综合分析ZFP.棉花植物激素反应期间表达谱的基因家族及表征

背景

锌指蛋白(ZFPs)仅包含一个锌指结构域，在植物的生长发育调控以及生物和非生物胁迫响应中发挥着重要作用。迄今为止，其进化历史和功能ZFP.基因家族尚未以棉花鉴定。

结果

在本文中，我们鉴定了29ZFP.基因gossypium hirsutum．将该基因家族分为七种亚属，其中22个分布在17个染色体上。生物信息分析显示20GHZFP.起源于全基因组重复的基因，源于分散的重复事件，表明全基因组重复是膨胀中的主要力量GHZFP.基因家族。最多ghzfp8.除了亚家族基因ghzfp8-3，在纤维细胞生长过程中高表达，并在体外被油菜素类固醇诱导。此外，我们发现大量的GHZFP.基因启动子区含有赤霉素敏感元件、生长素敏感元件和E-box元件。外源性应用这些激素显著刺激了这些基因的表达。

结论

我们的研究结果揭示了这一点ghzfp8.基因参与棉纤维发育，广泛诱导，胃蛋白，吉布林蛋白和BR，为植物激素刺激的潜在作用的潜在作用提供了鉴定的基础，以及将来繁殖更好的棉花品种的基础。

棉花是全球最重要的作物之一，适用于工业纤维和油籽生产。棉花纤维，纺织业的主要资源，每年为全球经济贡献超过13亿美元，在农业或工业部门创造了330万件工作[1］．gossypium hirsutum（G. Hirsutum），最常见的纤维和石油棉花种类，占全球棉花生产的90％以上[2］．棉花由属于代号和四倍体物种组成Gossypium.属。G. Hirsutum是一种Aadd Allotetroploid物种，其从类似于A-基因组二倍体的演变Gossypium Arboreum.d -基因组类似二倍体Gossypium raimondii，大约1-2百万年前（Mya）[2］．

以前的研究表明，植物激素在纤维开发过程中发挥着关键作用。例如，据报道，吉布伦酸的内源性水平（GA_3.）与中等和短纤维品种相比，长时间的棉花品种较高[3.］．GA的外源性应用_3.改善纤维伸长率，增加纤维细胞壁厚度并增加各个纤维的重量[3.那4.］．体外胚珠培养测定显示，芸苔类固醇（BR）显着促进纤维伸长率，而其生物合成抑制剂铜甲唑（BRZ）废除纤维伸长率[5.］．用BR和BRZ治疗分别增加并降低了细胞壁相关基因的表达。此外，在纤维引发和伸长阶段期间，参与Br生物合成途径的基因是上调[6.那7.］．外源性吲哚-3-乙酸（IAA）的应用显着增加了总纤维体积[8.]，而IAA传输抑制剂，1-萘酞酸（NPA）的应用，显着降低了IAA含量和纤维细胞的数量[9.］．IAA生物合成基因的过度表达IAAM.显著提高纤维细胞数、最终产量和综合品质[9.］．

锌指蛋白（ZFPs）在多种生物过程中起着关键作用，根据其结构差异可分为23个亚家族，包括A20、AN、Bbox、CDGSH、CHY、DHHC、Dof、FYVE、GATA、LYAR、MSRING、NFX1、PADPP、PHD、RBPO、Ring、TAZ、TDDP、TFIIB、Ubox、UBR、WRKY和ZK[10.那11.那12.］．虽然植物丰富了植物丰富，但只有少数含有单锌手指结构域的ZFP，已经表征在植物高度调节中的作用[13.那14.]，植物发展[15.]次生细胞壁增厚[16.，花药发展[17.]，根籍发展[18.]，花开发[19.]，种子萌发[20.]和果实成熟[21.］．

