核果基因表达和代谢谱的变化gydF4y2Ba齐墩果欧洲公司gydF4y2BalgydF4y2Ba．gydF4y2Ba栽培面积与成熟期的关系gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

橄榄(gydF4y2Ba齐墩果欧洲公司gydF4y2Ba)是地中海盆地一种具有象征意义的油树作物。目前，尽管橄榄树是一种温和的嗜热物种，但由于橄榄树产品对人类营养的健康影响，橄榄树的栽培正在世界范围内蔓延。扩大油橄榄栽培值得关注的是，除基因型外，环境因素对核果发育和代谢的影响，进而影响果实关键性状。在此背景下，本研究旨在进一步了解核果成熟期的遗传网络及其对环境信号的调控。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

为了实现这一目标，对核果进行了转录组范围的比较研究gydF4y2Ba齐墩果欧洲公司gydF4y2Ba从不同高度水平的地区生长的植物中收集的栽培品种Carolea，因此经历了不同的气候条件。分析了Drupe的两种成熟阶段：绿色成熟和转弯紫色。还进行了Drupe的代谢表征。在转录组和代谢水平差异，在脂肪酸（FAS）和酚化合物的途径中检测到污水成熟阶段和栽培区域。在从GM转变到TP阶段的过渡期间检测到的最相关的差异：在700masL的人群中生长的人口暴露中的上调性，酚类生物合成相关基因在10％和200个MASL中的脱落中的上调。有趣的是，在700mas1的脱落中，张开的特异性基因的下调在脱落中生长。在全球范围内，这些结果表明，在高海拔地区促进了FAS和​​酚类，主要是Secoiridoids组的稳定性，而在较低的高度酚类生物合成中延长。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

结果表明，不同海拔地区不同的温度对橄榄复合品质的遗传途径有不同的调节作用。所获得的分子信息对橄榄品种的育种和生物技术计划都很有意义，特别是关于抗氧化剂环氧环烯醚萜化合物的调节，它在赋予橄榄产品感官和健康特性方面发挥着关键作用。gydF4y2Ba

橄榄(gydF4y2Ba齐墩果欧洲公司gydF4y2Ba)是生长在地中海盆地最古老的树种之一，是世界上第六大最重要的油果作物[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．此外，已经对橄榄产品的健康影响进行了很大的评估，从而导致了橄榄栽培对人类营养的强烈影响[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．因此，在过去的几十年里，橄榄油的消费量在全球范围内扩大了[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，地中海地区以外的非传统生产国也扩大了橄榄树种植[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在重要的问题这种情况下是深刻的影响，环境因素发挥，除了基因型，对生理过程和代谢途径的橄榄果底层（核果）的发展，这在石油果皮的特点是积累，几个小表现出抗氧化活性的组分[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．As a result, the environment can strongly impact on the quality and the healthy properties of olive products (i.e. fruit and oil), which rely on both acyl composition, characterized by a low content of saturated fatty acids (FAs), and the presence of such antioxidant metabolites.

特别地，尽管合成的FA和去饱和图案品种间差别很大，橄榄油通常在富集单不饱和油酸（C18：1），然后加入亚油酸（C18：2），其百分比可以达到75-80％，总的FA，分别的3.5-21％;而棕榈酸（C16：0），硬脂酸（C18：0）和亚麻酸（C18：3）表示微量成分[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．值得注意的是，大多数橄榄油(> 90%)是在果实中产生的，而不是在种子中[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]，并在中果皮细胞发育的大型油体中积累，并遵循一个明确的时间进程[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

核果发育过程中积累的抗氧化剂代谢物包括酚类[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba[carotenoids [gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba和生育酚[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．这些化合物由于具有自由基清除活性，在保护DNA、蛋白质和脂类等生物大分子免受氧化损伤方面发挥作用。因此，这些微量成分除了赋予橄榄产品抗氧化和氧化稳定性外，还具有相关的健康价值[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．在这方面，酚类其负责橄榄油的令人愉快的感官特性[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]是研究最多的化合物[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．特别是，其中主要的作用归功于烯醚萜，它只存在于gydF4y2Ba木犀科gydF4y2Ba类，代表橄榄酚类中最重要的一类[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

基于橄榄农艺相关性，生理过程和代谢途径下面的Drupe发育，从增长到成熟和成熟，已经在很大程度上被研究和澄清了[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．然而，为了实施旨在改善橄榄产品质量和健康特性的生物技术计划，进一步需要控制这些过程的遗传网络信息，尤其是它们的环境依赖性调制信息。也就是说，已经有很大的评估表明，温度和光在调节饱和和不饱和FAs之间的平衡中都发挥了作用[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]，以及核果发育过程中分解代谢和合成代谢过程中产生的抗氧化剂和活性生物分子的水平[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

