不同耕作方式对直接播种香稻2-乙酰-1-吡咯啉生物合成的调控

背景

整地是香稻生产的重要组成部分。然而，耕作对香稻生产的影响尚不清楚，尤其是对香稻特有香气的主要化合物2-乙酰基-1-吡咯啉(2-AP)的生物合成。本研究旨在探讨不同耕作方式下香稻2-AP的生物合成。采用常规旋耕(CK)作为对照、耕作(PT)和免耕(NT) 3种耕作方式。

结果

与CK相比，PT处理提高了籽粒2-AP含量，上调了鸟氨酸氨基转移酶(OAT)活性，提高了1-吡咯啉和吡咯啉-5-羧酸(P5C)含量。铂处理提高了香稻的产量和氮素积累量。同时，由于脯氨酸含量和脯氨酸脱氢酶(PDH)活性的提高，NT处理籽粒中2-AP含量显著高于PT和CK处理△1-吡咯-5-羧酸合成酶。然而，本研究发现，在NT条件下，由于产量、氮素积累和抗氧化酶活性较低，香稻总产量较差。土壤有机质含量和微生物数量增加。

结论

与对照相比，PT提高了香稻籽粒产量和氮素积累量，提高了OAT活性，导致2-AP浓度增加。免耕还通过提高PDH和P5CS活性提高了籽粒2-AP含量，但限制了香稻产量和氮素积累。

大米(奥雅萨·萨蒂瓦。L)是世界上大约70%人口的主食和主要粮食作物。1］．香米作为一种特色大米，因其独特的香味而闻名于世。近年来，2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)被鉴定为香稻品种中的关键芳香化合物[2]，同时也明确证实大多数2-AP为生物合成来源[3.］．虽然2-AP在香稻中的生物合成是一个复杂的过程，但是关于2-AP生物合成的研究报道很多。例如，吉桥的研究[4[展示脯氨酸是香米的2-AP生物合成中的氮源。Poonlaphdecha的研究[5[根据使用水稻Calli培养物的喂养实验，1-吡咯啉在2-AP生物合成中是一个限制性前体。此外，早期研究表明，BADH2通过编码βAldehyde脱氢酶来降低芳香水稻中的2-AP的生物合成[6］．近年来，稻米中2-AP的含量逐渐成为评价香稻品质的指标之一，因此越来越多的科学家开始研究提高香稻中2-AP含量的方法。

为了提高香稻籽粒中2-AP的含量，人们提出了多种作物管理策略，如施肥、水分管理甚至光控。已有研究表明，孕穗期额外施氮可诱导香稻2-AP浓度增加[7］．包的研究[8]揭示香米干燥条件下的2-AP含量增加的分子基础。邓[9表明灌浆期轻度干旱环境与施氮量之间存在交互作用。此外,密苏里州(10.]发现谷物灌装阶段期间的阴影可以大大增加香米的2-AP含量。在香草中的2-AP生物合成中所提出的途径在图2中示出。1．

一般来说，整地是水稻生产的关键活动。但耕作对香稻2-AP生物合成的影响尚未见研究。在农业生产中，土壤在支持作物生长发育、维持和输送水分和气体、维持养分循环和转化等方面发挥着重要作用。耕作可将土层切割破层，使其疏松多孔，降低土壤容重，改善土壤结构，影响土壤水、肥、气、热条件，共同为水稻创造良好的生长环境，提高水稻产量。中国农业历史上有两种耕作方式:犁耕法和旋耕法。近十年来，由于整地速度快、成本低、破碎土壤效果好，大多数农民选择旋耕而不是犁耕[11.］．然而，近年来，由于土壤问题(如土壤结构不良)和耕作对土壤生物的负面影响，传统的旋耕法越来越吸引农民和研究人员[12.］．

