中断的Lotus对虾运输车ljnpf2.9增加地上部生物量和硝酸盐含量，但不影响共生性能

背景

在从土壤中吸收到根系组织中，硝酸盐的分布和分配在整个植物体中，是氮气利用效率（NUE）的关键步骤，以及响应各种环境条件的植物生长调节。在豆科植物中，硝酸盐分布对于调节允许固定大气N的旋转旋转过程也很重要（n₂)，通过与根瘤菌的共生互作(共生固氮，SNF)。

结果

在这里我们报告的功能表征Lotus对虾基因ljnpf2.9，主要在根维管结构中表达，这是控制硝酸盐在植物体内分配的关键位置。LjNPF2.9表达非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞产生¹⁵不_3.积累表明它作为硝酸盐的输入器。三个独立敲除突变体的表型特征表明，突变体背景下的茎生物量增加。这种表型与在茎/根中检测到的硝酸盐含量的增加/减少有关。此外，我们的分析表明，硝酸盐在地上部的积累并不影响敲除突变体的结瘤和固氮能力。

结论

本研究表明，LjNPF2.9在硝酸盐向根的向下运输中起着至关重要的作用，可能是通过木质部到韧皮部的负载介导的活性。从改良氮素利用的角度来看，茎生物量和硝酸盐积累的增加可能代表了相关的表型，这在豆科植物中得到了进一步加强，因为报道称这对氮素利用效率没有影响。

硝酸盐是植物从土壤中获取氮的主要形式之一。植物作为固着生物，必须应对不同的土壤硝酸盐浓度，以优化其从周围环境的吸收、液泡储存/再动员以及在不同植物组织中的分布。此外，植物必须感知和阐明内部营养状况，以破译氮需求，从而决定多少硝酸盐需要吸收、储存/同化和转运，以支持植物的最佳生长。植物转运体是硝酸盐通量网络中的关键分子，涉及的四个蛋白家族分别是:氯离子通道(CLC)、缓慢激活阴离子通道(SLAC)、硝酸盐/肽转运体(NPF)和硝酸盐转运体(NRT2)，其中NPF和NRT2起主要作用[1那2］．

植物NPF家族的成员数量非常多，共有53个已知基因拟南芥和80 in.Oriza漂白亚麻纤维卷．NPF转运蛋白通常对硝酸盐表现出低亲和力，但ATNPF6.3除外[3.], MtNPF1.7 [4.], MtNPF6.8 [5.]和osnpf6.5 [6.]，显示双重关联。从土壤吸收后，硝酸盐在根部中同化或运输到枝条上的量取决于不同植物组织和器官中硝酸还原酶（NR）的不同方面[7.]， 温度 [8.]，硝酸盐可用性和光强度[9.那10］．许多NPF蛋白参与了答:芥和o .漂白亚麻纤维卷为了平衡根部和射击之间的硝酸盐向上和向下易位。AtNPF7.3是一种硝态诱导的基因，介导木质瓣膜荷兰植物载荷，用于抗芽的硝酸盐易位[11］．根-茎硝酸盐的转运也受ATNPF2.3.，仅在盐度条件下观察到其活性的组成型表达基因，以防止过度硝酸盐对根部的分配[12］．相反地AtNPF7.2在木质薄壁细胞中表达的基因已参与在不利条件下将硝酸盐保持在根中[13］．AtNPF7.3的装载活性也被AtNPF2.9部分抵消，AtNPF2.9介导韧皮部装载和向下硝酸盐运输[14］．此外，Hsu和Tsay [15据报道，Phloem局部化ATNPF1.1和ATNPF1.2参与叶片中的硝酸盐再分布。最近，位于铜绿体的生物化学表征ATNPF5.11，ATNPF5.12和ATNPF5.16表明了硝酸盐的流出活动非洲爪蟾蜍光滑的这可能参与控制根系和芽之间的硝酸盐分区[16］．在o .漂白亚麻纤维卷这OsNPF2.4表皮表达的基因，Xylem薄壁组织和韧皮伴侣伴细胞均涉及从外部来源的硝酸盐采集，并从根部射击到射击[17]，两个函数也与OSNPF6.5 Transporter相关联[6.］．在另一边，木质硝酸硝酸盐卸载和控制根到硝酸盐传输的功能似乎是共享的o .漂白亚麻纤维卷OsNPF2.2也参与了脉管系统的发展[18］．