目前，在不同橄榄品种中进行的转录组范围的调查提供了一些在果实中表达的基因的结构和推定功能的相关信息，以及在调节其代谢、发育和成熟方面的潜在相关性[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．此外，最近对橄榄基因组的测序、组装和注释为进一步了解橄榄植物生理发育过程的遗传基础和关键表型性状提供了宝贵的资源[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在此背景下，针对环境的影响，我们应用高通量测序技术对核果进行了比较转录组分析gydF4y2Ba齐墩果欧洲公司gydF4y2Bacultivar Carolea growing at different altitude levels (i.e. 10, 200, 700 m above sea level, masl) and therefore experiencing different climatic conditions. Cultivar Carolea was selected because of its widespread cultivation in the Calabria region (Italy) for both oil and olive production. Two different maturation stages were analysed: the green mature (GM) and the turning purple (TP) stages corresponding to the stages usually used for oil and olive production. Such approach was expected to give insight into the influence of climatic conditions and mainly temperature on the gene expression pattern and fruit metabolic response, which could be relevant for the expanding cultivation area of olive plants outside traditional countries.

植物材料gydF4y2Ba

十/十一年生繁殖植物gydF4y2Ba齐墩果欧洲公司gydF4y2Ba使用品种Carolea。详细信息，我们使用：gydF4y2Ba

• 克隆群体属于Mirto Crosia (Cosenza, Calabria, Italy, latitude 39°37 ' 04.57″N)橄榄种质集(CREA-OFA);经度16°45 ' 42.00″E，海拔10 masl);gydF4y2Ba

• 属于仁德（Cosenza，Calabria，意大利）纬度39°21'58“n;经度16°13'44“E，高度200 MasL）;gydF4y2Ba

• 克隆群体属于CREA-OFA试验田Morano Calabro (Cosenza, Calabria, Italy, latitud39°50 ' 55.0 " N;东经16°09 ' 06.5 "，海拔700 masl)。gydF4y2Ba

前列腺素通过本微卫星分析作为属于Carolea品种（数据未显示）的微卫星分析，表征了这三种克隆人群。gydF4y2Ba

从现在开始，这三个无性系群体将分别称为10,200和700 masl群体。gydF4y2Ba

在没有灌溉的情况下，这三个人群进行了相同的农艺法，并在开花（DAF）后150和180天的季节进行了比赛。每天在不同的栽培网站中注册温度和雨等气候参数，由WD 2700气象站表示为10 MasL，200 MasL和700 MasL。平均月值±标准错误显示在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1。gydF4y2Ba

对于每种种群和每次采样，至少4000个滴灌（约20kg）被取样，从十个不同的人中取样（gydF4y2BangydF4y2Ba = 400 for each individual). In order to minimize the effects related to the asynchronous maturation of fruits within the same tree, drupes were hand-picked from all around the external parts of the canopy of trees.

对于每个采样，收集核果的一个部分（10-15KG）立即用于橄榄油处女提取;一个部分（gydF4y2BangydF4y2Ba = 300) was used for ripeness index evaluation; the remaining part (ngydF4y2Ba= 700)立即固定在液氮中，储存在−80°C，用于生化和分子分析。为尽量减少个体变异及减少可变性，所有分析均采用样本汇集法，作为生物复制的另一种方法[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

碎屑的成熟索引gydF4y2Ba

基于橄榄皮肤和纸浆颜色的主观评价，根据西班牙国家农艺研究所的指导方针确定了成熟。gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．该过程包括随机抽取100个水果样本分成8组:0 =果皮为绿色的核果;1 =核果具浅绿色外果皮;2 =核果具外果皮绿色-黄色和红色痕迹在果实的上部，覆盖四分之一的表面(开始veraison);3 =核果的外果皮红色或抛光超过一半的表面(veraison的末端);4 =核果，黑色外果皮，透明果肉;5 =核果具褐色黑色外果皮和果肉不到一半深度;6 =核果黑色外果皮和果肉褐变深度超过一半，但达到内果皮;=核果黑色外果皮和果肉褐变到内果皮。成熟度或成熟指数(RI)的计算公式如下:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba我gydF4y2Ba组号是和吗gydF4y2Ba你gydF4y2Ba为组中的核果数。这种方法包括人工分离核果，切割果肉进行检查，计数并确定它们属于哪一组。RI取值范围为0 ~ 7。gydF4y2Ba

橄榄核脂肪含量gydF4y2Ba

对于每个采样，−80°c存储的核果池(gydF4y2BangydF4y2Ba= 100)均质并干燥。取2-5 g干粉，用250 ml石油醚索氏提取6 h。在溶剂蒸发后，将含有脂肪的烧瓶在100°C下干燥，在干燥器中冷却，并重新称重。橄榄的产油率以干重(dw)的百分比表示。对于每个样品，进行三个独立的提取。三次重复数据计算结果以均数±标准差表示。gydF4y2Ba

橄榄果皮的生化分析gydF4y2Ba

对核果果皮中的叶绿素和酚类化合物进行了定量分析。−80°c存储的核果池(gydF4y2BangydF4y2Ba= 100)被干燥，分别在液氮中粉碎，使用研钵和杵，并冻干。对于每个采样，进行3次独立的提取，每个重复进行3次测量。三次重复数据计算结果以均数±标准差表示。gydF4y2Ba

