了解葡萄葡萄酒覆盖成功下面的分子机制

背景

嫁接是一种密集的商业实践，需要保护欧洲葡萄免受葡萄根瘤蚜的危害。对这种害虫有抗性的砧木是美国葡萄品种的杂种，与欧洲品种有不同程度的相容性葡萄品种。为了了解驱动葡萄藤嫁接相容性的因素，本研究采用转录组学方法寻找嫁接成功的主要调控因子。在嫁接后21天和80天的苗圃嫁接环境中，比较了两个不同亲和水平的接穗/砧木组合。

结果

在最相容的组合中，信号代谢和激素途径的基因表达较早和较高，酚代谢和氧化应激反应的基因表达较低。在移植后80天，在最相容的组合中获得了较高表达的调控血管维持、分化和增殖的转录因子。此外，与不亲和的组合相比，亲和性强的组合中可能靶向与植物发育相关的重要转录因子的microrna表达水平较低。

结论

在此背景下，我们选择了一组调控因子作为可能的表达标记，用于相容性嫁接的早期预测。

嫁接是一种非常古老的方法用于无性系繁殖，以减少年轻和克服许多生物和非生物胁迫。如今，它被广泛应用于果树、蔬菜和花卉生产，因此对农业和经济产生了巨大的影响[1]．在欧洲的葡萄栽培中，由于种虫(一种以葡萄根为食的昆虫)的存在，嫁接几乎是必不可少的葡萄品种领先的葡萄藤到死亡。到目前为止，克服这种害虫的唯一途径一直是在美国或美国杂交抗砧木中移植欧洲品种[2]．由于两个基因上不同的实体放在一起，葡萄嫁接可能会发生不亲和性。接枝不亲和性是指在植物的两个部分之间不能形成一个成功的接枝结合，即在满足技术、时间、植物检疫和环境条件等所有其他要求的情况下，不能形成一个功能良好的复合植物。不亲和性甚至在正常生长多年后仍可能表达，不仅在葡萄中，而且在梨-温柏、杏和梨等其他物种中也存在[3.，4，5]．大多数的不亲和研究是针对亲和和不亲和之间的形态和生理观察[6，7]．接穗和砧木的生活区接触引发了薄壁细胞的增殖，形成了大量未分化的细胞，称为愈伤组织。在新形成层细胞分化为木质部和韧皮部组织之前，这种愈伤组织作为两个植株部分之间的桥梁，使接穗和砧木之间的维管连接成为可能。6，8]．

嫁接不亲和性的早期检测对苗圃和农民具有重要意义，可作为早期选择最佳嫁接组合的工具。许多检测方法已经发展起来，例如体外技术[3.，组织学观察[9，10同工酶分析[11，12]及酚类分析[4，13，14，15]．这些都是重要的方法，但这些物候和代谢标记因嫁接组合、环境和土壤条件的不同而有很大差异，使得嫁接不亲和检测非常困难。直到最近人们才开始研究与接枝有关的分子机制。从广义上讲，Cookson等人[16]研究了葡萄树自体移植物中移植联合的转录谱。它们发现在接枝后3至28天差异表达的基因与细胞壁改性，伤害，激素信号传导和次生代谢相关。在以后的研究中，COOKSON和合作者也将异素移植物（来自不同基因型的砧木和SCION的砧木和SCION）的基因表达谱与自体移植物（来自同一基因型的砧木和中断）进行了比较，并发现了参与应激反应的基因的上调暗示它可能与检测到非自动嫁接伴侣的检测有关[17]．Irisarri等[18]在梨/榅桲的嫁接发育早期，抗氧化基因转录产物在兼容嫁接植株中积累较多，表明与更好地保护受损组织有关。Melnyk等人[19]报告说拟南芥仅在Phl​​oem连接之后形成触动蛋白，并且对于验卸连接的韧皮肽响应因子组起到移植条件下方，例如AxR1和AlF4。有趣的是，变异AXR1在嫁接接合的上部挽救了一个砧木突变体的韧皮部连接AXR1［19]．这些最新的研究结果表明嫁接过程在接穗与砧木的时空通讯中起着重要的作用。Chen et al. 2017分析了荔枝在移植后2 h、4 d和21 d分别进行自体移植和异种移植。结果表明，创伤反应、生长素(IAA)和信号转导通路相关基因的表达可能在其中起关键作用荔枝嫁接愈合过程。最近，生长素的重要作用也被报道柑橘类兼容性研究。［20.尽管最近的研究发现，嫁接的分子机制仍然很不清楚，特别是在木本植物中。