众所周知，豆科植物已经进化出与土壤细菌根瘤菌(SNF)建立共生相互作用的能力，导致根感染、根瘤器官发生、新器官定植和大气氮的固定。这一共生过程的发生为豆科植物中硝酸盐转运体的功能特性增加了一个有趣的原因，因为众所周知，硝酸盐通过充当营养物质和信号来调节结瘤的所有不同步骤[19那20.那21那22那23］．特别地，结节形成能力在暴露于含有外部硝酸盐浓度的豆类植物中局部抑制[22]以及在N喂养植物中全身抑制[23那24］．这表明，豆科植物氮营养状态对SNF的系统控制可能与调控NUE的途径存在交互作用。这一点必须考虑，因为提高豆科植物氮素利用率的策略可能会对有效的共生相互作用产生冲突。

此外，对SNF的控制中的作用可能被NPF蛋白的容量包围，以与硝酸盐，例如激素，二羧酸，二肽，氨基酸，氨基酸[25那26那27那28那29那30.那31］．然而，到目前为止，植物中硝酸盐转运蛋白的研究很少受到关注，并在豆类中的NPF家庭分析上发表了很少的报告[5.那32那33那34那35］．仅报告了NPF参与染色过程的参与MTNPF1.7.控制根瘤分生组织的形成和入侵[36那37] 和ljnpf8.6.在调节结节功能中发挥作用[35］．

在这里我们报告的功能表征ljnpf2.9编码蛋白质的基因，显示硝酸盐运输能力非洲爪蟾蜍光滑的参与硝酸盐在荷花植株中的分布控制，并参与向根组织的向下转运。在三个独立的敲除突变体的芽中检测到较高的硝酸盐含量并不影响它们的结瘤和固氮能力。

NPF识别在l .对虾

39个NPF成员的临时清单l .对虾[38]那其中不包括Leran等人所述的31种植物物种中，[1]已经报道了。重申爆炸搜索对增强型l .对虾基因组组装(3.0版)，现在允许鉴定更大的，ljnpf.家庭由86名成员组成（附加文件1:表S1和附加文件2：表S2）。用最大判定方法获得的系统发育树，并基于对准的对准答:芥和l .对虾氨基酸NPF序列显示了Leran等人鉴定的8个进化支的预期分布，[1]（附加文件3.:图S1)。Leran等报道[1]由两个字母代码分配了命名法，其中第一个识别思路数，第二个字母代码和第二个字母代码分配l .对虾不反映同源关系(附加文件1:表S1)。有趣的是，整个LjNPF家族的大小和鉴定的8个分支的大小接近在其他二倍体模型豆科中发现的npf的数量Medicago Truncatula.[1］．

ljnpf2.9主要在根血管组织中表达

基因组组装3.0;http://www.kazusa.or.jp/lotus/）已经在思考的船材2中分类并重新命名ljnpf2.9（附加文件1表S1)，编码635个氨基酸，预测分子量为70.4 kDa。LjNPF2.9作为大多数NPF蛋白，预计包含12个跨膜结构域，在结构域6和7之间有一个95个氨基酸长的细胞质环4.:图S2)。

我们之前报道过的初步分子表征ljnpf2.9（在不同浓度下硝酸盐施用后分析其在根组织中的转录谱[31］．时间-过程实验没有显示显著的转录反应，无论是转移到低或高外源硝酸盐浓度的根组织，还是转移后的早期Mesorhizobium洛蒂接种(32］．

表达的侧面ljnpf2.9已通过分析转录本在不同器官中的分布进一步表征l .对虾通过QRT-PCR。幼苗在Gamborg-B5衍生物培养基上发芽，1毫米Kno_3.作为N源，已接种M. Loti.以及3周后从不同器官中提取的rna。这ljnpf2.9un处被表达l .对虾在根和茎中检测到表达量最高的器官(图。1)．