叶绿素定量gydF4y2Ba

总叶绿素gydF4y2Ba

提取根据先前描述的方法进行[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba使用100毫克的干粉末。叶绿素a和b总量的测定方法为[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba吸光度(AgydF4y2Ba_{646.8gydF4y2Ba}A.gydF4y2Ba_{663.2.gydF4y2Ba}使用Cary 50 Bio (Varian，意大利都灵)分光光度计。gydF4y2Ba

酚醛普通量化gydF4y2Ba

酚类化合物gydF4y2Ba

如[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，将200mg干粉放入15ml甲醇/丙酮(1:1)中，用二亚硫酸钠饱和，在5000g下4℃离心，重复上述步骤三次，直至得到无色颗粒。将收集的上清液在45℃真空干燥，残渣溶于水(8 ml)，用正己烷处理，去除色素和大部分脂质。最后，以1:1溶剂与水的比例，用6倍的醚/乙酸乙酯(1:1)萃取苯酚化合物。用无水硫酸钠脱水，过滤，30℃真空干燥。残渣溶于甲醇(5ml)，用于高效液相色谱分析，根据[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]采用高效液相色谱仪器(1100系列，安捷伦，米兰，意大利)，光电二极管阵列检测器使用色谱柱inertSil ODS-3 (5 μm, 15 cm × 4.6 mm i.d)和Spherisorb S5 ODS-2 (5 μm, 1 cm × 4.6 mm i.d, Sigma-Aldrich srl，米兰，意大利)预柱。操作条件:用0.2%乙酸(pH = 3.1)和甲醇洗脱，进样量20 μl;流速1.5 ml/min，总运行时间60分钟。溶剂梯度变化如下:初始成分为95%乙酸和5%甲醇，梯度变化如下:保持甲醇浓度2 min，然后在8 min时将甲醇浓度提高到25%，最后在10 min时将甲醇浓度分别提高到40、50和100%。维持100% 5分钟。在15分钟内达到初始条件。色谱图分别在280和240 nm处获得。单个酚类物质表示为每公斤橄榄果肉干重的毫克(毫克/千克重量)。gydF4y2Ba

参考化合物:gydF4y2Ba橄榄苦苷，ligstroside，酪醇（P-HPEA），羟基酪醇（3,4- DHPEA），链接到酪醇elenolic酸醛（对 - HPEA-EDA），连接至羟基酪醇elenolic酸二醛（3,4- DHPEA-EDA），与酪醇相连的烯酸(p-HPEA-EA)与羟基羟氢溶胶相连的伊莱醇酸（3,4-DHPEA-EA），were quantified by using the external standard method at 280 nm. Elenolic acid (EA) was detected at 240 nm.

初榨橄榄油分析gydF4y2Ba

收获后，核果立即处理榨油。只健康核果，没有任何形式的感染或物理损坏的进行了处理，并使用Oliomio得到油 - 铣床（托斯卡纳Enologica森，佩萨河谷塔瓦内莱，佛罗伦萨，意大利）。每次取样后，一池核果(10.–15 kg) were cleaned from leaves and crushed with a hammer crusher. The obtained paste was mixed at room temperature for 30 min, centrifuged (1300 g for 3 min), and then transferred into dark glass bottles. The oils were stored at 4 °C until analysis.

voo质量指标gydF4y2Ba

使用EUC/2568/91欧盟法规和随后的修订和添加中描述的分析方法来估计自由脂肪酸(FAs)、过氧化值和在232 nm和270 nm (K)处的紫外吸收特性gydF4y2Ba_232gydF4y2Ba和K.gydF4y2Ba_270gydF4y2Ba， 分别）。游离酸度是给定为油酸的百分比和PV在每油公斤活性氧的毫当量表示（毫克当量ÒgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/公斤)。分光光度测定采用UV - Vis 1800仪器(岛津公司，日本京都)。对每个样本进行了三次独立的测量。gydF4y2Ba

免费FA分析gydF4y2Ba

作为委员会法规没有91分之2568和欧盟的N. 1429年至1492年，由国际橄榄油理事会（2015年）中描述制备游离Fas。The chromatographic separation was carried out with an Agilent 6890 gas chromatograph (Agilent, Waldbronn, Germany), apparatus equipped with a fused-silica SP2340 Supelco column (60 m 0.25 mm i.d., film thickness 0.20 mm) and a flame ionization detector (FID), linked to a HP Chemstation integrator. Operating conditions: carrier gas was helium (purity 99.999%); flow rate 0.9 ml min^1gydF4y2Ba;注射器温度260°C;在3°C / min（保持15分钟）以150℃（保持7分钟）至230°C柱（保持15分钟）。FID温度260°C。结果表达为总面积的相对百分比[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．对于每个样本，进行三个独立的分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

生化分析数据以平均值的标准差为基础进行比较。使用XLSTAT (Win v. 2016.3)对数据进行分析，在95%置信水平下进行单因素方差分析(ANOVA) (gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05)，以确定VOO和核果数分析的所有参数之间存在显著差异。gydF4y2Ba