通过研究和了解葡萄结合形成的分子机制，将更接近于开发亲和、少变异、更适合育种的分子标记。在此基础上，我们比较了两个无性系嫁接在砧木Richter110上表现出的不同程度的亲和性。Touriga Nacional是目前葡萄牙用于生产葡萄酒的主要葡萄品种，它以生产最优质的葡萄牙葡萄酒而闻名。Richter 110 (110R)是一种全球广泛使用的砧木，与西拉品种的亲和性不足[21[据报道，与旅游Nacional（TN）具有不同水平的移植物相容性。我们探讨了托儿所嫁接背景下，两个不同的时间点;嫁接后21天，当移出移植物诱导室时，嫁接到田地，嫁接后80天，即在该领域2个月后，已经开发了根系。通过观察差异表达的基因和微rNA（miRNA）在越来越较少的相容的组合之间，我们旨在揭示介导移植物相容性的介导移植物相容性，而且还要找到可用作分子标记的移植联盟形成的主调节因子葡萄树植物成功的早期预测。

嫁接成功率分析

组合TN21 / 110R和TN112 / 110R的移植物兼容性定量移植成功，即用营养周期结束时用良好开发的根和拍摄系统计算接枝的数量，并在营养周期结束时具有良好的联盟。在独立年份进行的三项独立试验显示TN21 / 110R组合比TN112 / 110R更成功（图。1）.结果表明，TN21嫁接成功率(66.5%)高于TN112(52.3%)。

TN21克隆和TN112克隆在110R上移植3年的平均成功率比较表明，TN112克隆在110R上移植3年的平均成功率较高p值为0.169。加上1103-P获得的移植成功比较，p值为0.051。基于此，我们认为两个无性系的嫁接亲和性存在差异，TN21/110R组合亲和性较好，TN112/110R组合亲和性较差。

为了研究这些不同的相容性水平的分子机制，在嫁接后21天和80天采集样本。在21DAG时，很少有未成功的嫁接或无嫁接，在这个时间点的特征是在接穗和砧木接触的区域没有愈伤组织或存在死亡组织。在这个阶段,本身没有不相容,愈伤组织的形成是响应的结果伤口和激素应用于蜡在移植过程(见方法部分),和仍然没有交互的两个血管系统。不亲和性只有在移植物移植到田间后才能检测到。在80DAG时，观察到大多数不成功的移植物，即移植物两部分在移植物界面上未能形成结合(附加文件)1）.

自体嫁接通常被报道是亲和的，因为当一个基因型被嫁接到自己身上时，预期没有不亲和。在第二次和第三次田间试验中，对Touriga Nacional无性系和110R砧木的自体嫁接进行了评价(图。2）.2015年，Touriga Nacional两种自体移植物的移植成功率不同，TN112/TN112的移植成功率为92%，TN21/TN21的移植成功率仅为50%，110R/110R的移植成功率仅为56%。2017年的成功率相对高于2015年，其中TN112/TN112显示，与之前的试验一样，最高的配型率。这些结果导致在转录组学方法中排除了作为相容对照的自体移植物。

两种异种移植物在21DAG位点的基因表达差异

转录组分析揭示了在21dag的更加相容的组合（TN21 / 110R）和较少相容的组合（TN21 / 110R）之间的差异表达基因（DEG）。在表格中1与不太相容的组合(TN112/110R)相比，在21 DAG处有17个转录本上调(更丰富)，在更相容的组合(TN21/110R)中有16个转录本下调。

研究发现，在21DAG位点，“光合作用”、“细胞壁”、“四吡啶合成”、“多胺代谢”、“杂项”、“RNA”、“DNA”和“信号转氨酶”等BIN类别的转录本在更相容的组合(TN21/110R)中表达更多。

从更兼容的组合中表达更多的基因中发现了一个扩展素基因(VIT_01s0026g02620)，它为一种响应生长素信号的蛋白质编码，参与酸性生长中的细胞壁松动和细胞伸长[22];乙烯响应转录因子(VIT_00s0662g00030)， AP2/ERF TF超家族成员，已知是发育过程和各种生物和环境胁迫响应的重要调控因子[23];EP3几丁质酶(VIT_05s0094g00330)。

类别“DNA”包括在更兼容的异质移植物中上调的组蛋白H2A.6（VIT_00S0868G00020），并且该类别“信号传导”含有三个转录物，在TN21 / 110R异质移植物中的两个差异更高表达：一种蛋白激酶，一种乙烯反应因素，ERG-1（VIT_07S0005G00870），具有糖和营养生理中的信号传导的描述。该乙烯响应因子具有日志₂折数变化为5.4，是本次分析中最高的。相比之下，苯丙素的3个酶编码基因:直接参与白藜芦醇合成的2个二苯乙烯合成酶(VIT_16s0100g01100, VIT_16s0100g01200)和1个Orcinol O-methyltransferase1 (VIT_12s0028g01940)，它们在相容性较差的组合(tn111 / 110r)中表达较多。

两个异种移植物在80DAG位点上表达的基因差异

转录组分析显示，80DAG的两个异种移植物之间有63个DEGs。在表格中2，可以看到，在亲和性较强的组合(TN21/110R)中，与亲和性较差的组合相比，DEG有26个上调，37个下调。

更兼容的组合(TN21/110R)显示与细胞过程相关的转录本丰度更高，如“光合作用”、“主要CHO”和“细胞壁”等类别。最后一类包括三种转录本:一种果胶甲基酯酶(VIT_02s0025g04210)，一种udp -葡萄糖4-epimerase (VIT_15s0048g00510)和一种expansin (EXPA15, VIT_01s0026g02620)。

