胞分配染色体位置Tapph-A.．目的片段仅在具有7A染色体的材料中检测到，包括3份AA基因组材料、3份AABB基因组材料、3份AABBDD基因组材料，以及除中国春花N7AT7B和N7AT7D外的所有零四体系材料(图1)。3.一种）。这表明了TaPPH位于7A染色体上。为了进一步定位，将分子标记、13个SSR和116个SNP标记整合到7A染色体的连锁图谱中。利用汉选10号杂交获得的DH群体 × 鲁麦14号，TaPPH被映射在染色体区域Xwmc9(0.94厘米)ax - 95634545(1.04 cM)在7A(图。3.因此，它被命名为TaPPH-7A．

协会TaPPH-7A与yield-related特征

来检测TaPPH-7A产率相关性状的等位基因变异，使用323个小麦涂抹量组成。在人口1，Tapph-7a-1（a）是一个主要的等位基因变异，占总登记号的69.3％（附加档案1:图S1)。TaPPH-7A在所有12个环境中与GN没有显着关联，七种环境中与SN没有显着关联（E1，E2，E3，E5，E6，E7和E10）（表1)．但是，之间的重大关联TaPPH-7A在12个环境中有11个观察到TGW，除了E10 (Table1)．具有等位变异的基因型Tapph-7a-1（a）TGW显着高于具有等位基因变异的TGWtapph-7a-2（G） （图。4a)。因此,Tapph-7a-1(A)可能是改善TGW的有利等位变异。

协会TaPPH-7A与合作内容

在人口1中，我们也发现TaPPH-7A在干旱胁迫下，在谷物灌装阶段与CHL含量有重大关联（表2)．具有等位变异的基因型Tapph-7a-1（a）的CHL含量明显高于具有等位基因变异的CHL含量tapph-7a-2（G） （图。4b） 是的。所以呢Tapph-7a-1（a）可能是在干旱胁迫下籽粒灌浆阶段延迟CHL降解的优异等位基因。

定量实时PCR分析TaPPH-7A表达

检测对TGW和CHL含量有利变化的影响，每个都有六种载体Tapph-7a-1（a）和tapph-7a-2（g）从人口1中随机选择，并用于测试表达水平TaPPH-7A(附加文件3.：表S1）。基因QRT-PCR的熔化曲线TaPPH-7A和taactin.均单峰，表明放大的引物特异性（附加文件2:图S2)。qRT-PCR显示Tapph-7a-1(A)相对表达量低于tapph-7a-2（G） （图。5). 这一发现提示低相对表达水平的Tapph-7a-1可能有助于维持更高的CHL内容，从而合成更多光合素，此外改善TGW。

地理分布TaPPH-7A中国小麦生产区的等位基因变异

在中国，根据小麦类型，生长季节，对光周期，温度，水分，生物和非生物胁迫的品种反应进行分割十个小麦区[35.］．本研究收集了10个小麦产地的157个地方品种的2群体和348个现代品种的3群体的全部材料4：表S2）。地理分布TaPPH-7A使用人口2和人口评估等位基因变异3.在人口2中，只有12种附加（7.6％）具有良好的等位基因变异Tapph-7a-1（a），频率远低于tapph-7a-2（g）（附加文件1:图S1)。频率最高的Tapph-7a-1（a）在X区为30.0％，其次v和vi中的16.7％。在人口3中，有利的等位基因变异Tapph-7a-1（A） 在183份材料（52.6%）中鉴定（附加文件）1:图S1)， 10个小麦产区的频率均高于群体2。在I区、II区、III区和VI区，约占我国小麦种植面积的75%Tapph-7a-1（a）高于tapph-7a-2（g），但在其他小麦生长区域，如区域v，viii和x，频率Tapph-7a-1（a）显然低于tapph-7a-2（g）（附加文件4：表S2，图6a和b)。因此，有利的等位变异Tapph-7a-1（a）在主要小麦生产区中强烈选择，并在其他小麦生产区弱。