以获得关于…的详细资料ljnpf2.9在根组织中表达，PCR扩增到ATG上游1038 bp，包含前10个LjNPF2.9密码子的片段，获得与该基因的翻译融合格斯一个报告基因。莲花在转化后获得的复合植物根出杆菌根草杆菌已经获得，并在毛状根中测试了GUS活动。GUS染色被限制在初级和侧面根的血管结构上，并且在初级和次级根部的共同区域以及根原基中没有任何活动（图。2a - c)。图中的根截面。2d证实GUS活性仅限于根维管束，在中柱鞘细胞层和韧皮部区域有更强烈的染色。

Lore1插入零突变体的分离和生物质参数的表型分析

测定…的体内功能ljnpf2.9，三个独立的LORE1插入突变体已被隔离l .对虾Lore1线集合[39那40那41］．线30,086,034,30,071,286和30,007,925，在第一，第二和第五外显子中轴承回弓插入（图。3.a），由PCR进行基因分型。将纯合植物的剪切切割成插入事件进入ljnpf2.9基因在无菌条件下培养，然后转移到生长室进行种子生产。对30,086,034、30,071,286和30,007,925品系纯合植株的插入位点进行端点RT-PCR分析，未检测到ljnpf2.9根部的全尺寸mRNA，因此，被认为是缺虫突变体（图。3.b).株系30007925的纯合植株(从这里开始称为ljnpf2.9-1)，并对不同生长条件下的生物量表型进行了初步表征。本品系的两株纯合突变株已被选中进行分析(ljnpf2.9-1/一个ljnpf2.9-1/ b在无花果。3.b）并且由于它们的生长表型没有显着差异，因此在本研究中汇集了用所选单独的突变体获得的数据。Ljnpf2.9-1在1mm，5mm和10mm Kno存在下生长的突变体_3.在播种后2周和3周，对秧苗长度和鲜重进行浓度标记。茎长ljnpf2.9-1与野生型相比，突变体没有表现出任何显著差异。4.a, b)，而鲜芽重则有显著差异(图。4.C，D）。拍摄的鲜重ljnpf2.9-1突变体与野生型相比显著增加(20-28%)，且在整个外部KNO范围内保持观察到的增加_3.浓度（图。4.C，D）。因此，确认ljnpf2.9突变真的负责增加的枝重，已经测试了相同的表型对从线30,071,286和30,086,034（此处称为称为LJNPF2.9-2和ljnpf2.9-3)在10mm KNO存在下生长_3.．如图1所示。5.，在所有测试中，拍摄重量/长度比的显着增加ljnpf2.9中的LORE1插入ljnpf2.9基因是观察到的表型的因果突变。敲除突变之间的因果关系ljnpf2.9基因和所观察到的表型通过对LORE1插入的杂合子分离体的分析得到证实ljnpf2.9基因，从本研究分析的三个插入系中的两个获得。这些杂合子植株没有表现出较高的茎长比，也无法与野生型植株区分开来(数据未显示)。重要的是，增加的芽长比ljnpf2.9只有在kno时才观察到突变体_3.用作N源，因为既没有对谷氨酰胺也没有检测到相同的表型，也不是琥珀酸铵培养基（图。5.)．

为了确定在KNO存在时与体重增加相关的茎部解剖特征_3.（图。4.和5.)，我们还比较了野生型和ljnpf2.9突变体。野生型和突变型植株在播种后生长2周，在10 mM硝酸盐作为唯一氮源的情况下，从第1、2和3号三叶草中收集充分展开的离体叶片进行分析。平均叶面积ljnpf2.9-1和−3与野生型相比，植物显着增加17至22％（图。6.a和附加文件5.:图S3)。此外，为了验证突变株叶片大小的增加是否是细胞异常扩张或细胞数量增加的结果，我们检测了相应的野生型和野生型三叶树表皮细胞层近轴和近轴层的细胞大小ljnpf2.9-1植物。测量结果见图。6.B表示叶表皮细胞ljnfp2.9-1突变体比野生型更大，这表明对细胞大小的控制有影响(图。6.b).在附加文件中6.：图S4显示了在野生类型和野生类型上进行的叶子形态分析的一个例子ljnfp2.9-1突变体对应的三陆。表皮细胞覆盖相同野生型的表皮细胞的比较ljnfp2.9-1叶面积，允许可视化的明确削减增加的大小观察叶突变。测量和统计分析报告在附加文件中7.:表S3。在叶片突变体中，细胞大小的增加被记录下来(图。6.b）通过计数指示每平方区域的叶片突变体表皮的较少数量的细胞来确认。