关于较少的相容组合，属于类别“RNA”，“次生代谢”，“次要CHO代谢”和“杂项”的含量在不太相容的组合（TN112 / 110R）中，发现更加表达。类别“RNA”包括三种TFS，NAC（VIT_15S0048G02270）和两个WRKYS，WRKKY18（VIT_04S0008G05760）和WRKY70（VIT_08S0058G01390）以及RNA依赖性RNA聚合酶1（RDR1，VIT_01S0011G05880）和DNA甲基转移酶（VIT_12S0034G02560）．Wrky TFS在铜鳞类化合物介导的PAMP（病原体相关分子模式） - 触发的免疫（PTI）信号传导中发挥双重作用[24]．在“二次新陈代谢”类别中，在不太兼容的组合（TN112 / 110R）中也更表达两个芪合成酶（VIT_16S0100G01190，VIT_16S0100G00780）。白藜芦醇合成酶（VIT_16S0100G01110）也以不太兼容的组合表达。斯蒂替斯合成酶是白藜芦醇的前体，它与过敏反应的启动有关葡萄属，并与程序性细胞死亡(PCD)有关[25]．

在“杂项”类别中发现了两个不太兼容的花生四烯酸诱导的DEA1转录本(VIT_12s0055g00800和VIT_02s0154g00280)。此外，在不太亲和性的组合中，发现编码抗氧化蛋白的转录本都更丰富，如两个短链脱氢酶SDR (VIT_14s0068g01760, VIT_08s0040g01200)、一个谷胱甘肽s -转移酶(VIT_08s0040g01200)、一个过氧化物酶(VIT_18s0001g06850)和两个脂质转移蛋白(VIT_02s0154g00280, VIT_02s0154g00280)。VIT_12s0055g00800)。

21DAG和80DAG之间的转录组分析

对每个组合的时间点(21DAG至80DAG)也进行转录组分析。在两种异种移植物中，共有697个基因是常见的DE(图。3.)，而在亲和性较好的组合(TN21/110R)中只有DE的有411个DEGs，在亲和性较差的组合(TN112/110R)中只有416个DEGs(图1)。3.一个)。

常见DEG的功能类别从21丰富到80DAG(图。3.b)在“光合作用”、“脂质代谢”、“信号转导受体激酶”、“氨基酸代谢”、“次级代谢”、“胁迫。非生物”亚类上表现出过度表达。“热”、“运输”和“杂项”。gluco, galacto和manosidases”。相反，“RNA”类、“杂类”子类的下调率过高。细胞色素P450”以及“未分配”类别。

分类为“PS”，“微量CHO代谢”，“脂质代谢”，“应激”。在亲和性较差的TN112/110R组合中，“非生物”、“蛋白质”和“转运”的含量从21到80DAG(图)。3.d).在更相容的组合(TN21/110R)中，“细胞壁”、“激素代谢”、“RNA”、“信号”和“细胞”等类别的转录本从21到80DAG中富集下调(图2)。3.c)。

由于这些类别在移植物愈合过程和血管分化中的重要性，这些转录本作为两种组合的热图呈现(图2)。4）.为此，一些由Grimplet等人注释的转录物。［26[属于正在分析的类别，从数据集中救出并添加到由箱分类获得的数据集。该组转录物的聚类，使用具有Kendall的Tau距离测量的平均联系聚类方法，揭示了组合之间的表达时序的差异，其中更多的这些基因在21dag中以更相容的组合在21dag中表达。当按类别和子类别聚类同一组基因（附加文件2)，并查看所有库中的表达式，尽管具有相同的上/下调节配置，但仍有可能看到表达式级别的差异。在更相容组合(TN21/110R)的特定DEG中，生长素和乙烯信号通路的转录本更多地表达在21DAG。在参与生长素信号通路的10个转录本中，有7个转录本在21DAG处表达更丰富，只有3个转录本在80DAG处表达上调。乙烯信号通路也观察到同样的模式，在21DAG有7个转录本更丰富，而在80DAG只有3个转录本上调。相比之下，在兼容性较差的组合(TN112/110R)中，这两种植物激素信号通路的大部分转录本在80DAG表达较高。具体到DEG，在该组合中，生长素信号通路13个转录本中有10个更多表达80DAG，而在4个乙烯信号通路相关转录本中，有3个80DAG表达上调。此外，更多与应激激素脱落酸(ABA)相关的转录本在非亲和性组合中有差异表达，在80DAG非亲和性组合中9个基因中有6个过表达。

两种组合中有21 ~ 80DAG差异表达的TFs共138个，其中57个在两种组合中普遍表达，42个仅在TN21/110R中表达，39个仅在T112/110R中表达。其中一些tf直接参与维管形成层细胞的维持和分化，如VIT_19s0027g01120 (LBD4)、VIT_18s0001g10160 (WOX4)和VIT_18s0001g06430 (ATHB-6) [28，27，29]．

调控生长素和乙烯途径的转录因子在不同时间点之间也存在差异，MYB、WRKY和C2H2锌指转录因子家族成员也存在差异。

血管分化调控中涉及转录因子的差异表达

由于血管组织连接在成功移植中的重要性，我们对已知血管分化调节因子(TFs)的两种组合和两个时间点进行了详细的表达量化(见表)3.）.