因此，为了比较不同耕作方式对香稻2-AP生物合成的不同影响，本研究在广东省(中国南方水稻主产省)进行。

籽粒2-磷素含量

与旋耕相比，耕耕和免耕显著提高了直种香稻籽粒2-AP含量。如图所示。2、2 _ap内容在粮食生产PT和NT高出29.26%和14.97,分别比观察粮食生产与CK在本赛季初,在赛季末PT和NT治疗粮食2-AP含量增加了31.52%和23.81,分别比CK。

参与2-AP生物合成的前体和酶

如图所示。3.铂和NT处理影响2-AP生物合成的前体，如脯氨酸、P5C和1-吡咯啉。灌浆期，NT显著提高了籽粒脯氨酸含量，而PT和CK在灌浆期均无显著差异。灌浆期籽粒P5C和1-吡咯啉含量变化趋势均为NT > PT > CK。此外，不同耕作方式在香稻2-AP生物合成酶活性方面也存在差异(图2)。3.)．与CK相比，NT治疗显着增加PDH和P5CS活动分别为9.45-11.57％和12.68-12.70％。在两个季节的PDH和P5CS活动中，CK和PT之间没有显着差异。然而，与初季和晚期的CK相比，PT中记录了11.79和11.35％的oAT活性，而在两个季节的燕麦活动中没有显着差异。

MDA含量和叶片抗氧化反应

如图所示。4其中，与旋耕相比，耕耕对香稻抗氧化酶活性影响不大，免耕对香稻SOD、POD和CAT抗氧化酶活性影响显著。PT与CK耕作在分蘖期、抽穗期和成熟期的SOD、POD、CAT活性和MDA含量均无显著差异。但与CK相比，NT处理显著降低了两个季节的SOD、POD和CAT活性(除早季成熟期CAT活性外)。此外，除前期成熟期外，NT处理MDA含量均高于CK。

土壤有机质和微生物

如表所示1，与对照相比，NT和PT处理均提高了3种土壤深度的有机质含量。在0 ~ 10 cm土层，PT和NT处理的真菌和放线菌数量均高于CK。在10 ~ 20 cm土壤深度，CK和PT处理对真菌数量无显著影响，而NT和PT处理显著增加了细菌和放线菌数量。在20 ~ 30 cm土层，细菌、真菌和放线菌数量的变化趋势为:NT > PT > CK。

籽粒产量与氮素积累

不同耕作条件下香稻籽粒产量存在一定差异。5)．与对照相比，PT处理显著提高了前期和后期的籽粒产量(分别提高了12.30和10.62%)。在前期和后期，施氮处理籽粒产量分别比对照低8.20和3.90%。全氮积累在前期表现为PT > CK > NT，后期表现为PT > CK > NT。

2-AP的生物合成是香米的一种非常复杂的现象，涉及许多前体和酶，例如脯氨酸，1-吡咯啉，P5C，P5CS，PDH和OAT。近年来，人们普遍认为在香米中生物合成2-AP有三个步骤。首先，通过P5Cs，脯氨酸脱氢酶（PDH）和OAT的活性转化为P5C的谷氨酸，脯氨酸和鸟氨酸。然后，P5C与甲基乙二醛反应，这是非酶促的，转化1-吡咯并△¹-吡咯最后生成2-AP(图。1）[26.，27.］．

为了提高香稻籽粒中2-AP含量，一些研究探讨了施肥和水分管理的影响。例如，对Mo的调查[28.结果表明，增施硅肥可通过提高PDH活性提高籽粒2-AP浓度。任(29.结果表明，施氮和水分管理对香稻2-AP生物合成存在交互作用。研究了耕、免耕对香稻中2-磷素含量的影响。在我们的研究中发现，与旋耕相比，耕耕的P5C、1-吡咯啉含量和OAT活性都更高。免耕条件下，2-AP浓度的增加可能与P5CS、PDH活性和脯氨酸、P5C和1-吡咯啉含量的增加有关。耕、免耕可能通过不同的酶途径促进2-AP的生物合成。