ZFP.已发现基因参与各种生物过程，包括信号转导，转录调节，RNA结合和形态发生，以及应激反应[22.那23.那24.］．在拟南芥，ZFP蛋白已被定向为9组：C2H2，C8，C6，C3HC4，C2HC，C 2 HC5，C4，C3H和C4HC3 [25.］．ATZFP1，在萌发后3天，在顶端分生组织、维管系统和幼苗中均有高表达。的ZFP1.突变体具有叶萌发中的显性表型[26.］．ZFP6.编码C2H2锌手指蛋白，其参与通过整合甘油酸和细胞蛋白信号传导来调节毛状体发育[27.］．ZFP5，下游的基因ZFP6.信令，编码细胞对细胞移动mRNA，用于调节培养体的发展所必需的[27.］．ZFP10，发现靶向特定序列的DNA结合转录因子，参与锌离子和核酸结合[28.］．过度表达ZFP11导致死亡率和变形表型拟南芥[29.］．

在这项研究中，我们确定了29份GHZFP.基因G. Hirsutum并表现了它们的进化关系，染色体分布，基因重复和基因结构，以获得洞察的作用ghzfps.在棉花。基因表达模式表明ghzfp8.除了亚家族基因ghzfp8-3，在纤维细胞发育期间显着表达。BR的外源应用增强了这些基因的转录水平。此外，我们发现大量的GHZFP.基因含有启动子区域中的甘油酸酸响应元件（GARE），助体响应元件（AUXRE）或E-BOX元件。我们的结果表明大多数GHZFP.在其启动子中含有这些元素的基因分别通过外源施用甘油酸，生长素和BR显着上调。

植物材料和生长条件

gossypium hirsutum(徐州142)是在一个气候控制的温室中生长的，光照周期16小时，暗周期8小时，温度30℃。30.］．对于植物激素治疗实验，每次治疗中总共使用30个胚珠，对每个实验进行三份生物三份酸盐。

序列检索，多序列对准和系统发育分析

棉花基因组序列是从织特门网站获得的（https://www.ctongen.org.)．的拟南芥基因组序列从TAIR 10下载（http://www.arabidopsis.org.)．具有默认参数的HMMER软件用于搜索使用保守的ZFP域作为查询的相应蛋白质序列。我们使用BLAST程序进一步识别基于同源性的ZFP序列。使用Clustal X执行所有识别的ZFP的多个序列对准[31.］．使用邻近参数的邻接算法构建推导的氨基酸序列的系统发育树，在Mega 6.0中的默认参数和1000个引导程序复制（https://www.megasoftware.net.)．

染色体定位、基因结构及保守基序分析

位置信息GHZFP.从烤织根网站下载的解析的一般特征格式（GFF）文件中获取。用于外显子内部结构分析GHZFP.基因，编码序列用于与其基因组DNA序列对准，并且使用在线基因结构显示服务器（GSD）程序（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)．使用在线工具包来研究GHzFP蛋白的保守术语，用于主题诱导的多个期望最大化（MEME 3.0.3;http://meme-suite.org/)．MEME的优化参数采用如下：重复次数，任何;最大图案数，50;以及每个基序的最佳宽度，6至300个残基之间，并仅保留与之相关的基序E.值- 5．鉴定的蛋白质基序通过Scanperite进一步注释（http://prosite.expasy.org/scanprosite/)．

RNA提取和定量RT-PCR（QRT-PCR）分析

将每种指定时间的植物激素治疗后收获的棉胚在液氮中被冷冻，然后使用前述方法用研钵和研杵研磨成细粉末[1］．根据制造商的说明，使用purelink™RNA mini试剂盒（Invitrogen，Lot No.1687455）提取总RNA，并且CDNA从1.2μg总RNA逆转录[32.］．在QRT-PCR实验中，每个基因在三种生物学复制中运行，并使用反应参数的三种技术复制如下：95℃，10分钟，其次为95℃的40个循环10 s和56°C s. A melting curve was generated from 65 to 95 °C. CottonGhubq7.（Genbank No。Ay189972）被用作内部控制。用于QRT-PCR分析的引物在附加文件中列出1：表S3。SigMastat软件用于单向统计方差分析。

体外胚珠培养

根据先前公布的方法进行体外胚珠培养物[26.］．在3天后，在开花后1天收集的棉胚（DPA）在10％次氯酸钠中灭菌，并在30℃下在培养基中培养[33.］．五微米1-萘基乙酸（NAA，Sigma），1μmGibberellin酸（GA_3.将Sigma）和5μmBr（sigma）分别加入到所示时间的培养基中。处理后，收集样品用于QRT-PCR实验。

的识别CIS.元素在GHZFP.启动子地区

基因启动子序列的预测GHZFP.从烤织根网站下载（https://www.ctongen.org.)．的CIS.元素在GHZFP.使用网站植物CIS作用调控DNA元素（Place，https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace）[34.］．

范围内识别ZFP.基因家庭Gossypium.