这八种TFS的表达，以前在TN21 / 110R和TN112 / 110R中具有显着差异的转录组数据，但它们之间没有显着差异，通过DPCR量化（图。5）.

在MACE-Seq中观察到，这些TFs从21到80DAG整体下调，且相关性良好(r2= 0.68)3.）.

三种转录因子VviLBD4、VviHB6和VviERF3的表达在两种异种移植物中存在显著差异。在21DAG时，只有VviLBD4在更兼容的组合中下调与不兼容的异种移植物之间存在显著差异。在80DAG, VviLBD4在兼容性较强的组合中表达较多，VviHB6和VviERF3也表达较多。这些tf参与形成层活动、生长和分化的维持。这些结果表明，这3种转录因子在亲和性强的组合中表达量从21DAG降低到80DAG，显著低于亲和性差的组合。

转录后调节因子在移植物界面的表达

分析从移植物结合组织提取的总RNA中获得的microRNA文库，根据它们在移植物结合组织中的丰度和它们潜在靶点的预测功能，选择8个mirna进行表达分析(附加文件)4）.在80DAG采集的嫁接带样品中进行qPCR定量，因为80DAG是组合间基因表达差异最大的时间点。结果如图所示。6．

与兼容性较差的组合相比，在兼容性较强的异种移植物中观察到大多数定量mirna的丰度较低。除Vvi-mir482外，所有mirna的表达在异种移植物之间均有显著差异。Vvi-miRNA159和Vvi-miRNA166靶基因参与信号传导和基因表达调控。特别是Vvi-miRNA166靶向并负调控III类同源结构域亮氨酸拉链(HD-ZIP III)转录因子的表达，如REV、PHAB和homeobox 8 like，这些转录因子在血管系统的分化调控中发挥着重要作用[39，40]．Vvi-miRNA159c靶向MYB65和MYB101，已被提出通过减少细胞增殖参与促进PCD和抑制生长[41]．在转录组数据中检查了所有miRNA预测靶点，但发现丰度较低或错误发现率(FDR)高于0.05。

TN21和TN112具有不同程度的接枝相容性

在3年的田间试验中，通过嫁接成功率的变化，观察了环境对表型构建的影响。尽管移植物的成功率存在差异，但在3年的独立研究中，TN21/110R组合比TN112/110R更成功。这些无性系在不同砧木(1103-P)上嫁接的成功率也有相同的趋势。因为嫁接的不亲和性可以定义为两个植株之间未能形成成功的嫁接结合[7，假设在这些条件下，TN21/110R组合比TN112/110R更兼容。

在自动移植物和异质移植物之间进行比较时，COOKSON等人。［17]在嫁接界面上观察到植物防御和胁迫反应相关基因的上调。这些证据使这些作者认为，移植界面上的细胞可以检测到自体或非自体移植伴侣的存在。因此，在我们的研究中，自体移植物最初被认为是一个更兼容的移植物连接的对照。然而，我们的现场试验显示，不同的自体嫁接成功取决于基因型，这意味着即使在自体嫁接植株中，嫁接成功也取决于基因型。只有一个关于自体移植物不亲和性的文献[42但仅用于体外自体移植蚕豆根尖．因此，必须仔细考虑使用自体移植控制，因为自体移植和异质移植机制朝向形成良好的贪污愈合的机制可能是不同的。出于这些原因，我们将自体移植物排除为用于传递结果分析的对照。

这种无性系在自体嫁接或异种嫁接时的不同行为表明嫁接的成功依赖于砧木的行为。此外，在110R和1103-P两种砧木上，TN21的亲和性较好，而TN112的亲和性较差。值得注意的是，这两个砧木都是美国的杂种葡萄? ?x葡萄属rupestris．观察到的不同程度的亲和是否是该杂种特有的还有待解决。

相容性可能与移植物早期信号通路的激活有关

内源激素和其他信号分子在调控接穗和砧木之间的相互作用中起着重要的作用拟南芥［8，43，44]．小道消息，Cookson等人[16]与3和28DAG的嫁接结合形成相关，并且细胞壁合成、次级代谢和信号转导基因上调。在本研究中，与不太相容的组合相比，在最相容的组合中(21DAG)更早地观察到与“信号转导”(激素或通路信号转导)相关的转录本的丰度更高。特别是生长素和乙烯在这两个时间点的作用有待进一步研究。在嫁接早期，较高且较早熟的信号相关转录本的丰度可能被解释为嫁接与砧木之间更大的沟通潜力。这支持了嫁接早期较高的沟通能力可能有助于嫁接成功的假设。

