响应强抑制剂的代谢和转录分析建立了MEP途径作为喜树碱生物合成的主要途径Nothapodytes nimmoniana（格雷厄姆）Mabb

背景

Nothapodytes nimmoniana喜树碱(CPT)是一种具有重要药用意义的植物，是强抗癌作用的单萜吲哚生物碱(MIA)的来源。这种化合物的效力是由于拓扑异构酶i抑制活性。然而，到目前为止，CPT生物合成的生物合成和调控方面仍然难以捉摸。由于缺乏合适的体外实验系统，CPT的生产也受到限制。从背景上看，MIAs的生物合成有两条途径:在胞质中工作的甲戊酸(MVA)途径和在质体中工作的甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径。通过这两种途径测定相对前驱体通量，可以为提高CPT产量提供新的思路。

结果

本研究采用MVA特异性酶抑制剂(lovastatin)和MEP途径(fosmidomycin)扰乱代谢通量N. nimmoniana。在转录水平上采用qRT-PCR，在代谢水平上通过测定secologanin、tryptamine和CPT含量来研究这两个途径的相互作用。与对照相比，福斯霉素处理植株中浆姜素和CPT的积累量分别显著降低了40-57%和64-71.5%，色胺含量增加了4.61-7.69%。与对照相比，洛伐他汀处理CPT(7-11%)和secologanin(7.5%)的积累减少，而色胺(3.84%)略有增加。这些抑制剂介导的变化通过改变脱氧木糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)和羟甲基戊二酰辅酶a还原酶(HMG)的表达水平反映在转录水平。进一步研究了MEP和MVA通路中DXR和HMG下游的4个基因的mRNA表达。表达分析还包括seco-iridoid途径的secologanin synthase (SLS)和strictosidine synthase (STR)。目前的研究还需要开发一种有效的体外增殖系统，作为途径通量研究的前驱体。进一步说,一个强大的农杆菌属,还开发了介导的转化毛根方议定方案，以实现其作为未来前景的升高。

结论

代谢和转录变化揭示了胞质和质体抑制剂在二环烯醚萜终末产物喜树碱的通路通量扰动下的不同功效。MEP途径似乎是CPT产生的主要前体贡献者。这些经验发现暗示了开发适当的生物技术干预以提高CPT生产。

Nothapodytes nimmonianaMabb (Graham)。(Icacinaceae)，一种高价值的药用植物，分布在西高止山脉和印度东北部以及缅甸、斯里兰卡和泰国。喜树碱(0.150-2.620%)是最丰富的药理活性单萜吲哚生物碱(MIA)来源之一[1］．CPT的其他重要来源包括Camptotheca Accuminata.（0.24-0.5％），Merriliodendron megacarpum(0.053%),Ophiorrhiza pumila (0.1%)那Ervatamia heyneana（0.13％）那Mostuea brunonis（0.06％）和Pyrenacantha瓦（1.35％）[2那3.那4.］．CPT是一种细胞毒性药物，作为DNA拓扑异构酶-1的强抑制剂。其半合成可溶性类似物伊替康和拓扑替康表现出优异的药理学性质和临床疗效与CPT相比[5.］．伊立替康和拓扑替康是美国FDA批准（美国食品和药物管理局）用于结直肠癌，卵巢癌，肺癌和乳腺癌的治疗[药物6.］．通过将磺酰基哌嗪基基基引入CPT的-7位，合成了一种新的CPT衍生物(7-N-[(取代-磺酰基)哌嗪基]-甲基)，该衍生物对5种人类肿瘤细胞系有效，即A-549, KB, MDA-MB-231, MCF-7和KB- vin [7.］．如卢比替康，依沙替康，9-硝基其它衍生物，9-氨基和FL118目前正在临床研究[8.］．CPT在结构上过于复杂，其化学合成至今仍是难以捉摸和禁止的。然而，从其自然资源中开采CPT似乎难以满足其日益增长的市场需求[9.］．半合成衍生物的生产完全依赖于CPTn nimmoniana在自然看台巨大人为压力[10那11那12］．最近，CPT衍生品的全球市场已达到约40亿美元，其需求不断增长需要持续探索自然资源和替代生产平台[13］．在这种情况下，途径强化/操纵的体外策略是由于各种优点而产生高价值次级代谢物的有吸引力的工具。这些主要包括快速生长速率，遗传稳定性及其对生物反应器水平的扩大率。为了规避生物活性化合物的低产量，基因工程工具的开发和应用提供了通过将多种途径基因引入同源/异源宿主中来增强次级代谢产率的有希望的方法，然后在大规模上培养转基因素[14］．根出杆菌根草杆菌通过过度表达关键途径基因，介导的毛状根系是一种更可行、生长速度更快、商业化的可行途径。ORCA2和ORCA4转录因子在毛状根中过表达Catharanthus Roseus.促进2-40倍的吲哚和Seco-Iridoid途径基因的表达水平，与对照相比，导致Tabersonine，Ajmalicine和Catharanthine的较高积累[15那16］．