RNA隔离gydF4y2Ba

每次取样后，一池核果(gydF4y2BangydF4y2Ba= 500)，在−80°C储存，在液氮中粉碎，使用研钵和杵。总RNA通过RNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)使用100mg分装粉末分离，如前面所述[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．经过DNase I (Roche, Milan Italy)处理后，总RNA被沉淀，最终在RNase-free水中重新悬浮。采用ND-2000纳米滴分光光度计对RNA进行定量，电泳检测RNA的完整性。对每个样本进行三次独立的RNA提取。cDNA文库制备和定量PCR只选用OD260/280 = 1.8~2.2, RNA 28S:18S≥1.0,RNA Integrity Number (RIN)≥7.0的样品。对每个样本进行三次独立的RNA提取。gydF4y2Ba

RNA-seq库合成gydF4y2Ba

对于每个样品，使用从一个重复提取的总RNA共3 μg。gydF4y2Ba

Cytoplasmatic rRNA移除使用Ribo-Zero rRNA执行删除设备(美国WI震中,麦迪逊)和rRNA-depleted RNA被用来准备六RNA-seq库(10 masl通用、10 masl TP 200 masl通用、200 masl TP, 700 masl通用和700 masl TP)使用TruSeq困总RNA样本准备工具包(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国),根据制造商的说明。在意大利乌迪内IGA技术服务公司Illumina HiSeq2000平台上对文库进行测序，每个片段生成50 bp的单端reads。gydF4y2Ba

用于定量PCR的sscDNA合成gydF4y2Ba

根据制造商的说明书(Invitrogen公司，意大利米兰)，从三个独立的重复中分别提取总RNA (3 μg)，与SuperScript III逆转录酶和oligo dT(22)相互作用进行cDNA合成。gydF4y2Ba

rna序列分析gydF4y2Ba

使用FASTQC程序检查RNA-SEQ以FASTQ格式读取（gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/gydF4y2Ba)，而适配器和低质量区域(phred cut-off 20)使用TrimGalore (gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/gydF4y2Ba），不包括与最终长度小于30个碱基的读取。gydF4y2Ba

随后将清理后的reads与最近发布的olive wild基因组(v1.0)进行比对[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]通过STAR方法[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba](作为参数使用:——outSAMtype BAM SortedByCoordinate——outSAMattributes All——outFilterMultimapNmax 1)。gydF4y2Ba

广义倍数变化算法（GFOLD）gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，用于对已知的橄榄树注释赋读，并进行差异基因表达。Olive wild genome v1.0 in fasta format and annotation in gff3 format下载自Phytozome v13 [gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

橄榄成绩单的定量gydF4y2Ba

每转录读取计数是根据在转换值RPKM [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]，通过应用GFOLD鲁棒算法[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．基因表达的比较进行计算计算gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用自定义的Python脚本倍数变化。gydF4y2Ba

定量实时PCR（QRT-PCR）gydF4y2Ba

为了验证转录组数据，还使用STEP ONE仪器(Applied biosystems)通过qRT-PCR分析所选基因的表达水平。由[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba,−gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]进行qRT-PCR分析，详见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S1。通过使用SSCDNA（25ng）作为模板以终体体积为20μl的终体体积，如[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]．反应结束后，通过评估“熔化曲线”确定了唯一的PCR产物的存在[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba从60°C到95°C，每10秒增加0.5°C。结果使用STEP One Software 2.0 (Applied Biosystems)进行分析，根据2gydF4y2Ba^{——ΔΔCTgydF4y2Ba}方法 [gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．每个采样进行3次独立扩增，每次扩增进行3个重复。重复数据计算结果以均数±标准差表示。部分qRT-PCR分析结果作为补充文件报告gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S6。gydF4y2Ba

代谢途径分析gydF4y2Ba

代谢途径分析采用交互途径(ipath)(2.0版)(gydF4y2Bahttp://pathways.embl.de/gydF4y2Ba)，根据…gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]．通过GO (Gene Orthology) id，从编码该基因的所有家族成员中总结出该基因家族的表达情况。人工合成了与脂质代谢和酚代谢相关的代谢途径。为了了解基因在果实成熟过程中的动态变化和绝对表达量，采用两种不同的颜色表示不同的RPKM值。gydF4y2Ba

使用在线工具KEGG Mapper (gydF4y2Bahttps://www.genome.jp/kegg/mapper.htmlgydF4y2Ba）.这个基于web的系统允许最终用户使用目标数据库中的KEGG标识符来探索大规模的基因表达数据集，并对转录组分析所识别的基因进行映射。gydF4y2Ba

核果代谢表征gydF4y2Ba

初采时，每个居群(10,200,700 masl)在150和180 DAF (gydF4y2BangydF4y2Ba= 100的每个DAF和每个群体)进行分析，以定义成熟指数(RI)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.观察到所有人群,样品收集在150年和180年来说,与绿色的成熟阶段(RI =从不同masl核果0.0到0.5),把紫色的阶段(RI =从不同masl核果2.6到3.2),分别为(gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．从这里开始，我们只将核果成熟期称为GM(绿熟)和TP(紫熟)期。gydF4y2Ba