全基因组序列的三种测序棉质（G. Hirsutum那g . arboreum和g . raimondii就）用于鉴定ZFP蛋白质。拟南芥以ZFP蛋白序列作为查询，搜索3个参考基因组，筛选出棉花中的候选ZFP蛋白。利用HMMR软件进一步选择基于保守结构域的ZFP候选基因，我们鉴定了29个ZFPG. Hirsutum，以及23 ing . arboreum和23日g . raimondii就. 在发现的29种GhZFP蛋白中G. Hirsutum基因组，13个成员源自亚基因组和来自DT子基因组的16个（附加文件1：表S1）。GHzFP蛋白的长度范围为170（GHzFP10-9）至295（GHzFP10-1）氨基酸（AA），平均长度为238AA。GAZFP蛋白质从165（GAZFP11-3）到295（GAZFP10-1）氨基酸，平均长度为226AA。GRZFP蛋白质的范围为116（GRZFP4-1）至490（GRZFP10-1）氨基酸，平均长度为272AA。物理化学参数分析表明，GHzFP蛋白的分子量为21.49（GHzFP8-1）至33.23（GHzFP10-2）KDA，平均值为26.42kDa和GHzFP蛋白的等电点（PL）的范围为5.12（GHZFP4-1）至9.34（ghzfp11-1）平均值为6.90（表1)．

系统发育分析，染色体位置和基因重复ZFP.基因家族

进一步了解进化历史和系统发育关系的洞察力ZFP.基因家族，构建了一个邻近的系统发育树。我们的结果表明ZFP.家族基因聚为7个亚家族，二倍体和相应的异源四倍体之间的大部分同源基因聚为同一个分支(图1)。1)．系统发育树如图。1），一个类似的棉花组织拟南芥鉴定了ZFP蛋白和两种物种之间的一些局部关系。基于该分析，棉花ZFP蛋白基于与已知的关系命名拟南芥ZFPs。为了验证邻居连接法(NJ)的结果，我们重建了植物的系统发育树ZFP.基因使用最大似然方法并再次发现ZFP.基因被分为七个亚科（附加文件）2：图S1），类似于使用邻居加入（NJ）方法获得的结果。

相比拟南芥， 二GAZFP8和八个GAZFP10基因被发现g . arboreum，还有两个grzfp8.和九个GRZFP10基因g . raimondii就．此外，四TCZFP8基因和两个TCZFP10基因被发现T. Cacao.（附加文件3.：图S2）。为了验证ZFP的进化关系，我们介绍了ZFP蛋白o.苜蓿和g·马克斯．如附加文件所示4.：图S3，ZFP蛋白也被聚集成七个亚属，与我们之前的结果一致（附加文件4.：图S3）。基因数的比较ZFP8.和ZFP10基因三Gossypium.物种和拟南芥表明这些基因亚家族的扩展可能发生在Gossypium.从共同的祖先分歧后拟南芥和Gossypium.．

确定染色体位置GHZFP.基因G. Hirsutum，物理分布GHZFP.沿染色体的基因是使用从烤织根网站下载的位置信息文件进行。在29中GHZFP.基因，沉积在17个染色体上的22个基因，包括来自亚基因组的九个染色体和来自DT子组的八个（图。2)．大多数染色体只有一个GHZFP.除了AT_04和AT_09染色体外，基因。之间Gazfp.和GRZFP.基因，23名成员g . arboreum分布在10个染色体和17个成员上G. Rainomdii.分布在九条染色体上（附加文件5.:图S4)。