关于MIAs的产生，目前流行的概念涉及两个不同的途径:存在于质体中的MEP途径和存在于细胞质中的MVA途径。丙酮酸酯和甘油醛-3-磷酸在1-脱氧-d -木酮糖-5-磷酸合酶存在下的缩合过程形成了1-脱氧-d -木酮糖-5-磷酸，这是合成植物激素、异戊二烯、类胡萝卜素、质体醌和叶绿素侧链的第一中间体。胞质MVA途径从乙酰辅酶a开始，通过甲戊酸中间体进行，为聚戊烯醇、泛素酮和甾醇提供前体[17那18］．类似地，3-羟基-3-甲基戊芳基因还原酶（HMGR）是MVA途径和洛伐他汀（LOV）的关键酶是HMGR的有效抑制剂[19］．1-脱氧-D-木糖5-磷酸氧化酯酶（DXR）是MEP途径的重要酶，而Fosmidomcin（FOS）是其特异性抑制剂[20.］．这两个不同的生物合成途径产生二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）和它的异构体焦磷酸异戊烯基（IPP），其提供一种用于生产一强磁通量secologanin断 - 环烯醚萜途径的关键中间体[21那22］．Secologanin进一步与莽草酸途径的衍生物色胺缩合生成strictosidine，它是所有MIAs的通用前体(图)。1) ［23那24那25那26］．虽然MEP和MVA途径的亚细胞区隔化使它们能够在植物中同时工作，但正如最近的一些研究表明，途径之间的代谢物交换可能会发生[20.那27］．从以往的研究，这两种途径的贡献，据报道，在像homoterpene- 4,8- dimethylnona -1,3,7-三烯（DMNT）一些次生代谢产物的生物合成。这是引起许多高等植物响应食草动物攻击[28］．此外，MEP已被报告为Seco-Irimoid部分Secologanin生产的主要途径c . roseus也叫[29和紫杉醇紫杉[30.］．同样,在Picrorhiza kurroa，通过使用不同的酶抑制剂(fosmidomycin、mevinolin、草甘膦和氨基乙酸)和转录抑制剂放线菌素D，证实非甲戊酸途径是苦苷生物合成的主要来源[31］．在拟南芥在Hmgr抑制剂（Lovastatin）存在下观察到甾醇水平的瞬时降低，表明塑性MEP途径补偿了合成细胞溶甾型甾醇所需的缺乏细胞溶胶IPP [32］．但在情况下，紫草erythrorhizon和arnebia euchroma抑制研究表明，Shikonin通过MVA途径产生溶质，与植物中的所有其他单萜和二萜形成相反33那34］．一般来说，次级代谢产物的生物合成是通过代谢网络之间复杂的交叉作用进行的，因此确定每一个代谢网络通向最终产物的主要途径是非常重要的。代谢途径的抑制剂介导的研究可以为破译目标代谢物的途径提供重要线索[32那35］．但是，没有进行这样的调查n nimmoniana以了解MVA或MEP通路在CPT产生中的相对贡献．采取现行调查应通过分子干预提供一种合理的平台和防静电工具，用于操纵前体池的转移朝向所需的生物合成分支。此外，这项研究继续延续我们最近与综合转录组资源的发展有关的努力n nimmoniana鉴定与CPT生物合成相关的途径基因、细胞色素和转录因子。它还需要人工microRNA (aMIR)介导的抑制nn.CYP76B6提示其在CPT生物合成中的作用[36］．组织特异性化学分析显示secologanin是seco-iridoid通路的中心中间体n nimmoniana相比之下，在C. Accuminata.[36那37］．