LjNPF2.9是一个硝酸盐转运体

报告了14个成员中有6个的低亲和力运输能力答:芥NPF2进化枝(1那42］．为了检查是否ljnpf2.9编码硝酸盐转运体，在体外转录ljnpf2.9互补RNA (cRNA)被注射到非洲爪蟾蜍光滑的功能测定的卵母细胞。CRNA注射后两天，已经测试了卵母细胞的硝酸盐¹⁵不_3.pH 5.5和6.5的摄取活性以10mm的浓度。ljnpf2.9cRNA-injected非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞已被比较ATNPF6.3.注射的。两批卵母细胞均呈npf依赖性¹⁵不_3.在10 mM处积累，在pH 6.5时仅略有减少(图6)。7.)．LjNPF2.9表现出的摄取活性非洲爪蟾蜍光滑的异源系统表明生理低亲和力没有_3.这位运输车在莲藕中进行的运输活动。

ljnpf2.9突变体的芽中硝酸盐含量增加

观察到硝酸盐的运输能力非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞以及其根部腹部和韧皮内的局部表达，促使我们推测ljnpf2.9可以参与根部和射击之间的硝酸盐分布，这是与增加的射击生物量相关的功能答:芥[14］．将野生类型和野生型含量与野生类型和ljnpf2.9在播种B5衍生培养基后4天转移突变植物，10毫米KNO_3.作为唯一的N源。转移后3周对硝酸盐含量进行评分。树叶ljnpf2.9与野生型植物相比，突变体显示2-3.5倍的硝酸盐含量增加（图。8.a)并且这种表型在根组织中显著地逆转(图。8.b).突变体叶片中硝酸盐含量的增加在同步的时间过程实验中得到了证实l .对虾在谷氨酰胺1 mM存在下生长2周的幼苗转移到10 mM的KNO上_3.1、2、4天。图2中所示的结果。8.C表示野生类型的叶片中硝酸盐的渐进积累ljnpf2.9-1在突变基因型的芽中具有显着增加的硝酸盐含量的植物。

依赖于硝酸盐的瘤瘤抑制途径不会改变ljnpf2.9突变体

高的外部硝酸盐浓度通过作为信号(局部效应)和营养(全身效应)对结瘤产生抑制作用[19那21那22那24那43那44］．同样，结瘤豆科植物也能迅速感知到外界的高硝酸盐浓度，从而对固氮酶活性产生抑制作用[45］．以检查硝酸盐积累检测到的芽ljnpf2.9突变体可以影响外部硝酸盐对结节形成和功能的浓度依赖性抑制作用，我们已经比较了在不同外部硝酸盐浓度范围内生长的野生型和突变植物的结节数和氮酶活性。图2中所示的结果。9.在外界硝酸盐浓度逐渐增加的情况下，结核形成抑制曲线相同。同样，乙炔还原活性(ARA)测定如图所示。9.B没有揭示野生型和不同突变基因型之间的N-固定活性的显着差异。

氮利用效率（NUE; kg产量/施用的kg n）是一种至关重要的农艺性状，必须在农产科学种植中改善，平均不到50％的大量肥料，提供给农业土地以达到最大收益率达到最大收益率植物 [46那47］．大约一半的施用的n损失到空气和水中，或者在水生环境，地下水和大气污染的戏剧性后果中丧生。nue由两个主要成分组成：i）吸收效率，植物从土壤中占用给定的矿物质;ii）利用效率，植物使用矿物质如硝酸盐产生生物质的能力。然而，许多具体的生理性状可以在这种复杂的网络中起重要作用，例如整个植物身体的硝酸盐的分布和分配。特别地，较高的NUE与促进硝酸盐的分配与植物的空中部位相关联[48]，最近许多报告强调了npf在改善作物NUE方面的潜在作用[49那50那51］．