频率TaPPH-7A小麦育种史中的等位基因变异

评估有利等位基因变异的频率Tapph-7a-1（A） 利用群体3中334份已知放归期的材料，将其分为6组（1950、1950、1960、1970、1980和1990年代以前）。1950年以前（1950年以前）释放的8份材料均具有等位变异tapph-7a-2（G）。频率Tapph-7a-1（a）从1950年（0）至20世纪60年代（54.5％）增加，从20世纪60年代到1990年代保持相对稳定的水平约为56％（图。7). 从1950年前到1990年代，三峡水位呈现出持续上升的趋势（图。7)．这些强烈表示有利的等位基因变异Tapph-7a-1(A)应该是有价值的，可以选择改进TGW。

序列多态性TaPPH-7A

在进化中，驯化和繁殖小麦，遗传信息在自然条件下经历了两次双击和突变，最终导致了丰富的遗传多样性。Somers等人。［36.]报道的序列多态性水平为每540个位点1个SNP 基于12个小麦品种EST数据库，采用生物信息学方法对EST序列进行bp分析。Ravel等人[37.鉴定，SNP频率在基因组序列中为1 SNP / 334bp，包括编码和非编码区域，以及小麦的编码区域中的1个SNP / 267bp。在这项研究中，多态性TaPPH-7A通过直接测序检测来自小麦多样性面板（36种附加）的基因序列。SNP发生在外显子和内含物区域TaPPH-7A（图。2)．本研究估算的基因组序列包括编码区和非编码区，平均每1120 bp有1个SNP，编码区每1467 bp有1个SNP，非编码区每1004 bp有1个SNP，但启动子区未检测到多态性。正如预期的那样，编码区比非编码区具有更低的SNP频率，这一结果与早期的研究一致[38.］．然而，整个基因组序列的SNP频率远低于以往的研究[36.，37.]. 这个结果表明TaPPH-7A是进化中相对保守的基因。

在这项研究中，仅在1468年的EXON区域中鉴定了一个同义突变SNP（C / T）TaPPH-7A．然而TaPPH-7A与TGW和Chl含量相关，以及相对表达水平TaPPH-7A在小麦基因型中Tapph-7a-1（a）比那些人tapph-7a-2（G） （图。5），因此表型和基因表达变异的原因可以是替代的剪接。以前的许多研究表明，通过替代MRNA的替代剪接，内含子的变化可以显着影响基因表达或表型变异[39.，40，41.，42.]. 因此，内含子的变异是重要的，值得进一步研究。

TaPPH-7A是与TGW和CHL内容相关的新基因座

利用QTL作图，可以根据图位、表型效应、基因作用、多效性效应以及与分离群体中其他QTL的上位性互作，解剖控制遗传变异的基因座，并对这些基因座进行表征[43.］．在各种测绘群体中的小麦染色体7a上检测到用于CHL含量和TGW的几个QTL。使用源于汉轩10×Lumai 14，Shi等人的DH人口。［44.在染色体7A上的开花和籽粒灌装阶段发现两种QTL，分别为7A的染色体7A，分别为7.32和8.36％的表型变异，以及杨等人。［45.在间隔中检测到CHL内容的QTLXwmc488-P2071-180在水中染色体7A缺乏。Bhusal等人。［46.还报告了CHL的QTL一个染色体7a上的内容靠近标记物XWMC388.在热应激下。伊利亚斯等人。［47.]在7A上定位了一个总Chl含量的QTLXBarc49.和XGDM14.. 关于TGW，小麦7AL染色体上的QTL也有报道。例如，Wang等人[48.[报告了TGW接近标记的QTLXCFA2257.在天然人群中，这解释了总体型变异总量的21.99％。Gros，等人。［49.还发现了一个QTL在附近的TGWXgwm282，解释了6种环境中5.2-10.3%的表型变异。在本研究中，TaPPH位于染色体7A的标记之间Xwmc9和ax - 95634545在1.98 cM范围内进行QTL作图(图1)。3.b）。基于普通小麦共识图[50.，51.],TaPPH-7A被认为靠近Centromere，但远非标记Xwmc488和P2071-180［45.],XWMC388.［46.],XBarc49.和XGDM14.［47.],XCFA2257.［48.),而Xgwm282［49.］．因此，TaPPH-7A很可能是与CHL含量和TGW相关的新型基因座在染色体7A上。