鉴于CPT的药理效力及其不断增加的需求，本研究剥离了塑性-MEP和细胞癌-MVA途径对促进血栓生物合成的前体的相对作用。从这个角度来看，建立了高效的体外再生系统，随后部署，探讨了两种已知抑制剂的功效即，DXR和HMG酶的Fosmidomycin和洛伐他汀分别调节MEP和MVA途径。在体外培养物处理的抑制剂的化疗剖析揭示了在Fosmidomcin存在下CPT的剧烈降低，Secologanin积累。这些结果表明MEP途径在CPT生物合成中的关键作用。此外，还通过研究MEP，MVA和Seco-Irimoid途径的下游基因在转录水平上评估抑制剂的效果。与对照相比，基因的相对转录水平的可明显降低。此外，还建立了转化的毛状根诱导方案农杆菌属rhizogenes。作为未来前景的，转化的发根培养物正在按比例放大用于通过分子干预进一步MVA途径激化。

植物材料与企业的无菌培养

源植物材料被科学家CSIR-印度综合医学研究所（（32°44'N经度，74°55'纬度为74°55'纬度;海拔305米），印度的凭证。一张优惠券标本（登录号23002;收藏家的名称：Surrinder K.典礼博士;收集地点：CSIR-IIM实验领域，Jammu）已经存入Janaki Ammal Herbarium（RRLH），CSIR-IIM，印度Jammu。在从田间种植的幼年植物的节点段建立了体外培养物Nothapodytes nimmoniana。采用长1 ~ 3cm的带腋芽节段进行离体无菌培养启动。首先，外植体用流动自来水仔细冲洗，然后浸入1% (v/v) Tween 20 (HiMedia, Mumbai, India)中15-20分钟，然后再用自来水冲洗45分钟。进一步，外植体转移到0.1% (w/v) HgCl₂（HIMEDIA，孟买，印度）一分钟，然后再次用灭菌蒸馏水冲洗下，层流罩2-3次。灭菌段在木本植物培养基（WPM）转移38]补充有3％（w / v）蔗糖，0.7％（w / v）琼脂（Amresco，孟买，印度），1 mg / l IBA和各种不同的细胞蛋白（TDZ，IBA，KN），如表所示1．采用25个外植体，共3个处理，从黄檀节段开始离体培养N. nimmoniana。在每次处理体外再生芽45随后转移被用于根启动。数据的统计分析进行与每戈麦斯和Gomez的[39］．使用ANOVA与显着性水平为5％邓肯多范围的测试数据进行了分析。计算的方式平均值和标准差。The cultures were maintained at temperature of 22 ± 2 °C with 16 h photoperiod. The light intensity of culture room was set at 25–30 μE/m²/ s促进了40 W COOL白色荧光灯（飞利浦，印度）。对于生根而言，体外再生芽被转移至WPM，其用不同浓度的IAA或IBA强化。

抑制剂治疗

两种化合物膦胺霉素（3- [甲酰基（羟基）氨基]丙基膦酸）和洛伐他汀（[（1S，3R，7S，8S，8AR）-8- {2 - [（4R，6R）-4-羟基-2-氧代-2H-吡喃-6-基] etyl} -3,7-二甲亚-1，2，3，7，8，hexahydronaphtyl（S）-2- metylbutyrat），MEP和MAV途径的已知抑制剂从采购Sigma-Aldrich公司，美国。膦胺霉素的储备溶液在高压灭菌蒸馏水中制备和洛伐他汀溶于乙醇。Both were filter sterilized using 0.22 μm sterile filters (Millipore, Bedford, USA). Filter sterilized fosmidomycin and lovastatin were added separately to autoclaved liquid WPM to a final concentration of 150 μM and 100 μM respectively. In vitro rooted cultures acclimatized in liquid medium for 2 weeks were transferred to 250 mL flasks containing inhibitors and one in basal minimal medium as a control. Samples were harvested at day10 and day 20 of the treatment for quantification of CPT, secologanin, tryptamine and also for qRT-PCR analysis.

RNA提取和cDNA合成

根据制造商的说明，通过使用SV总RNA分离系统（Promega，Madison，USA）提取总RNA。通过分光光度计（AstraAuriga，英国）估算总RNA的浓度。通过估计260/280nm处的吸光度比并进一步检查甲醛的琼脂糖凝胶电泳进行测量RNA质量。通过使用REVERAID第一链CDNA合成试剂盒（热型，维尔纽斯，立陶宛）在含有1μgRNA的20mL的总反应体积，10mM DNTPS，10mM oligo（DT）底漆，1μlM-MULV逆转录酶中，合成cDNA（200 u / ml）和4μl5x的5x第一链缓冲液（250mM Tris-HCl，pH 8.3,250mM KCl，20mM MgCl₂， 50毫米DTT)。42°C孵育60 min, 70°C灭活5 min。