编码氧化应激和伤口愈合蛋白的基因在80dag的不太相容的异质移植物中更具表达

二苯乙烯的生物合成受到许多不同的非生物和生物压力的调节[45]，而伤口则会激活葡萄浆果皮中二苯乙烯的生物合成[46，花生叶[47]和苏格兰松茎[48]．最近，对TN21/110R和TN112/110R组合的酚类抗氧化剂的分析表明，在相容性较好的组合中，酚类抗氧化剂的含量较低[14]．辛酸合酶，白藜芦醇合酶和氧化应激响应蛋白的转录物的较高丰度表明，在整个接枝过程中，较差的异质血血移植物具有更高的氧化环境，妨碍了良好的移植联盟形成。

在80dAG时，较少的相容组合呈现涉及对氧化应激（多胺氧化酶，谷胱甘肽S-转移酶，半乳糖醇合酶和过氧化物酶）和伤口反应的响应中涉及的数量的转录物。相比之下，更兼容的组合具有上调的成绩单，其在光合作用中具有重要作用以及细胞生长，表明在80dag处进行生长和开发过程。

在80DAG，兼容性较差的组合表现出较高的NAC和WRKY转录因子的积累，已知参与了坏死、免疫反应和水杨酸途径的调控[49，50，51]．此外，在这个阶段发现编码ABA生物合成关键酶的转录本在不太相容的组合中更丰富。这可以解释为在不兼容的组合中应激信号的增加。通过观察葡萄异种嫁接茎尖分生组织中VviWRKY18、VviWRKY52和VviWRKY70的显著下调，也表明了WRKY转录因子在嫁接中的重要性[52]．80DAG低亲和性组合中WRKY18和70的高表达可能表明该组合在那个时间点还没有克服嫁接愈合过程。

在不太相容的组合中，80DAG是两个含量最高的deg，是两种花生四烯酸诱导的DEA1。DEA1已被证实与番茄PCD的诱导有关[53]．Cookson等人[16]发现一个DEA1基因从3DAG上调至28DAG，提示这一阶段发生在移植物界面的磷脂信号通路(愈伤组织诱导)。根据Cookson的观察，该转录本在80DAG(嫁接发育后期)较弱的组合中丰度较高，似乎表明在较弱的组合中，信号转导和调控PCD过程出现了不利的延迟。总之，这些发现表明，在80DAG不太相容的组合中，环境压力更大。这可能意味着这种组合在早期无法处理嫁接过程中产生的应力，这可能是导致嫁接失败的原因。图中提出了一个导致相容嫁接的基因表达事件的方案。7．

在80DAG中，参与形成层维持和血管分化的TF的高表达似乎是驱动移植物成功的重要因素

血管组织连接对形成有效的移植物连接的重要性已被不同的作者引用[8，54，55，56，尽管涉及的分子机制和主要调控因子在很大程度上仍是未知的。在本研究中，参与形成层维持的TF VviLBD4在21和80DAG的多亲和性组合和少亲和性组合之间存在差异表达。LBD4是器官边界(LOB)家族的成员，与细胞增殖有关，主要在韧皮部发育中，在调节多序列射线等解剖特征中[28和愈伤组织的维持拟南芥［57]．Cookson等人[16]证实该基因过表达3DAG，表达减少28DAG。他们提出，在移植物发育的第一阶段，该TF的丰度可能与未分化愈伤组织细胞的形成和维持有关;随后(在28DAG)，下调可能与功能性嫁接结合的形成有关[16]．在本研究中，从21至80dag在越来越多的兼容组合之间发生表达水平的反演。与较差的组合相比，在最兼容的组合中，VVILBD4的显着过度表达在80dag中，表明需要维持该基因表达以实现更相容的移植物。

从21到80DAG，乙烯反应因子ERF3丰度在兼容性较强的异种接枝(TN21/110R)中保持不变，而在兼容性较差的异种接枝中则显著下降。ERF家族成员参与生长、发育、生物和非生物应激反应[58，59]．布拉克曼与格雷布[58]建议，ERF转录因子促进PXY和WOX4下游的血管细胞分裂。WOX4是在促进血管基础虫的分化和/或维持方面具有显着作用的保守的TF，显影血管系统的初始细胞[59]．在不太相容的组合中，在这种TF的丰度中随着时间的推移显着降低可能表明在这种组合中维持钩状细胞的产生较高。

HB6 TF属于HD ZIP I系列，负面调节对ABA的反应[60ATHB6也与发育器官的细胞分裂和分化有关[27]．虽然VviHB6在21DAG位点的表达在两个异种移植植株之间没有差异，但在80DAG位点，兼容性较差的组合中较高的表达可能表明对ABA信号的控制较低，从而增加了生长抑制。总而言之，维持这些tf的充分表达似乎是一个兼容的移植物结合的关键。基于文献中所描述的这些TF的表达变异及其功能，图中给出了一种在相容性移植物中调节血管分化的转录调控工作方案。8．Melnyk等进一步支持这些tf在移植物愈合中的作用[61，这四种转录因子通过在拟南芥将移植物与非移植物和非移植物切口进行比较。