为了进一步表征Drupe代谢状态，一些相关参数如叶绿素含量（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，血脂水平和组成(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S2）和酚类（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)也进行了评估。gydF4y2Ba

无论考虑什么群体，TP期的核果总叶绿素含量都显著低于GM期(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.这一结果与TP期检测到的RI一致，说明这一时期的核果由于同时有花青素积累和叶绿素降解，果实表面呈现不完全紫色[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．此外，在三种群体中，叶绿素消失（R）的相对率相当。然而，非常有趣的是，当叶绿素时gydF4y2BaB / AgydF4y2Ba分析了比例可以观察到群体之间的明显差异。即，与200和700个MASL相比，GM阶段的这种比例在10masL的群体中显着降低，而200和700个MASL显示出类似的值。增加叶绿素gydF4y2BaB / AgydF4y2Ba在10、200、700 masl时，各群体的成熟率分别为2.8、0.9、0.5倍。因此，在TP阶段，种群中200 masl的比例最高(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

叶绿素内容物，在许多水果中叶绿素gydF4y2BaB / AgydF4y2Ba比率，可随属、种、品种、环境因素和成熟阶段而变化[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．在我们的情况下，差异在帧内品种水平，这催熟以及光合装置的结构中暗示，在品种Carolea叶绿素分解代谢中发现相对于明显不同的不同的环境条件在不同MASL迫近。gydF4y2Ba

关于脂类成分，在所有群体中，当比较转基因和TP时期的核果时，以干物质的百分比估计，总含量都增加了约30%(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).此外，尽管差异没有统计学意义，但在种群中检测到的最高和最低水平分别为10和200 masl(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。还在附加文件中分析并概述了由加工碎屑衍生的油的Fas组成gydF4y2Ba3.gydF4y2BaS2:表。根据文献资料[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]在所有群体中的最高分数是有关单不饱和的FA（图gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。然而，统计分析证明，在200和10的样品中，在向TP阶段的过渡期间饱和和不饱和Fas略微改变的饱和和不饱和Fas之间的平衡，而700masL的样品保持不变（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。特别地，我们观察到，在200masL的样品中，单不饱和和多不饱和FAS的百分比分别增加和降低，而在10masL的样品中报道相反的图案（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。因此，Fas组成的一些显着差异导致与发育阶段和MASL相比发生。然而，在所有样品中，比例油酸/亚油酸大于7（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：根据一个高品质油的标准表S2）gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]．此外，与油质（FA）的参数，如游离酸度值时，初级氧化值（PV），二烯/共轭三烯索引，羰化合物存在（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S2）在预接初榨橄榄油（EVOOS）（EEC，1991; IOC 2006）中的接受值内容。因此，从全局全局采用高质量获得的油。这与表明在Carolea品种中，TP阶段对应于橄榄油的化学和感觉特性的成熟阶段是最佳的[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

具体的酚类物质，其假定的途径被公布在其他文件量gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2，也被评估(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.注意力主要集中在secoiridoids组及其衍生物，如在这两个感官和健康的特点赋予橄榄制品（相关球员图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些成分来源于环烯醚萜，以油苷的形式存在，包括油苦苷、ligstroside及其衍生物(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)。它们的丰度与橄榄果实中存在的酶活性有关，而这些酶活性尚未被完全阐明。gydF4y2Ba

到目前为止，众所周知，Oleuropein是最丰富的级数[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]，其数量取决于内源性ß-糖苷酶的活性，该酶将其水解成葡萄糖和橄榄苦苷苷。后一种化合物可以进一步酯化生成羟基酪醇，被认为是最具生物活性的酚分子之一。另一方面，糖基结构也可以发生几种化学重排，如脱羧、甲基化或氧化，导致新的酚基糖基结构的形成，包括不稳定的酮烯醛互变异构体形式(如单和双醛形式)[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba,−gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

当考虑选择酚(Phs)的总量时，在质量和发育阶段都存在一些差异。的确，在转基因阶段，在200 masl生长的群体核果中检测到最高的Phs含量。更有趣的是，在GM向TP过渡阶段，生长在200和700 masl的群体核果中小Phs数量显著减少，而生长在10 masl的群体核果中小Phs数量显著增加(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).这一相反的行为导致在10质量生长的群体的TP核果中Phs含量最高，与其他两个群体相比。考虑到每一种酚的水平，在数量和时间水平上观察到更明显的差异。特别地，在所有样品中，很明显，主要部分与橄榄苦苷和羟噻酚(3-4-DHPEA)有关(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC，E）。然而，考虑到每种苯酚的齐全水平，可以观察到SecoIriDoids和相关化合物的累积模式中清楚的定量和时间差异。其中，与200和10MASL的那些相比，在700个MasL的群体中观察到非常低且稳定的EA。此外，与在200masL的群体中生长的群体的血液中，与在10％和700 masL的群体的群体的群体中，在GM阶段Oleuropein含量显着高。此外，根据文献中的数据[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]在10和200 masl群体核果中，该化合物的含量在TP过渡阶段下降了约1/1.5倍。相比之下，在700质量时，群体核果中橄榄苦苷的含量增加了1.5倍。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).另一方面，在10 masl生长的种群中，在向TP过渡阶段也观察到较高水平的二烯醚苦苷苷苷(3-4-DHPEA-EDA)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba相比之下，200和700质量的转基因核果中二萜川芎苷苷(p-HPEA-EDA)含量高于10质量的核果(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bal)。gydF4y2Ba