样品制备和HPLC条件

黄芪提取物中CPT、secologanin、tryptamine的提取n nimmoniana使用略微修饰的协议进行，如富弦等人所述。（2005）。简而言之，在处理的第10天和第20天收集植物样品，并在25±2℃和相对湿度下干燥65±5％。使用砂浆和杵将干燥的样品分别接地成细粉末。通过在室温（26±2℃）的磁力搅拌器（Multiplepin磁力搅拌器，Tarsons，印度）上搅拌48小时，用90％甲醇（v / v）萃取细粉末。过滤萃取物并使用旋转蒸发器浓缩。在HPLC级甲醇中制备了真正的标准喜树碱（1mg / ml）和样品提取物（20mg / ml），过滤通过0.25μm膜过滤器（Millipore，Bedford，USA）并进行HPLC分析。HPLC分析与Shimadzu类VP V 6.14 SPI系统（东京，日本）进行，配备5μm，4.6×250 mm RP-18E栏（E-Merck，Bangalore，India），一项四季梯度泵（LC-10AT VP模型）和PDA检测器（型号：SPD-M10A VP）。CPT和Secologanin的流动相由乙腈：甲酸（99.5：0.5; v / v）组成，以800μlmin的流速输送⁻¹．色胺的测定，流动相为50% (v/v)甲醇在含0.1%甲酸的水中，流速为0.9 mL min⁻¹．The injection volume of the samples was 10 μl and the column temperature was maintained at 30 °C to provide efficiency to the peaks. The UV wavelength was set at 254 nm for detection of chromatograms. Identification and quantification of CPT, secologanin and tryptamine was carried out using a reverse-phase HPLC system. The detection was made on the basis of retention time of standards under specific column conditions.

LC-MS / MS分析

液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析用于测定植物样品提取物中的FOSMIDOMCIN和LOVASTATIN。使用0.1％（v）甲酸在水中和0.2％（v / v）上使用0.1％（v / v）甲酸组成的流动相，在Lichrospher rp-18（4.6×250mm内径，5μm）柱上进行LC-MS / MS分析。（v / v）甲醇中的乙酸。将流速设定为0.5ml / min，塔温设定在30℃。使用正离子模式的电喷涂电离源操作三重四极杆串联质谱仪。其他常见的MS条件如下：DL温度225℃，雾化器气体流3L / min和干燥气流为15升/分钟。总运行时间为30分钟。将五微升的样品体积注射到LC-MS / MS系统上。实验解决方案软件用于分析数据。

定量RT-PCR评估

从该菌株的转录组资源中，设计了用于qRT-PCR分析的基因特异性引物n nimmoniana由作者建立[36］．对于适当的选择，在Blastx搜索后选择具有最大同源性与NCBI中功能表征基因的CONTIG。通过底漆快速工具3.0版设计引物（表2)．从叶片中分离出总RNA，按照厂家说明，使用RevertAid cDNA合成试剂盒进行逆转录。qRT-PCR分析采用Step One Real-time qPCR系统(Applied Biosystems, USA)进行。以SYBR绿料为模板，分别包含0.2 μl cDNA、0.2 μM引物、5 μl SYBR Premix Taq (Takara, Otsu, Japan)和MQ水，各10 μl进行PCR反应。反应的热曲线为:94℃变性1 min, 94℃变性10 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸25 s，共40个循环。以肌动蛋白基因作为内对照，评估基因相对转录水平。相对定量方法(2^——ΔΔCT)用于分析重复之间的数量变异[40］．将每个cDNA样品进行三次重复，用于QRT-PCR分析并重复两次。此外，统计上分析数据。

毛状根的诱导

三个农杆菌属测试菌株ATCC15834，LB9402和A4，以进行转化效率N．nimmoniana．Prior to transformation, bacterial strains were grown for 2 days on solid Yeast Mannitol Broth (YMB) at 28 ± 2 °C. From each strain single colony of bacteria was inoculated into 10 mL of liquid YMB medium containing an appropriate antibiotic and grown overnight at 28 °C with vigorous shaking (180 rpm). One milliliter of the overnight cultures were used to inoculate in 100 mL of YMB medium and incubated at 28 °C under shaking until reaching O.D. 600. Bacteria were harvested by centrifugation at 5,000 g for 10 min at room temperature. The supernatant was discarded and bacterial pellet was resuspended in 20 mL fresh YMB containing various concentrations of acetosyringone (50–300 μM). These concentrated cultures were used for infection of explant materials. The explants were kept in sterile petri dishes and pricked manually with sterile needle. The injured samples were dipped in根出杆菌根草杆菌28°C孵育30分钟。感染外植体干燥，在MS基础培养基上28±2℃共培养48 h。共培养一段时间后，用无菌水洗涤2次，转移到含500 mg/L头孢噻肟的MS基础培养基上去除多余细菌。外植体损伤部位3 ~ 4周后开始出现毛状根。然后转入无激素MS1/2液体培养基中继续生长。