犁耕与免耕的差异可能是由于不同耕作方式造成的田间环境不同[30.］．脯氨酸作为香稻2-AP生物合成的重要前体，其生物合成受到环境的很大影响[31.，32.］．Szabados的调查[33.]显示有两种方法可以在植物中合成脯氨酸;这些根据不同的初始衬底命名为谷氨酸途径和鸟氨酸途径。当氮供应足够时，鸟氨酸途径是植物中脯氨酸合成的主要途径，而谷氨酸途径是植物中脯氨酸合成的主要途径[34.］．与旋耕相比，犁耕显著提高了籽粒产量和氮素积累量，这可能与犁耕耕深、保土性好有关。虽然耕作方式不能像旋耕方式那样呈现土壤破碎化，但较大的耕作深度可以减少地表径流造成的养分流失。因此，在本研究中，我们观察到的较高的OAT活性可能是由于耕作增加了香稻的总氮积累，最终导致了水稻籽粒中- ap产量的增加。在免耕条件下，PDH和P5CS活性显著增加。这可能是免耕环境对香稻造成的非生物胁迫所致。不耕作时，NT土壤容重增加，肥料损失增加，而较高的土壤容重则使香水稻根系生长困难。在这些胁迫下，香稻中的脯氨酸主要通过谷氨酸途径合成。SOD, POD, POD的活性降低，MDA的产生是氧化应激的重要指标，SOD能使超氧自由基发生歧化酶的作用，而POD和CAT则能清除H₂O₂［21.，35.］．此外，降低的谷物产量和氮积累也表明，与CK和PT条件下的味道条件下的芳香水稻经历了增长和发展。我们的结果同意杜的研究[36.他证明免耕不能为水稻生产提供更好的粮食生产环境。此外，我们的研究结果与Bao的研究结果一致[8研究表明，一定程度的生物胁迫可以促进香稻2-AP的生物合成。

此外，PT和NT提高了土壤有机质含量和微生物数量，能够促进土壤的化学和生物学特性。这一结果可能归因于土壤破碎程度较低[37.］．

与对照相比，PT提高了香稻籽粒产量和氮素积累量，提高了OAT活性，导致2-AP浓度增加。免耕还通过提高PDH和P5CS活性提高了籽粒2-AP含量，但限制了香稻产量和氮素积累。此外，由于PT和NT治疗，有机物质含量和土壤微生物量也增加。

植物材料和生长条件

一种香稻的种子Meixiangzhan-2’是华南地区栽培广泛的香稻品种，采自中国广州华南农业大学农学院。播种前，种子在室温下浸泡12 h。然后用直接播种机按25 × 15 cm间距进行山播，每山播3-5粒种子。2018年3月至11月，在中国增城华南农业大学农学院试验农场(23°13′N, 113°81′E，平均海平面11 m)进行了两个季节性田间试验。在两个季节中，播种前2天对农田进行积水处理，并将积水排干。分别于2018年3月20日和7月21日在水坑土壤中播种预发芽的水稻种子。试验田受到水稻种植多年,和土壤组成的砂质壤土12.27 g / kg有机质、总氮0.61克/公斤,53.07毫克/公斤可用氮、总磷0.28克/公斤,10.40毫克/公斤磷可用,15.63克/公斤总钾,钾和78.38毫克/公斤,土壤pH值为5.06。该地区属于亚热带季风型气候，实验期间的温度如图所示。6．

治疗方法描述

每次移栽前均采用两种耕作方式(以旋耕为对照)，具体如下:

• CK(旋耕):播种前，两季均用旋耕机(耕深14 cm)翻两次地。

• PT(犁耕):播种前，两季均用犁耕中耕机(耕作深度26厘米)进行两次犁耕。

• NT（无耕作）：在播种之前，土地上没有任何耕作。

采用随机完全区组设计(RCBD)，每年3个重复，净地块大小为60 m²．犁式耕耘机为三铧犁(中国1 L-435)和旋耕机(1GKN-200)。

施肥和取样

专用生物有机肥（Dao Feng Xiang），由中国广州华源农业有限公司制造（由N + P组成₂O₅+ K₂O≥74%，活性菌≥2000万g−1，有机质≥10%)，施量为900 kg ha−1，基础施量60%，耕作时施量40%。抽穗期结束后15天，从水稻植株中收集并分离鲜粒，用双蒸馏水洗涤，在−80℃下保存，用于生理生化分析。

籽粒2-AP含量测定

大约0.5 g的新鲜谷物在5 mL 60%乙醇中均质，并在振荡仪(HZS-H，中国)中以每分钟200次振荡的频率处理4 h。醚提取物在硫酸钠上干燥，过滤(0.22 μm滤纸，日本岛泽)，然后直接使用GCMS-QP 2010 Plus(气相色谱-质谱联用仪)测定2-AP浓度。13.]， 2-AP含量以μg kg表示^{- 1}．GCMSQP 2010 Plus的工作条件如下:气相色谱仪配备Restek Rxi-5 ms(日本岛津)石英毛细管柱(30 m × 0.32 mm × 0。25μm)。测量结果重复三次并取平均值。

籽粒脯氨酸、吡咯啉-5-羧酸(P5C)和1-吡咯啉含量测定

籽粒脯氨酸浓度按Bates [14.用茚三酮;在520 nm处读取吸光度，以ug g-1叶片鲜重(FW)表达。GABA含量的测定方法参照Zhao [15.］．吴（Wu等人2009）的方法估计p5c浓度。该混合物含有0.2ml酶萃取上清液，0.5mL 10％三氯乙酸（TCA）和0.2mL 40mM 2-氨基苯甲醛。反应后，在440nm读取吸光度，含量表示为μmolg^{- 1}．籽粒1-吡咯啉含量由Hill [16.］．在室温下30 min后，测定了最初含有1,4-二氨基丁烷的反应混合物中1-吡咯啉的含量。测量结果重复三次并取平均值。

脯氨酸脱氢酶(PDH)活性测定△谷物中的1-吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸氨基转移酶(OAT)

PDH活性测定采用Ncube [17.］．在440nm处读取反应后的吸光度，用摩尔消光系数计算活性。P5CS的活性根据Zhang描述的方法估算[18.］．反应混合物包括50 mM Tris-HCl缓冲液，20.0 mM MgCl₂、50 mM谷氨酸钠、10 mM ATP、100 mM羟肟酸- hcl和0.5 mL酶提取物。OAT活性按Chen的方法测定[19.］．在440 nm处读取上清部分的吸光度，通过消光系数2.68 mM-1 cm-1计算活性。DAO活性测定采用Su描述的方法[20.］．反应溶液（2.9mL）含有2.0ml 70mmol L.^{- 1}磷酸钠缓冲液(pH 6.5)、酶粗提物0.5 mL、辣根过氧化物酶(250 U mL-1) 0.1 mL、4-氨基安替比林/N, N-二甲基苯胺0.2 mL，活性以“U /毫克蛋白”表示。测量结果重复三次并取平均值。