比较转录组分析gydF4y2Ba

通过Illumina HiSeq2000平台，利用深度转录组测序技术，对不同气候条件下山楂核果进行转录组比较分析。为我们的目的准备了6个库(10个GM, 10个TP, 200个GM, 200个TP, 700个GM和700个TP)。每个图书馆平均产生4200万单端读取，其中约95%用于进一步分析，经过适当的清洁程序(见材料和方法部分)。gydF4y2Ba

经过转录本量化和基因组定位，确定了TP和MG核果之间的差异表达基因(DEG)(见材料和方法部分)[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

如图维恩图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa），与10和200个masl的群体的滴灌的文库与在700 masl的人口中的人口中分享了更高数量的Degs，而在所有三个文库中只有1870次常见（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一种）。这一结果表明，在核果成熟基因表达被差分在不同MASL具有最大差异调制的样本被观察从700 MASL。gydF4y2Ba

根据功能注释，对每个基因库，DEGs分为两个基因本体类别:生物过程和分子功能(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。一般观察是，尽管从每种人群衍生的信息定量不同，但分类功能和过程的频谱是相当的。特别是关于分子函数类别（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)，在所有比较中，deg的结合(从67到70%)和催化活性(从26到29%)的比例很大。然而，在基于生物过程的分类中(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)与代谢过程相关的deg在所有三个种群中占主要比例，范围为35 - 40%(图3)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).这些结果与核果在转基因向TP过渡期间仍然活跃的代谢相一致。在10 masl(4%)和700masl(8%)的山楂核果中也存在生长和发育类别，而在200 masl的山楂核果中几乎不存在，这表明后者的核果生长和发育过程的阻滞更为加速。此外，仅在10masl生长的核果中，有11%的DEGs被归为细胞过程的调控。刺激反应种类也存在差异，200 masl时核果的刺激反应比例最高(16%)，10 masl时为8%，700 masl时为5%。在700 masl时，胁迫相关基因覆盖了‘Carolea’核果中相关部分的DEGs(15%)，高于200和10 masl时的DEGs(6%)(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab），建议在较高的海拔地区，与200和10个MasL的生长相比，在相比之下曝光至重大压力条件。基于温和的热源[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba在橄榄植物中，我们假设较低的温度在700、200和10 masl(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1A）可以解释这种差异响应。gydF4y2Ba

不同发育体代谢途径的成熟相关变异gydF4y2Ba

为了获得核果从转基因阶段到TP阶段的代谢的全局视图，并验证其是否以及如何随海拔高度而不同，KEGG路径mapping工具(gydF4y2Bahttps://www.genome.jp/kegg/tool/map_pathway2.htmlgydF4y2Ba)使用。从RNA-Seq转录组数据中选择DEGs，其中针对KEGG通路图搜索以创建交互代谢网络[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3，附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S4，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:数字S5)。gydF4y2Ba

很明显，在从转基因到TP阶段，所有三个群体的核果中都存在普遍的基因下调，即使在生长在10 masl的群体中比200和700 masl的群体中更明显(补充文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3，附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S4，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:数字S5)。尽管在所有人群中一些基因upregulation可以观察到处理成能量代谢有关的基因(如丙酮酸代谢,柠檬酸循环),碳水化合物代谢和氨基酸分解代谢以及脂类代谢,后者人口增长在200年和700年masl(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3，附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S4，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:数字S5)。此外，一些与类黄酮和苯丙素生物合成相关的基因在生长在10和200 masl的群体核果中也分别上调gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3，附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：图S4）。gydF4y2Ba

虽然在转录后水平上可以发生不同的调控，但这一转录模式突出表明，在从转基因到TP阶段，在不同质量的核果中，脂质和酚类相关的遗传途径都受到不同的调控。这一结果与检测到的脂质数量和组成的差异是一致的(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和不同分析酚类化合物的含量(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)以及RI值(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba有关核果）转色期在TP阶段存在的，由于花色苷的积累[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba]．值得注意的是，根据转录组数据显示，生长在10 masl的植物核果中与花青素生产相关的遗传途径的激活程度更高或更长，与生长在200和700 masl的植物相比，这些植物表现出更高的RI。gydF4y2Ba