我们在这里报告一个成员的函数特性l .对虾NPF家族，LjNPF2.9，在硝酸盐在根中的向下运输以及敲除突变对控制根瘤形成和功能的共生硝酸盐依赖途径的影响中发挥积极作用。

表型分析是在三个独立的个体上进行的ljnpf2.9突变体(无花果。3.)从集合中分离出来的l .对虾Lore1线[39那40那41]，显示相同的表型。在硝酸钾浓度的浓度为1mm至10mm的浓度的浓度植物中被记录在突变植物中，记录了枝条重量的显着增加（图。4.）在谷氨酰胺和琥珀酸铵作为唯一N来源的情况下，未观察到这种改进的芽生物量表型未观察到（图。5.)．此外，ljnpf2.9与野生型植物相比，突变体茎部和根部的硝酸盐含量呈负相关关系，茎部和根部的硝酸盐积累量分别增加和减少。8.)，说明LjNPF2.9通过介导硝酸盐向下运输到根系，在根-茎分配平衡中发挥作用。值得注意的是，增加的地上生物量ljnpf2.9突变体是一种非常有趣的表型特性，因为拨备更多的缺点_3.^-与植物中较高的NUE有关[48］．硝酸盐依赖表型的生理意义ljnpf2.9通过在中进行的生化表征进一步加强突变体非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞，其中ljnpf2.9表达在高硝酸盐浓度存在下触发硝酸盐的运输能力（图。7.)．这种转运能力与位于LjNPF2.9第一个跨膜螺旋中的ExxER/K基序的存在一致(Additional file)3.图S1)，它不同于作为同向体的分支2的成员(NPF2.8-2.14英寸答:芥）来自属于Subclade NPF2A的（NPF2.1-2.7答:芥)，在异源系统中显示出被动运输能力[52那53］．虽然我们不能排除LjNPF2.9也可能转运除硝酸盐以外的其他底物，但硝酸盐依赖的生长表型(图。5.)和根组织中硝酸盐含量的变化ljnpf2.9突变体(无花果。8.)可以清楚地与在中观察到的摄取活动有关非洲爪蟾蜍光滑的注射了卵ytesljnpf2.9crna（图。7.)．我们的表型表征还包括植物解剖叶状性状的分析，因为它已知这些可能响应于N可用性而改变[54那55］．图中所示的分析。6.表明在硝酸盐存在下观察到的芽生物质的增加与细胞尺寸扩大有关。可以将芽硝酸盐含量增加和细胞扩张的分子机制l .对虾在这项工作中尚未进行研究，但硝酸盐诱导的途径，如碳代谢和/或细胞分裂素响应基因可能涉及[56那57那58］．

硝态氮积累增加，在茎部观察到ljnpf2.9根组织中的突变体和逆转的硝酸盐含量可以通过LJNPF2.9的Xylem卸载或韧皮荷载函数解释。在答:芥这AtNPF7.2基因(AtNRT1.8)在根中被硝酸盐诱导，并在木质部薄壁细胞中表达，控制从木质部汁液中去除硝酸盐[13那59］．ATNPF7.2的破坏在镉（降低根/芽硝酸盐含量比率下降）中改变植物组织中的硝酸盐分布，表明在应激条件下的根系中的硝酸盐中的作用[13］．还报告了类似减少的根/芽硝酸盐含量atnpf2.9突变体[14］．ATNPF2.9（AtNRT1.9)被硝酸盐轻微诱导，并在根韧皮部的伴生细胞中表达，在根韧皮部渗出液中检测到硝酸盐含量下降，表明它是硝酸盐负荷的促进者。因此，AtNRT2.9负责将硝酸盐装载到根韧皮部向下运输，在根韧皮部，这种装载活动的质外体硝酸盐来源可能来自维管薄壁细胞的外排或木质部流的泄漏。值得注意的是，在LjNPF2.9的例子中，AtNPF2.9基因的破坏导致根/茎硝酸盐含量比的降低和茎生物量的增加，这在铵和谷氨酰胺作为氮源存在的情况下没有观察到[14］．表示的分析ljnpf2.9中的优先表达式l .对虾根(图。1)，其局限于根维管中柱鞘细胞层和根维管中柱的韧皮部结构(图。2)．这与LjNPF2.9作为AtNPF2.9的激素调控木质部到韧皮部硝酸盐通量的结论是一致的。尽管人们普遍认为木质部是根-茎间硝酸盐长距离运输的主要途径，但也有一些研究报告称，大量硝酸盐进入韧皮部汁液(0.59 - 8.1 mM) [60那61]并提出了一种协调的Xylem-和韧皮介导的硝酸盐运输，在不同的发育阶段适当地分布该营养素，以确保有效的植物生长[2］．