TaPPH-7A-dCAPS是一种稳定有效的辅助选择育种分子标记

功能性分子标记是从影响表型性状变异的基因多态位点发展起来的[52.］．将SNP转化为帽或DCAPS标记使得SNP能够更方便地应用于在标记辅助育种中选择优选的等位基因[18.]. 此外，CAPS或dCAPS标记物的测定方法简单。然而，由于小麦基因组的巨大差异，从已鉴定的小麦基因中提取CAPS或dCAPS标记是困难的[53.，54.］．为了解决这一问题，我们首先设计了基因组特异性引物来区分三个同源基因组序列，然后通过比较不同小麦基因型目的基因的基因组序列来识别SNP，最后开发了基于SNP的分子标记。使用上述方法，一个分子标记TaPPH-7A-DCAPS是基于该研究的1299bp的SNP开发的（图。2C）。两个等位基因变异，Tapph-7a-1（a）和tapph-7a-2(G)，利用已开发的分子标记扫描种群1(附加文件5：表S3）。我们进一步努力发现有利的等位基因变异Tapph-7a-1（A） 在干旱胁迫下，12个环境中有11个与高TGW和灌浆期Chl含量有关（图1）。4)．我们还发现基因型具有良好的等位基因变异Tapph-7a-1（a）具有较低的相对表达水平TaPPH-7A比那些tapph-7a-2（G） （图。5). 由此推断，有利的等位变异，Tapph-7a-1（a），可以同时改善开花后的源（叶绿素含量）和水槽（显影晶粒），最终促进小麦籽粒重量。因此，新开发的分子标记，TaPPH-7A-dCAPS是一个稳定有效的小麦产量分子标记，可用于小麦分子标记辅助选择育种。

有利等位基因变异Tapph-7a-1(a)是在小麦育种史上选定的

小麦是中国最重要的主食粮食作物之一。随着经济的发展，育种目标不断变化。在20世纪60年代之前，主要育种目标是增加TGW并进一步提高收益率。从20世纪70年代到20世纪90年代，繁殖目标发生了改变，以改善植物身高，质量，穗数和每穗粒重等农艺特征[55.］．1950年至20世纪60年代的中国小麦养殖目标的变化导致了积极选择有利的等位基因变异Tapph-7a-1(A)和1970年以前TGW的快速增长(图。7)．从20世纪70年代到20世纪90年代，频率是有利的等位基因变异Tapph-7a-1（A） 相对稳定在56%左右，但TGW持续增加（图。7)可能的原因是选择了其他与TGW相关的基因，如TaSnRK2.3-1A（Hap-1A-1)以及TaSnRK2.3-1B（HAP-1B-1）[56.],TaSPL21-6D-Hapii和iii (57.),而塔萨普7-B(C) (58.］．此外，有利等位基因变异的频率Tapph-7a-1（a）从地铁（人口2）增加到中国十个麦楼区的现代品种（人口3）。但是，在人口3中，最大频率Tapph-7a-1（a）区vi仅为63.6％（附加档案4：表S2，图6因此，通过选择有利的等位变异，增加TGW的潜力很大Tapph-7a-1（a）高产小麦育种。

的TaPPH-7A基因被克隆。观察到四个SNP和一个2-BP Indel。分子标记TaPPH-7A-DCAPS是基于1299bp（a / g）的SNP开发的。有利的等位基因变异Tapph-7a-1(A)在人群1中与高TGW和Chl含量相关，而与SN和GN无关。有利等位基因变异的频率Tapph-7a-1（a）从20世纪60年代维持相对稳定的水平约为56％，在1990年代群体3，因此有利的等位基因变异应该是有价值的，并且可以选择通过改善源（叶绿素含量）和水槽来增加籽粒产量（同时发展谷物。新开发的分子标记TaPPH-7A可将-dCAPS集成到高TGW小麦筛选的育种试剂盒中，用于标记辅助选择。