基于这一互动网络，我们进一步分析了脂类和酚类代谢途径相关基因的差异表达，因为它们与果实品质密切相关。gydF4y2Ba

涉及脂质代谢基因的表达模式gydF4y2Ba

在脂质代谢方面，特别关注FAs的生物合成和降解(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.尽管生物合成的FA的所有样品中的一般下调，仅观察到在种群在200和700 MASL（图生长的核果沿通路的特定基因的上调。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).生长在10和700 masl群体的核果中也观察到与FAs降解相关的代谢途径下调，即使后者的下调幅度比前者更大(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab）。与此相反，在人口核果生长在200 MASL观察上游和沿着该降解途径下调DEGS之间的均衡比率（图gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).注意到的表达水平gydF4y2BafgydF4y2Ba稀释基因(gydF4y2BafgydF4y2Ba)，主要参与对油质有强烈影响的不饱和脂肪酸的生物合成途径[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]．并通过qRT-PCR分析估计这些基因的表达水平，以验证测序数据。转录组和qRT-PCR分析表明，在700 maslgydF4y2BaOeFAD2.2gydF4y2Ba和gydF4y2BaFAD6.gydF4y2Ba与GM相比，TP基因表达上调(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.在200masl的样本中观察到相反的行为gydF4y2BafgydF4y2Ba表达在全球下调（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.最后，在人口增长到10个masl时，gydF4y2BafgydF4y2Ba与200和700 masl和仅200和700 masl的样本相比，表达整体较低gydF4y2BaOeFAD7gydF4y2Ba与GM阶段相比，TP阶段出现了上调(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

这种差异表达模式gydF4y2BafgydF4y2Ba从不同的成熟阶段和群体之间检测到污水之间的全球符合大量证据，表明这些基因的表达在橄榄果实成熟期间在空间和时间上调节，并且也可以通过外部因素调节，首先通过温度，独立于温度。通过基因型[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]．特别是冷诱导表达gydF4y2BaOeFAD7gydF4y2Ba已在不同的橄榄品种中报道[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba可以解释最高水平的gydF4y2BaOeFAD7gydF4y2Ba在700质量的样品中与200和700质量的样品相比。总的来说，这些结果支持了这样一种观点，即在700mass处FAs具有高稳定性。gydF4y2Ba

有关酚类代谢基因的表达模式gydF4y2Ba

关于酚类化合物，沿通路鉴定的基因的表达模式在图中示出。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．还报道了通过QRT-PCR分析的一些这些基因的表达水平，作为RNAseQ数据的验证，（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba虚线框)。从转基因阶段到TP阶段，遗传途径普遍下调。尽管如此，还是有一些特定的基因发生了上调，主要发生在200和10质量生长的群体核果中，而在700质量生长的群体核果中。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.总体而言，这些结果表明，从塑型甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)和甲戊酸(MVA)途径开始，以及沿着该途径的所有分支，在比较三个群体时，所鉴定的基因受到了不同的调节。gydF4y2Ba

这种差异表达模式的有趣方面与SecoIridoids化合物中所涉及的基因的行为有关（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.在全球范围内，我们观察到，在生长在10和主要在200 masl的种群核果中，大多数基因参与了生物合成(gydF4y2BaNDHI, LAMTgydF4y2Ba和gydF4y2BaSLS1gydF4y2Ba）和降解（ß-gydF4y2BaGLUsgydF4y2Ba和gydF4y2BaPRX.gydF4y2Ba)与GM相比，TP期橄榄苦苷的表达上调。相比之下，在700 masl生长的核果中，一些生物合成相关基因的上调与分解代谢相关基因的下调相关(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba虽然我们不能直接相关的基因表达与化合物数量或活动,这些结果让我们假设在最高masl oleuropein的退化是减少或推迟,支持其700年TP核果增长更多masl相比增长10和200 masl(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。Oleuropein以其具有高抗氧化活性相关的有益健康效果而闻名。因此，与200和10个MASL相比，在700个MasL中收集的TP滴落中检测到的较高的Oleuropein含量与常规分配给在低温下生长的植物产生的水果产生的油脂的最佳品质一致。gydF4y2Ba

综上所述，本研究为“卡乐来”橄榄果实中基因表达的调控提供了一些有趣的信息，这些信息与绿色成熟期转紫期和栽培区域海拔高度有关。分析主要集中在脂质和酚代谢的细节，获得的结果允许我们提出，在低温下，如在700 masl核果生长的经历，在过渡阶段的基因表达的调节导致脂肪酸的稳定性，而较低的温度将延长苯酚的生物合成。这一结果可能与酚类物质在保护植物和水果免受高辐照和氧化应激方面的作用有关，这些作用可能主要发生在夏季低质量时。gydF4y2Ba

最后,非常有趣的是,“Carolea”核果的植物在700 masl,基因表达调制,更高的稳定性oleuropein分数被提拔相比增长10和200 masl,这导致更高层次的secoiridoid在TP阶段,尽管全球总小灵通含量较低。值得注意的是橄榄苦苷与橄榄产品的健康特性密切相关，而且众所周知，橄榄苦苷含量在核果发育和成熟过程中急剧下降[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．因此，在TP检测橄榄苦苷的稳定和内容的增强CV Carolea植物的核果在较高MASL增长代表了橄榄繁殖计划相关的特征。全球范围内，这些信息可能会感兴趣的生物技术方案解决，以提高质量和橄榄产品的健康性能。gydF4y2Ba