在血管分化的转录后调控方面，除Vvi-mir482外，所有被测mirna均在80DAG相容性较差的组合中表达较多。在测试的microrna中，Vvi-mir159和Vvi-mir166靶向血管组织分化相关的tf。Mir159靶向GAMYB TFs，后者在营养组织中抑制MYB33和MYB65。解除这些tf通过减少细胞增殖来抑制生长。最近，这些tf也与营养发育的调节有关[41]．Vvi-miRNA166靶向III类同源结构域亮氨酸拉链(HD-ZIP III)的tf，已知在调控血管组织的分化中起重要作用[39，40]．尽管这些潜在靶标具有调控功能，但在观察80DAG中兼容性较强和较差的组合库中的表达时，在RNAseq数据中未观察到统计学上显著的变化(FDR < 0.05)4）.这在研究的8个microRNAS的所有预测靶标中也都可以观察到。一个可能的解释是非常低丰度的潜在miRNAtargets的表达式58特遣部队在这八小分子核糖核酸的潜在目标更适合组合的中值59.42归一化计算,而不兼容的值为57.57归一化计算(附加文件4）.

我们旨在了解推动葡萄园移植兼容性的驱动器，以便找到贪污联盟的主监管机构。最终目标是使用这些分子作为早期预测移植成功的有用标记。为此，我们将异素移植物与在苗圃环境中的苗圃环境中移植到商业砧木110R的两个克隆中的异质疱疹。在表型，转录和转录后水平。

在愈伤组织形成阶段，亲和性强的组合比亲和性差的组合更早出现代谢和激素途径信号基因的表达，这可能是移植物亲和性的驱动因素。这可以解释为具有更相容的组合，在接穗和砧木之间有更大的沟通潜力。此外，由于较少的氧化应激，更相容的组合显示较少的基因表达的酚代谢和氧化应激反应。

较不相容的组合具有较高的创伤反应和氧化应激相关基因的表达速度和延迟，这表明它不能有效地处理一个合适的相互作用的建立。

80DAG阶段似乎是更适合评估兼容性的阶段。事实上，高表达的与形成层维持和维管组织分化和增殖相关的转录后调控，以及低水平的转录后调控也参与了相同的过程，清楚地表明了更相容的组合。在此背景下，VviLBD4、VviERF3、VviHB6和Vvi-mir159、160和166在80DAG位点可以作为相容嫁接的表达标记。

植物材料

结果表明:葡萄牙国家Touriga (TN)的两个登记无性系PORVID的21个ISA-PT (TN21)和JBP/Plansel的112个JBP- pt (TN112)https://www.vinetowinecircle.com/castas_post/touriga-nacional/)，嫁接在砧木110R (110 Richter -诉? ?x诉ruprestis）在砧木1103-p（1103 paulsen -诉? ?x诉rupestris）.这些移植物产生了TN21/110R、TN112/110R、TN21/1103-P和TN112/1103-P异体移植物。采用TN21、TN112和110R的自体移植物，得到TN21/TN21、TN112/TN112和110R/110R。

所有嫁接和大田试验均在位于葡萄牙Montemor-o-Novo的Plansel苗圃进行(北纬38°39′，西经8°13′)。2012年试验,300万亿年异种移植于110年建立了r根茎收集样本的基因表达分析和评估移植成功率的两个克隆TN。评价异种移植的移植成功率在不同年份和添加上述提到自体控制,该试验在2015年和2017年进行了200例移植。此外，为了确定TN无性系在不同砧木上的行为，在2017年的试验中，还进行了100个TN无性系与1103-P砧木之间的嫁接。

嫁接程序

所有的嫁接程序均在Plansel苗圃执行，通常为商业目的而执行。简单地说，在冬季采集上述植物材料的硬木插枝，在4°C保存至嫁接。接枝前，接穗作单芽插枝，根茎作35厘米插枝，节节脱落。采用omega嫁接技术对接穗和砧木进行了原位嫁接。嫁接体在75-80℃条件下，用8-喹啉醇(0.11%)和2,5-二氯苯甲酸(0.004%)浸渍石蜡，放入含有泥炭的盒子中，转移到30℃左右、80-90%湿度的室中诱导愈伤组织。21DAG组合后转移到田间。每个嫁接组合在两个不同的时间点收获三组三株(9个重复)，21DAG转移到田间，80DAG在田间条件下。只有枯死的植物被排除在水池之外。这些水池是使用随机但活的植物，即不同发展水平的植物。样品保存在−80°C冰箱中直至使用。 From all plants harvested, a longitudinal cut with approximately 1 cm length was made at the graft zone. After removing the bark and the cortex, the remaining tissues (xylem, phloem, and cambium) were scratched and ground in a mortar with liquid nitrogen until a thin powder was obtained and stored at − 80 °C until RNA extraction.