DNA提取和PCR分析

基因组DNA从转化的发根以及来自野生根中提取n nimmoniana使用Wizard®基因组DNA纯化系统，根据制造商的协议(Promega，麦迪逊，美国)。使用NanoDrop®ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)估计DNA样品的吸光度。DNA质量由260 nm/280 nm的光密度比和0.8%琼脂糖凝胶分析确定，然后检测条带完整性。通过扩增验证了毛状根的转基因性质rol.B基因使用基因特异性rol.B引物表2．PCR程序如下:95℃初始变性5 min;然后在95°C下进行35个循环，持续30秒;50°C退火30 s;72°C拉伸50秒，最后72°C拉伸1分钟。在热循环器(Biorad, Hercules, CA)中进行20微升的PCR反应，该循环器含有100 ng DNA, 2.5 mM氯化镁₂， 200 μM dNTPs，正反向引物各400 nM, 10x Taq缓冲液含(NH_4.）₂所以_4.，和一个单位的Taq DNA聚合酶(Fermentas, Glen Burnie, MD)。扩增区域用琼脂糖凝胶电泳检测。

实验设计及通路抑制剂对CPT积累的影响Nothapodytes nimmoniana

从田间的节段生长N. nimmoniana，在用不同的植物激素浓度和组合的WPM下建立高效且高度可重复的体外再生系统（图。2)及其形态发生反应概述见表1．节段外植体在添加9.08× 10的WPM上表现出最大的多芽诱导反应⁻⁶M硫代azuron (TDZ)和4.92 × 10⁻⁶ M IBA with regeneration frequency of 65% and an average of 9.8 ± 0.60 shoots per explant. After 7–8 weeks of in vitro growth, fully developed elongated shoots were transferred to rooting WPM medium supplemented with 14.7 × 10⁻⁶ M IBA. Further, in vitro regenerated rooted plantlets were employed to evaluate the flux perturbations caused by specific inhibitors of MEP and MVA pathways (Fig.3.a, e).这些培养物在液体WPM中生长和驯化2周，随后在含有抑制剂fosmidomycin (150 μM)和lovastatin (100 μM)的液体WPM中生长。经抑制剂处理后的提取物第10天进行LC-MS/MS扫描，发现含有磷霉素(m/z)₌182.15（M-H）⁻洛伐他汀的m/z值₌405.5.（M + H)⁺(无花果。4.)．洛伐他汀标准品、植物组织中的洛伐他汀、福斯霉素标准品、福斯霉素在植物组织中的质谱作为附加文件提供1那2那3.和4.,分别。此外，对处理第10天和第20天收获的绿芽进行化学和qRT-PCR分析。真实标准品CPT、secologanin和tryptamine的HPLC图谱及其在提取物中的检测如图所示。5.．在抑制剂存在下，观察到CPT、secologanin和tryptamine的差异积累。植物化学分析显示，经福斯霉素处理的培养物中，环烯醚萜途径的代谢物如secologanin和CPT显著减少，而莽草酯途径的代谢物色胺(strictosidine的直接前体)仅轻微增加(图)。3.结果表明，在磷霉素处理第10天，与对照相比，secologanin和CPT的含量分别降低了57和71.5%。在第10天首次下降后，第20天收获的样品中，与对照相比，secologanin和CPT的水平分别恢复到~ 17和7%。3.b，c）。此外，Tictparamine分别在第10天和第20天的内容增加4.6％和7.69％（图。3.d).另一方面，洛伐他汀效果最差。化学分析显示，经洛伐他汀处理的样品在第10天和第20天的CPT含量分别仅下降了11%和7%(图2)。3.f). Secologanin含量在第10天下降7.5%，在第20天恢复到正常水平(图2)。3.G）。在第10天的Tartpamine含量略高3.84％，并在第20天实现正常水平（图。3.H）。作为在代谢产物堆积一个整体，主要波动膦胺霉素处理的样品中观察到，而洛伐他汀的影响是可以忽略不计近。