我们进一步调查了可能GHZFP.由全基因组重复（WGD）产生的基因。其中GHZFP.基因，25来自WGD和4来自分散的重复事件（附加文件1：表S2），表明WGD事件在经济扩张中发挥了重要作用GHZFP.基因。另外，为了调查进化史GHZFP.基因，KaKsèu计算器2.0程序被用来计算同义和非同义替代率。Ks比率GHZFP.基因对范围为0.016至0.555。重复事件的近似时间ghzfps.从53万年前(MYA)到18.5万年前(Table2)．

GhZFP蛋白的基因结构及保守基序

旨在提高GHZFP蛋白不同成员之间的相似性和多样性的目的，我们用推导的GHzFP氨基酸序列产生了一个大型的系统发育树（图。3.a）并对外显子性结构进行比较分析。我们发现基因长度GHZFP.相对节省了ghzfp8-4拥有最长（1.2 kB）和ghzfp10-9具有最短（0.6kb）基因组序列（图。3.b） 是的。29人中有27人GHZFP.基因没有内含子，除了ghzfp8-4和ghzfp10-4，其中包含一个内含子。这些结果与结构非常相似ZFP.基因杨树trichocarpa[35.］．最多ghzfps.在相同的亚类中，内含子和外显子的数量和长度表现出相似的基因结构，这与系统发育树中的亚科一致（图。3.一种）。

此外，我们还对GhZFP蛋白的保守基序进行了研究，以了解GhZFP蛋白基序组成的多样性。在GhZFP蛋白中共鉴定出3个保守基序，命名为motif 1 ~ motif 3。每个GhZFP中保守基序的数量从2个到3个不等，同一亚科内的大多数GhZFP具有相似的基序组成(图1)。3.C）。此外，大多数GHZFP蛋白都具有三个保守的主题，除了GHzFP1，GHZFP2，GHZFP3，GHZFP4和GHZFP8亚属植物，其含有两个保守的主题，表明GHZFP蛋白显示出功能性分歧。

ghzfp8.在纤维细胞发育期间亚家族基因高度表达

确定哪个GHZFP.基因可能在纤维细胞发育中起作用，使用来自纤维细胞的不同发育阶段的转录组数据研究单个基因的表达谱，包括0,3,10和15dPa的纤维。

我们发现大部分GHZFP.来自同一亚家族共同的基因相似的表达模式。值得注意的是，所有成员ghzfp8.亚家族，除了ghzfp8-3，在纤维细胞起始和伸长发育过程中高表达(图。4.（一）那表明这些基因可参与棉纤维细胞发育。我们在转录起始密码子（ATG）上游的2000bp序列提取为启动子区域。在分析启动子区域时ghzfp8.基因，发现了大量的电子盒元素（Canntg，其中n可以是任何核苷酸）ghzfp8.启动子区域(图4.b）。E-Box元件可以通过BES1识别，BR信号通路中的核心转录因子[36.］．

三ghzfp8.基因，ghzfp8.1,ghzfp8.-2和ghzfp8.-4，在其启动子区域中包含至少四个E-Box元素，而ghzfp8-3只有一个电子箱(图。4.b）。这些结果表明表达了ghzfp8.基因可以由Br诱导。为了进一步证实这一点，我们进行了QRT-PCR实验以评估转录水平ghzfp8.在体外有或没有BR处理的基因（图。4.C）。我们的结果表明，成绩单ghzfp8.1,ghzfp8.-2和ghzfp8.在BR施用24小时后显着诱导-4（图。4.C）。但是，BR没有诱导ghzfp8.-3转录物即使用BR处理胚珠48小时。这些结果意味着ghzfp8.可能需要棉纤维细胞发育。

基因表达分析GHZFP.基因响应植物激素治疗

植物激素在植物开发中发挥关键作用。相当大的证据表明棉纤维细胞发育需要甘草酸，养羊酸和BR [34.那37.那38.那39.］．为了探索之间的关系GHZFP.基因和赤霉素，我们分析了CIS.元素在GHZFP.推动者区域。在内部发现了大量的GARE元素（CCTTTG或CCTTTG或TATCCCA或AAACAGA或TCTGTTG）GHZFP.启动子区域(图5.)．特别是19中的19个GHZFP.基因具有至少一种可达元素。这些结果强烈表明表达了GHZFP.基因可以通过甲虫酸调节。确认此发现，表达分析GHZFP.用吉布林素治疗后进行基因。我们的结果表明，共15岁GHZFP.基因对胃肠杆菌蛋白处理响应（图。5.)，除了GhZFP2-1那GHZFP7-1那ghzfp10-7和ghzfp11-1基因。