植物材料

CHANC 4738，用高TGW的小麦品种和开花后缓慢叶绿素降解速率，用于克隆TaPPH-7A基因。小麦多样性面板（36名加入，附加档案6：选择表S4）检测TaPPH-7A基因组序列。利用15个不同倍性的小麦品种和一组中国春小麦零四体系进行了染色体定位TaPPH．DH人口[59.]，源自韩萱10的一个十字架 × 以鲁麦14号为材料，共150个品系，对其进行连锁图谱分析TaPPH．

以3个小麦种质群体为材料，分析了小麦等位基因变异TaPPH-7A．人口1由323种加载组成（附加档案3.：表S1），包括275个现代品种，36条先进的线条和12个实地性，用于靶基因等等变异和表型特征的关联分析。人口2（157个Landraces）和348名现代品种）[35.]（中国农业科学院的薛勇张博士提供）用于分析不同小麦生产区和小麦养殖史上有利等位基因变异的频率，并评估新开发的分子标记的利用率。

所有小麦种畜都从中国作物种质资源信息系统中获得法律（http://www.cgris.net/zhongzhidinggou/index.php)．

田间管理与表型评价

种群1在昌平（116°13′E）试验站种植；北纬40°13′，东经116°56′；40°23′N），分别于2015年顺义、2016年昌平、顺义和2017年顺义3个生长季。将试验田划分为两个不同水分状况的小区：雨灌（干旱胁迫）和井水（WW）。DS地块在整个生长季节没有灌溉，但降雨量为173 毫米，143 嗯，还有116 嗯，分别是。WW地块采用750m灌溉^3./公顷（75 mm）：冬前、孕穗期、开花期和灌浆期，各相应时期降雨量不足。此外，2015年和2016年在顺义进行了热胁迫试验（HS），在地块上添加聚乙烯覆盖物。其他田间管理，如施肥、病虫害防治与当地生产条件相同。表型评估在12种环境（E1至E12）下进行。E1至E12表示顺义2015年的环境为WW、DS、WW + HS和DS + 2016年在昌平的HS、WW和DS下，2016年在顺义的WW、DS、WW下 + HS和DS + 2017年分别隶属于WW和DS的HS、顺义。

测定了12种环境下的产量相关性状，包括单株穗数、穗粒数和千粒重。在两种环境下(E11和E12)，用手持便携式叶绿素仪(SPAD-502, konika -美能达，东京)检测开花和灌浆期Chl含量(SPAD值)(附加文件7:表S4)。用5种植物分别测定了SN、GN、TGW和Chl的含量。

在2001 - 2002年和2004 - 2005年和2004 - 2005年和北京期间，人口3在河南省洛阳（112°45'e; 36°61'N）生长在河南省，北京（116°56，40°23'n）2009-2010种植季节[60.］．在所有三种环境中测量了TGW。

DNA和RNA提取和Tapph-A.基因克隆

以长4738幼苗为试验材料。采用CTAB法提取基因组DNA [61.］．在制造商的说明之后使用RNAPREP纯植物套件（天根，北京）提取总RNA。用快速RT试剂盒（用GDNase）（天根，北京）合成第一链cDNA。

水稻的核苷酸序列纽约3(Os06g0354700)基因发表在中国水稻数据中心(http://www.ricedata.cn/gene/index.htm.）用于爆炸搜索来自URGI BLAST网站的中国春季的参考序列（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php.php.)．所有中国春小麦脚手架序列高相似OsNYC3型序列已下载。根据支架序列，利用primerpremier5.0软件设计了3对7A特异性引物。所有引物均由北京华大基因组公司合成，见表3.．第一对7A特异性引物C-F / R扩增编码序列Tapph-A.．使用第二对7A特异性引物G-F / R，用于扩增基因组序列Tapph-A.．利用第三对7a特异性引物P-F/R扩增Tapph-A.．