抑制剂介导MEP/MVA通路基因表达的变化

采用qRT-PCR方法检测DXR和HMG的表达水平，探讨fosmidomycin和lovastatin在转录水平上的抑制作用。在使用磷霉素的情况下，与对照组相比，DXR的表达量在第10天和第20天降低了0.57-0.15倍(图)。6.a，b）。类似地，洛伐他汀减少HMG的表达水平高达0.32-0.11倍（图6.c, d)。此外，我们还检测了MEP通路下游3个基因(DPCMEK, MECDPS, HMBEDPR)和MVA通路(MK, PMK, DPMD)的表达水平(图)。6.广告）。这些基因也表现出0.87-0.10他们的转录水平倍减少。此外，关键途径基因SLS和开环 - 环烯醚萜途径的STR也进行了调查，其结果显示在膦胺霉素（图的存在下，在它们的转录物水平0.71-0.14倍的减少。6.a, b)。与对照组相比，在洛伐他汀处理的培养中，观察到SLS和STR转录水平轻微下降了0.05-0.08倍(图2)。6.C，d）。总体而言，膦胺霉素抑制剂和洛伐他汀强分别减少DXR和HMG的转录水平。据进一步明显在调节其它检查下游基因即表达水平方面。DPCMEK，MECDPS，HMBEDPR，MK，PMK，DPMD，SLS，STR。

毛状根诱导及CPT定量

根出杆菌根草杆菌介导的发根诱导方案，优化影响变换（图几个参数之后开发的。7.)．以介入愈伤组织再生的器官发生芽为外植体进行毛状根诱导。三个农杆菌属菌株张。测试ATCC15834，LB9402和A4的效果。所有菌株成功地诱导毛茸茸的根，但它们的转化效率受到不同乙酰菌酮浓度的影响。在200μm乙酰苯乙烯酮浓度下，A4菌株显示出最高的转化频率（53％），然后是LBA9402（38％）和ATCC 15834（35％）（图。8.)．毛状根的转基因性质是由PCR扩增证实rol.B基因。从毛状根的基因组DNA中扩增出780 bp的片段，而在未转化的无菌根中未发现该条带。毛状根进一步在无激素半强度MS液体培养基中生长3周，并收获用于CPT分析(图)。7.d).制备离体(毛状根、嫩枝、愈伤组织)和体内(果、叶、根)组织的甲醇提取物进行高效液相色谱分析，以评估CPT含量。以干重计，母株果实、叶片和根组织中CPT含量分别为0.34、0.12和0.9%。而在离体愈伤组织、叶片组织、根和毛状根中CPT含量分别为0.02、0.044、0.069和0.08%。有趣的是，毛状根的CPT含量(0.08%)略高于相应的无菌离体根(0.069%)(图。9.)．