尚已知蟾蜍在促进棉纤维细胞发育方面发挥重要作用。生长素生物合成基因的过度表达IAAM.显着增加的纤维细胞启动[38.］．然后我们确定了GHZFP.对生长素敏感的基因。为此，我们使用类似的方法来鉴定对赤霉酸敏感的基因。生长素响应因子(Auxin response factors, ARF)是生长素信号通路中的关键成分，它能特异性识别并结合生长素响应元件(AuxRE, TGTCTC)来调控下游的生长素响应基因[40］．我们的数据显示总共有10个GHZFP.发现基因在其启动子区域中含有奥氧元素（图。6.一种）。QRT-PCR分析表明，转录水平为七GHZFP.在施用5μMNAA，助长素类似物，24小时后，基因显着增加（图。6.b).这些结果表明，生长素可能促进GHZFP.基因。

BR还参与BR体外促进纤维细胞伸长率的纤维生长和外源应用[33.那37.］．E-box元件被BES1转录因子特异性识别，该转录因子在br调控的基因表达中起关键作用[36.］．我们分析了电子箱元素的分布GHZFP.启动子区域并测定转录水平GHZFP.有或没有BR治疗的基因。令人惊讶的是，25分中，29分GHZFP.基因包含在其启动子地区的电子箱元素（附加文件6.：图S5），表示GHZFP.转录物可以由Br诱导。在大多数的大大刺激的转录水平中发现了进一步的证据GHZFP.当它们用5μmCr处理时，在其启动子区域中具有电子箱元件的基因（图。7.)．

一起服用，转录GHZFP.基因广泛被甘油酸，生长素和血管诱导，表明这些基因在棉开发的植物激素调节中起重要作用。

ZFP基因家族是世界上最大的基因家族之一，其成员在植物生长发育中具有广泛的功能[41.那42.］．在拟南芥，有211个锌手指蛋白质，其构成植物中最丰富的推定转录调节因素[42.］．其中，只有10个成员只包含一个锌指域，它们被命名为ZFP蛋白。ZFP.已经研究过家庭基因拟南芥，米饭和矮牵牛[42.那43.那44.］．然而ZFP.基因家族尚未调查G. Hirsutum．在这项研究中，我们确定了29份GHZFP.基因G. Hirsutum，包括来自亚基因组的13个基因和来自DT亚基因组的16个基因（附加文件1：表S1）。特别是，23ZFP.基因被发现g . arboreum和g . raimondii就，每次，表明在此处发生了基因损失事件ZFP.多倍化后的基因家族G. Hirsutum，这也证实了前人的研究，在异源四倍体棉花中发生了大量的基因丢失事件[45.那46.］．

基因复制事件涉及基因扩张和基因组重新调整[47.］．基因复制有助于基因的功能创新和扩展，特别是植物中的转录因子基因家族[35.］．调查起源ZFP.基因G. Hirsutum，我们沿染色体和基因复制事件分析了它们的分布。在29中GHZFP.基因，22个成员位于17染色体上（图。2)．外显子内组织或基因的基因组结构在基因家族和基因剪接的演变中起着重要作用[48.］．我们的结果表明，所有的GHZFP.基因只有一个外显子，除了ghzfp8-4和ghzfp10-4，其中分别在两个外显子之间有一个内含子（图。3.)．这可能是由于CDNA分子与其基因组拷贝和水平转移重组，发现导致基因组内的内含子丧失[49.那50.那51.］．在杨树trichocarpa，大多数C 2 H 2-ZF组I基因没有内含子[35.]，与外显子系统安排一致G. Hirsutum．