支持本文结果的数据以附加文件的形式提供。与本研究有关的所有数据都包含在手稿的表格/图表中。作者很乐意根据要求分享数据。gydF4y2Ba

ALDH:gydF4y2Ba

乙醇脱氢酶gydF4y2Ba

CRY2:gydF4y2Ba

cryptpchrome 2gydF4y2Ba

CUAO:gydF4y2Ba

铜胺氧化酶gydF4y2Ba

DAF：gydF4y2Ba

几天后开花gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异基因表达gydF4y2Ba

德国之声：gydF4y2Ba

干重gydF4y2Ba

EVOO:gydF4y2Ba

特级初榨橄榄油gydF4y2Ba

F A：gydF4y2Ba

脂肪酸gydF4y2Ba

通用汽车:gydF4y2Ba

绿色的成熟gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

高效液相色谱法:gydF4y2Ba

高效液相色谱法gydF4y2Ba

Ipath:gydF4y2Ba

互动途径gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书gydF4y2Ba

LAMT：gydF4y2Ba

S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶gydF4y2Ba

Masl:gydF4y2Ba

海平面以上gydF4y2Ba

MEP：gydF4y2Ba

甲基吡啶醇4-磷酸盐gydF4y2Ba

MEP：gydF4y2Ba

Plastidic methylerythritol 4-phosphategydF4y2Ba

MVA:gydF4y2Ba

甲羟戊酸gydF4y2Ba

MVA:gydF4y2Ba

甲羟戊酸gydF4y2Ba

ndhi：gydF4y2Ba

NADH脱氢酶I.gydF4y2Ba

OeFADsgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

fgydF4y2Ba去饱和基因gydF4y2Ba

朋友：gydF4y2Ba

苯丙氨酸ammonia-lyasegydF4y2Ba

p-hpea-ea：gydF4y2Ba

对羟苯基乙醇gydF4y2Ba

对HPEA-EDA：gydF4y2Ba

Dialdeid ligustroside糖苷配基gydF4y2Ba

小灵通:gydF4y2Ba

酚类gydF4y2Ba

PV：gydF4y2Ba

主要氧化值gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

接待员:gydF4y2Ba

叶绿素消失gydF4y2Ba

国际扶轮:gydF4y2Ba

成熟指数gydF4y2Ba

RPKM:gydF4y2Ba

读取每千基百万gydF4y2Ba

SLS:gydF4y2Ba

Secologanin synthase-likegydF4y2Ba

TP：gydF4y2Ba

谈到紫gydF4y2Ba

VOOS：gydF4y2Ba

初榨橄榄油gydF4y2Ba

ß-glu：gydF4y2Ba

beta 1, 3-glucosidasegydF4y2Ba

3-4-DHPEA:gydF4y2Ba

HydroxytirosolgydF4y2Ba

3-4-DHPEA-EDA：gydF4y2Ba

Dialdeid oleuropein糖苷配基gydF4y2Ba

3, 4-DHPEA-EA:gydF4y2Ba

烯醛酸与羟酪醇相连gydF4y2Ba

作者感谢卡拉布里亚大学提供的财政支持。gydF4y2Ba

这项研究由卡拉布里亚大学资助(MIUR - ex 60%)。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 《地球生态科学》，Università della Calabria, 87036，意大利gydF4y2Ba

   莱昂纳多布鲁诺，玛丽安娜Pacenza，阿德里安娜Chiappetta，安东内拉武藤，奥林匹亚加格里亚蒂和玛丽亚·比阿特丽斯BitontigydF4y2Ba

2. 巴里A.摩洛大学生物科学、生物技术和生物制药系，意大利巴里gydF4y2Ba

   Ernesto Picardi＆Graziano PesolegydF4y2Ba

3. 生物膜、生物能学和分子生物技术研究所，意大利巴里国家科学院gydF4y2Ba

   Ernesto Picardi＆Graziano PesolegydF4y2Ba

4. Centro di Ricerca每L'Olivicoltura-Frutticoltura-Agrumoltura（Ofa）Conglio Per La Ricerca在Agricoltura E L'Analisi Dell'eareComia Agraria（Crea）C.da Li Rocchi-vermicelli，87036，Rende（CS），意大利gydF4y2Ba

   Innocenzo MuzzalupogydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

最初的想法是由LB，AC，IM和MBB构思设计了实验方案。LB，AC，IM，EP，MP，AM，OG进行研究。LB，AC，IM，EP，GP，MBB，分析的数据和讨论的结果。LB，AC，IM，EP，GP和MBB，写的稿子。所有作者审查并批准了稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaMaria Beatrice Bitonti.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

The olive fruits used in this work derived from plants belonging to the germplasm collection and to an experimental field of the Italian Institution “Consiglio per la Ricerca in Agricoltura e l’Analisi dell’Economia Agraria, Centro di Ricerca per Olivicoltura, Frutticoltura, Agrumicoltura (CREA-OFA)” in Rende (Cosenza - Calabria Region). The research conducted in this study required neither approval from an ethics committee nor consent to partecipate.

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