植物产生显示多种结构多样性和生物活性的低分子量的化学成分的一个惊人的多样性。生物活性化合物倾向于累积在非常小的数量和它们的化学合成通常是复杂的[14那36］．然而，体外培养系统提供了合理的工具，用于了解植物次生代谢的生理，代谢，生化和分子调控，并广泛用于克隆繁殖，作为代谢工程的网关，为高价值药学上提供可行的生产平台分子[41］．在这种情况下，一个有效的在体外再生系统n nimmoniana以9.08 × 10⁻⁶M TDZ和4.92 × 10⁻⁶ M IBA. In plants, biosynthesis of secondary compounds is exceedingly intricate and highly coordinated process as far as their biosynthesis, storage and temporal and spatial expression is concerned [42］．总的来说，植物组织中潜在的生物活性成分的有限产量提出了大规模药物生产的挑战[43］．途径工程以植物细胞和组织培养的形式促进了体外策略的发展，作为可选的次级代谢物生产平台，可以在受控条件下扩大[44］．上下文，代谢途径的了解是极其重要遗传操作以增大目标代谢物以及在分子水平上改变的关键代谢基因的表达[45那46］．尽管结构复杂，MIAs是由基本的异戊二烯单元(即焦磷酸异戊酯)生物合成的，在植物中通过两种不同的途径产生，胞质MVA途径和质体MEP途径[47］．然而，研究表明这些途径之间的异戊二烯单元的串扰[48］．这些推论促使人们进行密集的研究，利用喂食实验来破译串音的组成部分。在丹参据报道，MVA途径通量在细胞生长中发挥主要作用，而MEP途径的中间体是丹参酮生物合成的主要来源[20.］．同样,在Picrorhiza kurroaMEP途径在苦味苷生物合成中的作用是通过使用酶抑制剂mevinolin和fosmidomycin以及氨基氧基乙酸、草甘膦和放线菌素D确定的[31］．在n nimmoniana喜树碱生产涉及途径，包括MEP，MVA，莽草酸和开环 - 环烯醚萜途径的复杂网络。本次调查是发散的前体池和理解MEP和MVA途径的喜树碱生产中的作用的一种尝试。使用途径特异性抑制剂磁通扰动创建一个声音理解生物合成途径，其各自的终产物和铺平的有效生物技术干预方式。总之，它建立主要前体贡献通路朝向涉及衬底磁通的导流目标代谢物是振振有词必不可少的。在本研究中，两个特定抑制剂膦胺霉素和洛伐他汀被选定为抑制两个重要的酶和DXR分别MEP和MVA途径的HMG和它们的抑制浓度测试如先前报道[31］．化学分析表明，经福斯霉素处理后，CPT和secologanin的积累分别减少64-71.5和40-57%。莽草酸途径产物色胺含量在4.61 ~ 7.69%范围内略有增加。这可能是由于secologanin含量的强烈下降，它与色胺缩合生成strictosidine, MIAs的通用前体。此外，在lovastatin的存在下，CPT和secologanin的浓度没有显著降低，而色胺的含量几乎保持不变。因此，通过质体途径促进CPT积累的能力似乎比通过胞质途径更有效。从实验结果可以明显看出MEP途径在CPT生物合成中的主导作用。这些结果是站得住脚的，并与文献中有关通路抑制的研究结果一致Catharanthus Roseus.那P. Kurroa.和美国miltiorrhiza[20.那31那48］．此外，洛伐他汀治疗显示，CPT含量小幅下降，可能是由于因为还有两个条块途径之间的代谢物的交换。Oliver等人。[49]也报道了通过抑制MVA途径的HMGR酶可暂时降低甾醇水平。这一发现揭示了MVA途径可能导致胞质甾醇合成所需的胞质焦磷酸异戊酯缺乏[32］．还讨论了细胞溶质和塑性途径之间的这种串扰美国miltiorrhiza[20.］．此外，本次调查显示，两种抑制剂减少这促使我们审视在转录水平的影响secologanin和CPT内容。MEP和MVA和开环 - 环烯醚萜途径基因的我们的qRT-PCR分析显示，在抑制剂的存在下，改变的基因表达。DXR和HMG的与其他下游基因一起表达（DPCMEK，MECDPS，HMBEDPR，MK，PMK，DPMD，SLS，STR）表现出柔和的表达水平与对照相比。这强烈地暗示DXR的抑制和HMG酶可能导致在MIA途径的下游中间体降低。此外，这些变化是在转录水平明显。从以往的研究中，已经阐述了在转录后调控可能在表达和基因调控中起重要作用。

根出杆菌根草杆菌介导的毛根诱导被认为是产生高价值次级代谢物和基础研究工具，以理解生物合成途径通过遗传操作的committed步骤[50］．与MIA生物合成策略相关的代谢工程的一个成功尝试是同时分离过表达香叶醇10-羟化酶(G10-H)和strictosidine合成酶(STR)ophiorrhiza pumila多毛的根源。G10-H基因与STR基因共过表达O.荔与对照和单基因转基因株系相比，CPT积累增加了约56% [51］．在本研究中，发根通过三种诱导农杆菌属对菌株LBA9402、ATCC15834和A4的转化效率进行了评价。A4菌株的转化效率最高，而LB9402和ATCC15834菌株的转化效率相对较低。酚类化合物乙酰丁香酮增强了毒力农杆菌属菌株和它的浓度已经报道调节转化的频率[52］．在Berberis Aristata.发现100μM乙酰苯乙烯酮浓度更有效，而200μm浓度P. Kurroa.[53那54］．To evaluate the effect of acetosyringone in transformation frequency in the present study, different concentrations (50–300 μM) were tested and among these 200 μM was found to be the most effective. Secondary metabolite accumulation fluctuates in different environmental conditions [55]，以及一些环境因素，如光线、温度和湿度等，影响生物化学途径[56］．在C. Accuminata.色氨酸脱羧酶的细胞特异性表达分析（Ca-TDC1）和10-羟基甲基醇氧化还原酶（Ca-hgo）透露两者Ca-TDC1和Ca-HGO在叶和茎中均有表达，但在根中未见表达。这些结果表明，根可能是CPT的积累位点[57］．在目前的研究中，化学分析n nimmoniana根中CPT的积累量高于叶。此外,在C. Accuminata.从微闭中再生的体外根部的CPT定量表明CPT的较低积聚而不是体内根部的积累[58］．然而，高效液相色谱法分析体外再生o. Mungos.显示出与体内生长的植物相当的CPT含量[59］．在n nimmoniana体内和体外组织的化学分析显示差异CPT积累。与体内植物组织相比，在体外再生毛状根，Calli，叶和根组织中观察到低含量的CPT。而且，Calli和悬浮文化C. Accuminata.未产生CPT，与愈伤组织形成对比n nimmoniana[60］．迅速增长，成熟毛茸茸的根O.荔在干重基础上产生0.1%的CPT和毛状根C. Accuminata.在等于或大于正常根的培养基中产生和分泌喜树碱(1.0 mg/g干重)和10-羟基喜树碱(0.15 mg/g干重)C. Accuminata.[61那62］．在本研究中，从体外叶片再生的HPLC分析n nimmoniana显示CPT含量为0.08％，比从体外培养物中获得的未转化的无菌根（0.069）比较高且比在观察内容稍有降低C. Accuminata.和O.荔[61那62］．