丙二醛(MDA)和抗氧化反应的估计

采用Luo等方法检测MDA含量及过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性[21.］．丙二醛与硫代巴比妥酸反应后，分别在532,600和450 nm处读取吸光度。计算反应液中丙二醛含量:丙二醛含量(μmol/L) = 6.45(OD值)₅₃₂−OD₆₀₀)−0.56 od₄₅₀，最终以μmol/g FW表达。在含酶提物(50 μl)、1 ml 0.3% H的溶液中测定POD (EC 1.11.1.7)活性₂O₂、0.95 ml 0.2%愈创木酚和1 ml 50 mM·l^{- 1}磷酸钠缓冲液(SPB, pH 7.0)。愈创木酚氧化使酶活性的吸光度增加0.01 (U/g FW)。用硝基蓝四唑(NBT)测定SOD (EC 1.15.1.1)活性。简单地说，在含有SPB (pH 7.8) 1.75 ml、130 mM蛋氨酸缓冲液0.3 ml、750 μmol·L 0.3 ml的反应混合物中加入0.05 ml酶提取物^{- 1}NBT缓冲液，0.3 ml of 100 μmol·L^{- 1}乙二胺四乙酸(EDTA)-2Na缓冲液和0.3 ml的20 μmol·L^{- 1}核黄素。反应结束后，在560nm处记录吸光度。一个单位的SOD活性等于产生50%抑制显色反应所需的提取物体积。在含有1 ml 0.3% H的反应液中加入50 μl的酶提取物，测定CAT (EC 1.11.1.6)活性₂O₂1.95 ml SPB，在240 nm处读取吸光度。以吸光度降低0.01 (U/g FW)为CAT酶活性单位。测量结果重复三次并取平均值。

产量和氮气积累的估计

成熟期，在5个取样区(2.25 m)采集稻谷²）在每个绘图中，然后通过机器撕裂。将收获的晶粒晒干并称重以确定籽粒产率。然后将植物的十个代表性山丘分开采样并分成叶片，茎缠绕，茎和晶粒。将样品在80℃（至恒重）下烘箱，称重，研磨和储存，直至分析总氮浓度，根据PAN计算[22.］．

估计土壤有机质与土壤微生物群落数量

采用5点采样方法在晚期的5点采样方法测定土壤有机物质和微生物的土壤样品。使用Camberdella和Elliott描述的方法分离土壤有机物质的光级分（LF）和重级分（HF）[23.］．简而言之，用30ml NaI溶液均化10g风干土壤（重力1.8克厘米^{- 3.})，在100ml离心管中，在往复振动筛上以200转/分的转速振荡60分钟，然后在1000×g离心15分钟。将离心后的浮料倒入带有0.45 μ M尼龙膜的真空过滤装置中，用0.01 M碳酸钙对膜保留的物料进行洗涤₂和蒸馏水。该过程重复三次。将离心管中剩余的HF用乙醇洗涤三次以除去多余的Nai，然后用蒸馏水洗涤两次。接下来，将LF和HF在60℃下干燥48小时，然后称重并研磨以通过0.15mm筛的有机测定。通过湿氧化方法用K的LF和HF中的有机物。₂Cr₂O₇在170-180°C [24.］．采用稀释平板法对土壤中细菌、真菌、放线菌等主要微生物进行分离计数[25.］．

统计分析

使用方差程序的标准分析进行分析实验数据（SAS Institute，2003）。使用StatiSix 8版本8（分析软件，塔拉哈西，佛罗里达州，美国）使用相关分析来评估索引之间的关系。基于0.05概率水平的最低差异试验（LSD）进行比较治疗中的手段。

不适用。

2-AP:

2-acetyl-1-pyrroline

猫:

过氧化氢酶

MDA：

丙二醛

燕麦:

鸟氨酸转氨酶

P5C:

Pyrroline-5-carboxylic酸

P5CS:

△1-pyrroline-5-carboxylic酸合成酶

PDH:

脯氨酸脱氢酶

荚：

过氧化物酶

草皮：

超氧化物歧化酶

不适用。

本研究由国家重点研发计划项目(no . 2016YFD0700301)资助。

作者指出

1. 杜潘、罗浩文、何静对这一作品的贡献是相同的。

从属关系

1. 华南农业大学工学院，广州，510642

   杜攀，何静，毛婷，胡连

2. 广州南部农业机械与设备教育部重点实验室，中华人民共和国510642

   杜攀，何静，毛婷，胡连

3. 华南农业大学农学院，广州，510642

   罗浩文，杜斌

贡献

LH、PD、HL策划设计研究;JH、PD、HL和BD进行实验;HL写了第一版手稿。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到连胡．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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