更好地了解的角色GHZFP.基因G. Hirsutum，我们对棉纤维细胞的几种发育阶段进行了基因表达模式进行了系统分析。转录组数据用于分析表达水平GHZFP.基因。有趣的是，最重要的是ghzfp8.在纤维细胞中显着表达亚家族基因（图。4.A，强烈建议参与ghzfp8.纤维发育中的基因。我们也表演了CIS.- 对预测ghzfp8.推动者地区探索的机制ghzfp8.调节纤维的增长。我们在ghzfp8.推动者区域。据报道，由于BES1是BR反应途径的一部分，这一发现表明转录ghzfp8.基因可以由BR激活。植物激素，BR，在调节纤维发展方面发挥着重要作用[33.那52.］．我们的研究结果表明BR可以诱导ghzfp8.表达调节纤维发育。

蟾蜍素，赤霉酸和BR在光纤发展中起重要作用[33.那37.那38.那39.］．为了探索两者之间的联系GHZFP.详细研究了这些基因和激素的转录表达水平GHZFP.基因治疗前后的个别激素。在分析所有基因的启动子区域时GHZFP.发现基因，其中19个拥有可达元素。GA的外源性应用_3.显着诱导最多的转录GHZFP.在其启动子地区的GARE元素的基因（图。5.)．NAA，助潮剂类似物的应用导致七种基因的显着转录上调，其含有其启动子中的奥氧元素（图。6.)．在29中GHZFP.基因，25个成员含有其启动子区域的E型盒元件，其中大部分在用Br处理5天后对其进行上调（图。7.)．我们的研究结果表明GHZFP.生长素、赤霉素和BR基因的诱导作用广泛，为进一步鉴定更多可能参与植物激素刺激的下游基因奠定了基础，为今后选育优质棉花品种奠定了基础。

我们的研究提供了全面的分析GHZFP.基因家族。我们透露了这一点ghzfp8.基因参与棉纤维发育。本研究将扩大我们了解的确切作用GHZFP.棉纤维发育中的基因及其适应植物激素刺激。我们的研究结果还将进一步提供未来培育更好的棉花品种的线索。

在本文中分析的棉棉基因组数据可从斯托贡根获得（https://www.ctongen.org.）和A. Thaliana.基因组序列可在Tair 10（http://www.arabidopsis.org.)．

ARF：

一种恒生响应因素

BR：

芸苔类固醇

DPA：

花后第二天

GFF：

一般特征格式

德牧:

基因结构显示服务器

MARD1:

ABA监管休眠1的调解员

MEME：

主题诱惑的多重期望最大化

mya：

百万年前

RD21A型：

对脱水反应21A

WGD：

全基因组重复

不适用。

国家自然科学基金（批准号31600223）、香港学者计划（批准号XJ2017017）、中国陕西省自然科学基础研究计划（中国陕西青年委托人才计划2018JZ300 6和2019JM491）资助（批准号20190205）。陕西省博士后项目（批准号2018BSHYDZZ76），中央高校基础研究基金（批准号：GK201803041、GK201901004），棉花生物学国家重点实验室开放基金（批准号：CB2018A03、CB2019A09），国家大学生创新创业培养计划（批准号：cx2018143），勤奋研究与创新基金项目（批准号：KY2018YB003）。资助机构为研究项目提供资金支持，但不参与研究设计、数据收集、分析或手稿准备。

隶属关系

1. 陕西师范大学生命科学学院西安，710119

   彭他，Zihua王，易媛，李张，越柱马，加宁宇＆广黄肖

2. 2 .武汉大学高等研究院，湖北武汉430072

   闫阳

3. 中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室，455000

   Chaoyou庞

4. 郑州研究基地，郑州大学棉质生物学国家重点实验室，郑州，450001

   Chaoyou庞

5. 中国西北地区濒危粗药资源开发的国家工程资源和天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学生命科学学院，西安，710119

   彭兆和广黄肖

贡献

GX和PH构思了原始的研究计划，YYANG，ZW和PZ进行了实验，YYUAN，LZ，YM和CP进行了数据分析;GX写了这篇文章，JY和PH修订了手稿。Yyuan将与作者列表中最远的作者对应。所有作者均致力于研究和阅读并批准最终手稿。

通讯作者

通信肖广辉．

道德认可和参与同意

从中国农业科学院棉花研究所收集和分析的所有棉线，都是公开的，可用于非商业目的。本文不包含任何与人类参与者或任何作者执行的动物的研究。

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不适用。

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