由于喜树碱分子的复杂结构，其工业生物合成令人望而却步和站不住脚。此外，它以低浓度产生，并且由于未解的生物合成机械而阻碍其途径调制。因此，探索途径前体通量导流用于代谢强化可能可享受增强的方式铺平道路在足底通过生物技术干预生产。不同生物资源中CPT的差异累积，如毛状根，发育组织，愈伤组织，叶子，根等的n nimmoniana可以通过系统生物学方法，包括转录组学、基因组学、蛋白质组学和代谢组学，在给定的生物系统中生成相关基因和代谢物，从而促进路径解析。在未来，这种整合的“组学”方法可以帮助预测未知的和新的基因及其酶，这些基因和酶涉及到迄今为止尚未解决的喜树碱生物合成。

为了细化抑制剂对异戊二烯类终产物CPT通路通量扰动的影响，我们在代谢产物水平通过HPLC和转录水平通过qRT-PCR监测抑制剂介导的变化。在特定的酶抑制剂存在的情况下，观察到CPT的差异积累，这些变化也反映在转录水平上。目前的研究表明MEP途径是CPT生物合成提供单萜的主要途径。此外，为了进行与CPT生产相关的抑制剂研究，我们开发了一个高效的体外再生系统作为实验系统。我们还成功地诱导转化毛状根培养根出杆菌根草杆菌．目前，通过基因工程，毛状根用于进一步的MVA途径强化。

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在此已发布的文章和补充信息文件中。

DPCMEK：

Diphosphocytidyl-2-methyl-D-erythritol激酶

DPMD:

Diphosphomevalonate脱羧酶

DXR：

脱氧木酮糖-5-磷酸还原

HMBEDPR:

羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶

邮政编码:

羟甲基戊齐芳基因CoA还原酶

MECDPS：

Methyl-D-erythritol 4-cyclodiphosphate合成酶

MEP：

甲基赤磷酸盐

MEPCT:

甲基erythritol-4-phosphate cytidyltransferase

可:

甲羟戊酸激酶

MVA:

米瓦洛酸盐

PMK：

磷酮激酶

SLS:

Secologanin合成酶

STR：

Strictosidine合酶

作者感谢查谟CSIR-IIIM的Prabhu Dutt和Amit Kumar为高效液相色谱和LC-MS/MS分析提供了便利。GAR及AS分别感谢教资会及DST-INSPIRE提供高级研究奖学金。SMJ感谢印度新德里的科学与工程研究委员会(塞尔维亚)颁发的青年科学家奖学金。本手稿代表机构通讯编号IIIM/2261/2018。

这项工作得到了印度科学与工业研究理事会(CSIR)-印度中西医结合研究所重大实验室项目MLP-3012 (WP 7)和部分资助项目GAP-2134的资助。资助机构没有参与研究的设计、收集、分析、解释数据和手稿的编写。

隶属关系

1. 植物生物技术科，中西医结合，运河路，查谟塔威，180001，印度CSIR-印度理工学院

   Gulzar A. Rather, Arti Sharma, Syed Mudassir Jeelani, Prashant Misra & Surrinder K. Lattoo

2. 印度180006年，Jammu Tawi大学植物学系，Jammu Tawi

   Veenu考尔

贡献

SKL构思并设计了这项研究。GAR、AS和SMJ进行实验。GAR、SKL、VK和PM对数据进行分析。SKL和GAR撰写了手稿。SKL提供试剂/材料/分析工具。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到Surrinder k Lattoo．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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