在豆科植物中，营养状况和随之而来的氮需求是一个信号，可能通过系统信号通路控制结瘤[23那24］．特别地，由一般营养状况控制的负反馈减少了在高N条件下生长的植物的染色能力[23］．在我们的实验条件下，对KNO的反应逐渐增加_3.外部浓度不会改变ljnpf2.9突变体与野生型植物相比(图。9.a），表明在突变体的芽中积聚的较高量的硝酸盐未改变外部硝酸盐的剂量依赖性抑制作用。必须进一步研究该结果，但可能是由于硝酸盐的储存增加，典型的植物反应，以应对影响外部营养浓度和能源的环境条件的波动[48那62那63］．

目前的数据表明ljnpf2.9该基因参与硝酸盐向根的向下运输，该基因功能的破坏决定了与较高硝酸盐积累量相关的茎生物量的显著增加。重要的是，这一芽型性状不会干扰共生表现在根瘤形成和固氮酶能力。这是豆类作物氮素利用改良的勘探研究的重要成果。

植物材料及生长条件

所有的实验都是用Lotus对虾生态型B-129 F12 GIFU [64那65］．GIFU种子最初由P. Gresshoff(昆士兰大学，AU)提供，然后在我们的植物室设施中繁殖。在光强为200 μmol.m的生长室内培养⁻².sec⁻¹在23°C时，16 H / 8 H日/夜周期。已经如Rogato等人所述进行了表型表征。[66］．固体生长培养基的组成与Gamborg B5培养基相同[67除了那个_4.）₂所以_4.了解_3.省略，代之以所需浓度的合适N源。必要时在培养基中加入KCl，以替代相同浓度的钾源。含有维生素(Duchefa目录G0415)的培养基用2.5 mM 2-(N-morpholino)乙烷磺酸(MES;Duchefa, MIS03.0250)和pH调整到5.7 KOH。发芽后，不同步的幼苗被丢弃。

M. Loti.接种过程如Barbulova等人所述[68］．接种实验用菌株R7A，在含利福平(20 mg/L)的tyrl液体培养基中培养。

乙炔减少活性的测定（ARA）

D 'Apuzzo等人和Calderon等人对乙炔还原活性分析进行了描述[69那70］．将数目相当的离体根置于10ml玻璃瓶中。小瓶用薄膜密封，并注入1ml乙炔(C₂H₂：使用自动进样器注射器空气= 1：9 V / V）。在25℃温育30分钟后，从密封的小瓶中收集1ml样品，通过气相色谱仪的隔膜（PerkinElmer Clarus 580）注入该量，然后测量所获得的乙烯峰的面积。分析后，结节从显微镜下方的根样品中脱离，以小心地将这些与根材料分离并共同重量。结节的乙炔还原活性作为通过使用下式（μmol×1 / h×1/1/11×1/1/1/1 / g Nod）通过使用下式计算的乙烯的量：乙烯面积x结节重量（g）⁻¹x t (h)⁻¹× 4,12 / 8,880,000，其中4.12是在20°C、1atm下1ml气体混合物中μmol的乙烯。