RNA提取和纯化

总RNA的提取采用Chang等人描述的一种适应性方法[62在沉淀步骤中使用0.1体积NaOAc (3 M, pH 5.2)和两体积乙醇，以增加microrna的沉淀。对每一株植物进行独立的RNA提取。

通过测量260/280和260/230的吸光度，通过测量260/280和260/230的吸光度和2％琼脂糖凝胶（0.5x Tbe，Syber Safe，Invitrogen），使用纳米玻璃分光光度计Nd-2000c（Thermo Scientific）验证总RNA浓度和纯度。根据制造商的说明，用涡轮DNA-FALE™套件（AMBION，Life Technologies，Ltd。）处理所有样品。通过PCR筛选除去基因组DNA的去除，使用基因VIT_18S0001G10160（前ataacctcaccacccaccaATC和反向CTCCAAGATCCCAATCTGTCGTC）的引物。PCR混合物（最终体积为20μL）包括：300ng总RNA;3 pmol每个底漆;1x PCR缓冲液（5倍GotaQ®反应缓冲液）;2.5毫米MgCl₂， 2.5 mM dNTPs混合物;和0.5 U GoTaq®DNA聚合酶。扩增条件如下:在94°C初始变性步骤2 min，随后在94°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 2 min, 30个循环，最终在72°C延伸2 min。扩增的基因产物在1%琼脂糖凝胶(0.5 × TBE, Syber安全，Invitrogen)上电泳后可见。在每个实验条件下，从9个独立的提取液中，3个样本的总RNA被以相同的数量汇集，从而有3个汇集的生物复制。

mRNA测序和表达谱分析

在取样的两个时间点，从异质移植物中提取的总RNA的池在生物三份中，通过Genxpro GmbH（法兰克福主要，德国）的3'-cDNA末端（MACE）大规模分析进行深度测序。获得12种不同的文库，每个实验，TN21 / 110R_21DAG进行三种生物重复;tn21 / 110r_80dag;TN112 / 110R_21DAG;TN112 / 110R_80DAG。如Zawada等，由Genxpro GmbH构建和分析了图书馆。（2014）。12个库的原始测序数据在Prjna517111项目下的NCBI中存放，可在此地址中获得http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/517111．利用TrueQuant技术去除原始数据集的重复读，修剪低质量序列基并剪去poly-(A)-tail。采用Illumina Hiseq2000测序仪，测序时间为1 × 100 bps。MACE读取被映射到葡萄12 x基因组组装。每个基因的转录本数量由图谱读取的文库大小乘以100万标准化。组装的结果由BLASTX注释到Swiss-Prot数据库，CRIBI V1注释。差异表达基因(DEG)的归一化和分析由DEGSeq R/Bioconductor package完成[63]．分别在各时间点和各时间点之间(从21DAG到80DAG)对各异种移植物进行分析。FDR值< 0.05,log2倍变化阈值为x ≥ |1|. Only transcripts with more than 100 counts at least in one of the condition were considered. Functional characterization was performed using the MapMan web tool Mercator (http://www.plabipd.de/portal/mercator-sequence-annotation）.利用BioMart在Phytozome v.12中获得了所有DEG的蛋白序列（https://phytozome.jgi.doe.gov/)来为墨卡托创建映射文件。获得的功能注释与Grimplet等发表的注释交叉[26]．提供了一个包含异种移植者和时间点之间的DEG的额外Excel文件（附加文件5）.从21到80DAG的DEG功能类别使用PageMan富集分析进行显著性检验，采用Fisher检验[64]．

使用HeatMapper在线工具构建Heatmaps（http://www.heatmapper.ca/expression/）.基于Kendall’s Tau距离和平均连锁进行时间点间DEG的聚类，并对DE基因的单文库进行归一化计数。

microRNA测序

每种条件的一个汇集样品被送入MiRNAS测序，以Fasteris（瑞士Geneve，瑞士）运行。

用聚丙烯酰胺凝胶筛选和纯化18 ~ 30个核苷酸(nt)中3p和5p结合的小rna。随后，合成cDNA并扩增出用于Illumina测序的文库。如加利等人所述，使用基因组分析仪流水线(Fasteris)去除低质量的reads (FASTq值< 13)，并修剪适配器序列。[65> 18 nt和> 25 nt的序列被排除在进一步的分析之外。为了鉴定系统遗传上的保守mirna，使用Bowtie v 0.12.7将sRNA序列定位到从miRBase数据库(Release 19, 2012年8月)中获得的所有保守的非冗余Viridiplantae。通过使用Bowtie v 0.12.7与默认参数比对本研究中鉴定的保守前体和sRNA文库，获得鉴定的mirna的频率。对于目标预测，psRNA目标数据库(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)，文献复习。

qPCR

根据qScript™microRNA cDNA synthesis Kit (Quanta, Bioscience)的制造商说明，每个实验条件使用三个独立的样品进行cDNA合成。简单地说，mirna首先在poly(a)聚合酶反应中被聚腺苷化，然后使用qScript逆转录酶使用oligo-dT适配器引物将poly(a)尾mirna转化为cDNA。qPCR扩增反应使用PerfeCTa通用PCR引物(特异性于oligo-dT适配器引物的独特序列)和PerfeCTa®SYBR®Green SuperMix for iQ™进行，作为前向引物使用精确的成熟miRNA序列(附加文件)6）.根据QScript™microRNA定量系统进行反应条件，最终体积为20μl，每次反应中使用5 ng总RNA当量，并使用3步循环方案来改善特异性。在IQTM 5实时PCR检测系统（Biorad，慕尼黑，德国）中进行反应，并进行熔化曲线分析以确保引物的特异性。使用LINREGPCR计划确定引物效率[66]．