以Chang 4738的cDNA和基因组DNA为模板。PCR扩增量为20 μL，包括1 μL 50 ng/μL cDNA或基因组DNA，每个引物0.2 μM, 0.2 mM dNTPs, 4 μL 5 ×TransStart®FastPfu缓冲液，0.4 μL (2.5 U/μL)TransStart®FastPfuDNA聚合酶（转基因生物技术，北京）。扩增程序包括95%的初始变性 °C持续5分钟 最小，然后是35 95℃变性周期 30°C s、 58℃退火 45°C s、 延伸到72 °C用于1–2 分钟，最后一次延长到72分钟 °C持续15分钟 PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。使用凝胶提取试剂盒（BIOMIGA，中国）纯化目标条带。将纯化的PCR产物克隆到大肠杆菌中p®-blunt克隆载体（Transgen Biotech，北京），然后转化为33μltrans1-T1噬菌体通过热休克通过热休克（Transgen Biotech，北京）耐化学态态电池。测序每个小麦基因型的六个阳性克隆。使用SEQMAM（DNASTAR LasergeNE 7.1.0）进行序列比对。基因结构Tapph-A.通过对准编码和基因组序列使用兆级（DNASTAR LasergeNe 7.1.0）测定。

分子标记发育

的序列TaPPH-7A利用SeqMan序列对小麦多样性面板中的克隆进行多态性分析。基于多态性位点开发分子标记。使用dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)．底漆对DCAPS标记物是生态RI-F / R。通过两轮PCR进行基因分型，并在Miao等人描述的程序后进行两轮PCR和一种酶消化。［56.］．

人口结构与关联分析

群体1以小麦660为材料 K-SNP阵列，由630517个SNP组成[62.］．通过去除缺失率≥0.2且次要等位基因频率（<0.05）的核苷酸变化，最终使用395,681个SNP来通过软件结构检测人群1的结构2.3.4 [59.］．在Tassel 2.1中进行一般线性模型，用于分析目标基因等等变异和表型性状的显着关联。协会被认为是显着的P<0.05。SPSS 19.0软件（SPSS Corp.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。

定量实时PCR基因表达分析

引物对RT-F/R(表3.）旨在用于分析表达式TaPPH-7A不同的小麦基因型。使用SYBR®和Roche LightCycler®96进行实时定量PCR (qRT-PCR)预混料Ex Taq™（TLI RNASEH Plus）（Takara，日本）。具有特异性引物的QRT-PCR反应系统含有10μL2×SYBR预混物EXAQ TM，0.4μL50×ROX参考染料II，每次底漆0.4μl（5μm）（表3.），1μLcDNA模板，7.8μlDDH₂O.反应程序如下：在95℃下变性2分钟;然后在95℃下进行45次循环，20s，60℃，20s，72℃。taactin.以不同样本归一化表达水平作为内源对照。采用2^-△△CT方法(63.］．Δδ的统计分析C_T根据Zhang等人描述的方法。［35.］．

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在此已发布的文章[及其附加文件]中。

排名:

叶绿素

DCAPS：

衍生的裂解扩增的多态性序列

DH:

加倍单倍体

DS：

干旱压力

GN：

每穗粒数

PPH：

苯酚肽水解酶

QTL：

数量性状位点

SN：

每个植物的钉号码

SNP：

单核苷酸多态性

TGW：

千粒重量

WW：

有实力的

感谢中国农业科学院作物科学研究所同事张学勇博士提供的2号群体(157个地方品种)和3号群体(348个现代品种)的DNA样本。

该工作得到了中国国家自然科学基金（31671607），中国国家重点研发计划（2017YFD0300202），国家科技重大项目培养新的转基因品种（2018 ZX0800917B）。融资机构只提供了实验成本，包括该研究的数据收集和出版费用。但是，实验设计，数据分析和解释，以及撰写稿件由贡献的作者管理。

隶属关系

1. 山西农业大学农学学院，中国太谷030801

   王慧燕，王曙光，孙黛珍

2. 中国农业科学院作物基因资源和遗传改进/作物科学研究所，北京100081

   邓小平，陈阳浩＆ruilian jing

贡献

DS和RJ设计了研究并修改了稿件。HW进行了实验，分析了数据，并起草了手稿。SW、XC和CH有助于测量农艺性状。所有作者阅读并批准最终稿件。

相应的作者

通信孙代珍或瑞士静．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

开放访问本文在知识共享归属4.0国际许可条款下发布(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并说明是否有更改。“创作共用公共领域”豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

转载和许可