硝酸盐含量测定

根、茎标本称重后放入−80℃冷冻。用组织裂解器(Qiagen, 85,220)在29 Hz/ 1 min 30 s下研磨冷冻样品，制备粗提取物。粉末立即在H中再悬浮₂O (6ml H2O/gr鲜重)，旋转13000 rpm离心回收上清液。叶和根提取物中硝酸盐含量的比色法测定遵循Pajuelo等人所描述的程序[71］．将浓硫酸中的5％（w / v）水杨酸的两百微升加入到50μl的等分试样中，从粗提取物中留下，在室温下留下20分钟。向反应混合物中加入NaOH（4.75ml 2 N），冷却后405nm的吸光度读取。已知数量的纳米校准曲线_3.（Sigma，74,246）溶解在标准提取缓冲液中用于分析测定。在没有水杨酸的情况下设置对照。

叶的形态学分析

叶面积用ImageJ软件测量[72］．表皮细胞层的Adaxial和Babaxial椎板的程序或细胞尺寸测量如下：首先，在入射光下获取针对每个叶片的三个微观视场（1.0mmx0.7mm）的图像的图像。然后，使用image-pro premiere软件（Media Cyber​​netics，Inc。）进行单元格计数www.mediacy.com.）应用流域算法[73以便将相邻的部分分开。选择具有平均单元面积的圆的等效直径作为单元大小。

l .对虾转换程序

二进制载体是etettroporated根出杆菌根草杆菌15,834株[74］．答:rhizogenes介导的l .对虾已按照Martirani等人所述进行转型。[75］．在Santi等人中描述了复合植物的接种，[76］．

质粒制备

这pLjNPF2.9-gus通过以下方法制备了ATG密码子上游1038 bp的T-DNA结构体:在基因组DNA上获得了PCR扩增片段萨尔I位点与含有BAMHI网站(附加文件1:表S1)。并随后将扩增子括起来萨尔我- - - - - -BAMHI片段进入pBI101.1载体[77]获得翻译融合质粒pss1。

质粒表达非洲爪蟾蜍光滑的已经以下列方式制备了卵母细胞：由结节RNA制备的cDNA与含有的正向引物扩增XbaI位点与含有后III网站(附加文件1:表S1)。1920 bp的碎片经双重消化Xba我和后III，已亚克隆到含有5 ' -UTR和3 ' -UTR的pGEMHE质粒非洲爪蟾蜍光滑的β-球蛋白基因[78),浓缩版Xba我- - - - - -后III获取pGEMHE2.9。的正确编码序列ljnpf2.9已通过测序得到验证。

LjNPF2.9在非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞

pgemhe2.9已经线性化NHE.使用mMessage mMachine T7-ultra Kit (Life Technologies)在体外转录I和capped mRNA。卵母细胞的制备见[79］．手术获得的非洲爪蟾卵母细胞经1 h胶原酶处理(1 mg。ml−1,IA型，Sigma化学，圣路易斯，MO)在一个含有(在mM): 82.5 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2, 5 HEPESNaOH (pH 7.4)的介质中。选择V期和VI期卵母细胞置于nd96修饰的培养基中，该培养基含有mM: 2 mM KCl, 96 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 2.5 mM丙酮酸钠，pH 7.5，并添加硫酸庆大霉素(50 mg.mL-1)。将20 ng的互补RNA (cRNA)注入卵泡后的卵母细胞，储存在上述改良ND96培养基中。注射后2天，10个批次的注射卵母细胞孵育于1 mL pH 5.5添加10 mM的ND96溶液中¹⁵不_3.提供K.¹⁵不_3.18°C保存2小时。然后卵母细胞在15ml冷修饰ND96溶液中冲洗5次。对2个批次的卵母细胞进行总氮含量和原子%分析¹⁵N通过连续流量质谱法进行丰富，使用Euro-EA Eurovector Eleararar Analyzer与Isofrime Mass Spector（GV Instruments，Carlements，Carleme，UK）相结合。卵母细胞注射了ATNPF6.3.以cRNA和水分别作为阳性和阴性对照。结果在pmol.oocyte-1.min-1中表达。

定量实时RT-PCR

Real time PCR采用MJ Research (MA, USA)的DNA Engine Opticon 2系统，使用SYBR监测dsDNA合成。Ferraioli等人描述了这个过程[80］．泛素（无论在哪里)基因(AW719589)已被用作内部标准。用于qRT-PCR的寡核苷酸列在附加文件中8.：表S4。