使用Pfaffl公式将mirna的表达水平归一化为小干扰RNA4 (siRNA4)和siRNA41。^−ΔΔCt方法和自体移植110R作为对照样本(Pfaffl, 2001)。选取两个内参基因，对其表达进行预筛选，并将其表达5.8 s rRNA作为内参基因葡萄属Wang等人的miRNA表达分析[67]．在使用geNorm和NormFinder分析了样本之间的差异后[68在Genex软件(MultiD，哥德堡，瑞典)的siRNA4和siRNA41Medicago truncatula最近由Formey等人发现并发表[69，是最好的内参基因。采用Statistica软件(Statsoft Inc.， Tulsa, USA)进行统计学分析。为评估组合间的方差，采用单因素方差分析(p< 0.05)。

数字PCR

使用QuantStudio™3D数字PCR (QS3D)系统(Life Technologies)对TFs表达进行绝对定量。3个21和80DAG cDNA的生物样本是用200 ng总RNA合成的，之前用RNase-free DNase处理过，然后按照制造商的说明使用ImProm-II™逆转录系统进行逆转录。dPCR反应液由20ng的cDNA、QS3D反应混合物、0,9 μM的引物正向和反向以及每个FAM和VIC标记探针的0,25 μM组成(附加文件)7）.根据Santos等人进行数字PCR。（2017）。使用QuantStudio™3D分析Suite™软件进行数据分析和管理（https://apps.lifetechnologies.com/quantstudio3d/）.在Poisson Plus算法版本4.4.10中，置信度设置为95%，期望精度设置为10%。使用Statistica软件(Statsoft Inc.， Tulsa, USA)进行进一步的统计分析。在夏皮罗- wilk检验确认非正态分布后，对dPCR数据进行Wilcoxon-Mann-Whitney检验(非参数)，评估时间点之间和组合之间的变异。

阿坝:

脱落酸

DAG:

天后接

度:

差异表达基因

dPCR:

数字PCR

国际宇航科学院:

生长素

microrna的:

微

qPCR:

定量聚合酶链反应

特遣部队(s):

转录因子(s)

TN112:

Touriga国家克隆112

TN112/110R:

TN112嫁接在砧木110R上

TN21:

Touriga国家克隆21

TN21/110R:

TN21嫁接在砧木110r中

作者感谢Plansel苗圃的Teresa Roque、José Valadas和João Carvalho获得和管理这些植物，以及苗圃中植物的监测和维护;表彰玛格丽达·特谢拉(Margarida Teixeira)在野外工作和植物收获方面的合作。作者也感谢Susana Araújo在最终手稿的修订中做出的贡献。

数据和材料的可用性

所有相关信息在附加文件中1，2，3.，4，5，6，7．本研究使用的所有原始RNA测序数据均已提交至NCBI Sequence Read Archive (SRA)，隶属于生物工程PRJNA517111。提交id为SUB5084389, SRR归属为TN21/110R，共21个DAG;SRR8487041, SRR8487042, SRR8487043 to TN21/110R at 80 DAG三次;SRR8487045、SRR8487046、SRR8487048至TN112/110R为21 DAG三份，SRR8487044、SRR8487051、SRR8487052至TN112/110R为80 DAG三份。该数据可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA517111．

这项研究的设计和数据收集由国家基金通过FCT -科学技术基金会资助，该基金会隶属于PTDC/AGR-PRO/118081/2010项目。数据的分析和解释以及稿件的写作是由格兰特博士PD / BD / 113476/2015的马,在研究中心绿色it“生物资源可持续发展”(UID /多/ 04551/2013),博士项目的范围内植物生命(PD / 00035/2013)。

从属关系

1. 里斯本新大学植物细胞生物技术实验室Química e Biológica António Xavier(绿色单位)，Apartado 127, 2781-901, Oeiras，葡萄牙

   M. Assunção & P. Fevereiro

2. 里斯本新大学植物复杂性状研究所(PlantX)实验室Química e Biológica António Xavier(绿色单位)，Apartado 127, 2781-901, Oeiras，葡萄牙

   c·桑托斯

3. 国立生物技术和遗传遗传资源研究所Investigação Agrária e Veterinária(生物技术和遗传遗传资源单位

   J. Brazão & J. E. Eiras-Dias

4. 里斯本大学生物学部植物系，坎波·Grande, 1749-016，葡萄牙，里斯本

   p . Fevereiro

贡献

EED和JB参与了实验设计和现场试验，CS参与了部分数字PCR实验。MA完成了所有的实验，数据分析，并撰写了手稿。PF为设计、数据分析和手稿修改做出了贡献。所有的作者都帮助修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到M.Assunçã.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

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