Lore1线分析

LORE1线30,071,286,30,086,034和30,007,925获取Lore1.收藏 [38那39那40］．分离群体中的植物已经进行了基因分型和在附加文件中列出的引物测试的纯合植物的表达2：表S2。在PCR基因分型之后，通过7天暴露于0.1mg / L萘酸（NAA，Duchefa目录G0903），在轴烯条件下培养纯合植物的噬菌体培养。

组织化学的格斯分析

按照Rogato等人的描述对整个植物和切片材料进行组织化学染色[81那82］．

系统发育研究

使用最大判定方法推断出进化历史。显示了长度= 17,866的最令人瘫痪的树。一致性指数为0.358838（0.355701），保留指数为0.621797（0.621797），综合指数为所有网站和括约肌信息位点（括号）。使用具有搜索级0的子树修剪重新重建（SPR）算法获得MP树，其中通过随机添加序列获得初始树（10重复）。该分析涉及139个氨基酸序列。最终数据集共有768个职位。进化分析在兆X中进行[83那84］．

统计分析

使用VassarStats方差分析程序进行统计分析(http://vassarstats.net/)．为不相关变量的比率(y = x₁/ x₂)。5.，给出标准差(SD)的表达式如下:[SD(y)/y]² = [SD (weight)/weight]² + [SD (length)/length]²．图2中报告的标准误差。5.然后计算SE = SD /（N-1）^1／2．

所有支持我们发现的数据都包含在手稿中。结构和种子可根据MC的要求提供。

答:芥：

拟南芥

阿拉：

乙炔还原试验

CLC:

氯化物通道

格斯A：

β-glucuronidaseA

kDa:

Kilodalton

公斤:

公斤

l .对虾：

Lotus对虾

Lore1：

Lotus Retrotransposon1

M. Loti.：

Mesorhizobium洛蒂

n：

氮

NPF：

硝酸盐/肽转运蛋白

NRT2:

硝酸盐转运体

自虐:

氮气使用效率

o .漂白亚麻纤维卷：

奥雅萨苜蓿

QRT-PCR：

定量ReverseTranscription-Polymerase-Chain-Reaction

斯拉克：

缓慢激活阴离子通道

SNF：

共生氮固定

我们感谢Sara Salvia和Danilo Maiello进行技术援助。

This work was supported by grants from grants from the Italian Ministery of the Economic Development (MISE), Sviluppo di nuove piattaforme molecolari/cellular per l’identificazione e lo sviluppo di principi attivi innovative, sostenibili e di origine natural per l’applicazione cosmetica-F/050005/00/X32, from the Italian Ministry of Education (Progetti di Rilevanza Nazionale, PRIN 2010/2011, PROROOT, Prot. 20105XLAXM) with a post-doctoral fellowship to VTV, from Rete delle Biotecnologie in Campania, Progetto Bio Industrial Processes – BIP – CUP B25C13000290007 and from the Agence Nationale de la Recherche to BL (ANR-14-CE34–0007-01-HONIT with a post-doctoral fellowship to MN). The funders had no role in the experiment design, data analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

隶属关系

1. 生物科学研究所和Bioresources，IBBR，CNR，Via P. Castellino 111,80131，那不勒斯，意大利

   Stefano Sol, Vladimir Totev Valkov, Alessandra Rogato & Maurizio Chiurazzi

2. BPMP，蒙彼利埃大学，CNRS, INRA, SupAgro，蒙彼利埃，法国

   Mélanie Noguero & Benoit Lacombe

3. Istituto per i Sistemi Agricoli e Forestali del Mediterraneo, ISAFOM, CNR, Via Patacca 85, 80056，意大利埃尔科拉诺

   Laura Gargiulo和Giacomo Mele

贡献

VTV，AR，BL，MC设计了实验，SS，VTV，Mn，LG，AR进行了实验，SS，VTV，AR，MN，LG，GM，BL，MC分析和解释了数据，MC写了稿件。所有作者都已读过并批准了稿件。

相应的作者

对应于Maurizio Chiulazzi.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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重印和权限