栽培草莓重复结果的上位抑制证据

背景

消费者全年都会购买新鲜草莓。延长草莓新品种的结实期是一个普遍的育种目标。了解重复结果的遗传是提高育种效率的关键。几个独立的研究小组使用多种基因型和分析方法都确定了草莓中与重复结果相关的单个基因组区域。在马里兰州Beltsville的美国农业部-农业研究局(USDA-ARS)草莓育种项目中，该区域的标记被用于评估育种亲本。

结果

重复结果的标记鉴定出了一次结果的基因型，但没有鉴定出重复结果的基因型。23个具有重复结果标记的亲本中有11个实际结果过一次，这表明至少有一个额外的位点在上位性上抑制重复结果。当使用单基因模型时，结合使用亲本表型和标记谱不能可靠地预测家系分离比率。对所有可能的表型和标记-剖面组合与假设的显性或隐性抑制基因座进行预期分离比的计算。在四个家系中观察到作用于一个上位性抑制基因位点的特异性分离率。两个家系的分离比最好的解释是一个显性抑制因子作用于所测位点，而对于另外两个家系，则是一个隐性抑制因子。并不是所有观察到的比例都可以用一种或另一种模型来解释，当比较具有共同父母的多个家庭时，没有预测的共同父母的基因型会导致所有观察到的分离比率。

结论

考虑到本研究和其他研究中的所有证据，商业草莓的重复结果主要是由一个单一位点上的显性等位基因控制的，之前由多个组绘制。至少有两个额外的基因，一个显性和一个隐性，存在上位性抑制重复结果。环境效应和/或不完全外显可能通过抑制位点影响表型，而不是主要的定位位点。其中一个显性抑制因子只在植物从种子开始发芽的第一年起作用，而不是在植物经历了冬天之后。

草莓(草莓属×ananassa杜鹃花(Duchesne ex Rozier)是美国一种重要的经济作物。2014年美国草莓价值23亿美元，在非柑橘类水果中排名第三，仅次于葡萄(63亿美元)和苹果(35亿美元)。1］．对种植者来说，草莓也是一种很有价值的作物，全国平均每公顷毛收入为110,051美元，从俄勒冈州的每公顷20,626美元到加利福尼亚州的每公顷119,816美元不等。草莓的高价值部分是由于它们的受欢迎程度。草莓在美国新鲜市场上的购买量排名第五[2]，从2002年到2013年，年人均消费量从2.1公斤稳步增长到3.6公斤[3.］．草莓极易腐烂，不能新鲜储存很长时间[4]，但消费者全年都在购买新鲜草莓。为了实现全年销售，草莓在各种气候和生产系统中种植。尽管美国大部分草莓都产自西海岸，但冬季草莓主要生长在佛罗里达州，而且几乎每个州都有本地草莓供直接销售。

几个草莓育种项目通过在育种目标中加入延长结果期来满足长达一年的生产需求。世界各地的育种家和其他研究人员将花期和结果期延长的植物称为昼中性、长日、常熟、永久结果、剩余和/或重复结果。目前尚不清楚这些是否确实是由同一基因控制的相同性状，并且受环境条件的影响相似，因为还没有研究使用足够的基因型和环境多样性来做出这一确定。

根据开花和结果的习惯，栽培草莓在美国分为两种主要类型:短日草莓(SD)和日中性草莓(DN)，在目录和网页上通常拼写为“dayneutral”。短日型基因型，在北方各州也被称为六月型，在短日长(< 14小时)或低于15°C的温度下启动花蕾。这些植物一年只开一次花，因此只有一个收获期。据报道，“日中性”基因型对光周期不敏感，只要温度适中(昼夜低于30/26°C)，在任何光周期条件下都能开花[5，6，7］．继续生产至少同样依赖于温度[6，8，9，10]，因此，在行业之外，将具有这种特性的植物称为“日中性植物”是不恰当的。“重复结果”这个术语并不意味着对环境或生理控制性状的理解，它比“残留”的理解更广泛。

由于任何性状的遗传知识都有助于提高育种效率，一些遗传学研究已经解决了重复结果的遗传问题。有人认为在栽培草莓中重复结果是由单一基因控制的，或隐性的[11或占优势的[12，13，14，15］．然而，已有证据表明，控制八倍体草莓重复结果的基因数量因基因型而异。15］．一些定量性状位点(QTL)定位项目确定了多个与重复结果相关的QTL，这些QTL被量化为开花周数[9，16]，尽管一些早期的尝试使用绘图软件，但还没有办法测试QTL的显著性，并且可能已经报道了一些“虚假”QTL。通过评估美国几个州(密歇根、明尼苏达州、俄勒冈州、加利福尼亚州和马里兰州)的单个无性繁殖映射种群，强调了环境对重复结果表达的影响[9］．有几个后代在气候温和的加利福尼亚和俄勒冈州反复结果，但一次在炎热明亮的马里兰州结果。两项研究[16，17]在单个群体中定量和定性地评估重复结果，用这两种方法将性状映射到同一基因组区域。多个研究人员使用不同的映射群体在同源组IV (HGIV)中同一连锁组(LG)上发现了相同的单一位点，其显性等位基因赋予重复结果[18，23，24，25］．这些图谱研究没有共同的亲本，但可能都有一个重复结果性状的共同祖先。这个祖先，一个野生的f . virginianassp。glauca(寺庙)。Staudt草莓植物采集于美国犹他州盐湖城南部的Wasatch山脉，在许多育种项目中已被用作重复结果的来源，以生产新品种[26］．

本研究的目的是确定与这一集体确定的重复结果基因组区域相关的分子标记是否能够正确预测马里兰州Beltsville的USDA-ARS草莓育种计划池中育种家族的表型和分离率。该育种计划产生了' Delmarvel ' [27]，它被用作一次结果的亲本，由重复结果的亲本“Selva”授粉，以绘制重复结果的地图[18］．贝尔茨维尔计划也制作了《致敬》[28]，这种重复结果的亲本由“Honeoye”授粉，并在其他研究中用于绘制重复结果[9，17］．《贡品》的起源可以追溯到野外f . virginianassp。glauca在世界各地的栽培品种中被认为是重复结果的来源的植物[28］．因此，可以合理地假设所映射的重复结果基因组区域与Beltsville计划育种池起源于同一来源。

开发重复区SSR标记

在此之前，与重复结果最密切相关的SSR标记是FxaACA02I08C -145S，距离性状[18］．因此，我们利用FxaACA02I08C的引物序列，在基因组中寻找序列相似的区域F．×ananassa参考基因组。近似字符串匹配算法在脚手架FANhyb_rscf00000019.1中发现了序列相似性，该脚手架被选择用于进一步分析。为了确定其他区域可以作为重复结果的靶点，设计更多的引物，其他SSR标记(表1)先前与性状有关的[17，18]被用来搜索F。×ananassa参考基因组。使用这种方法，7个不同的引物被定位到7个支架上:6个支架包含与3个引物相似的序列，一个支架包含与2个引物相似的序列。总之，近似串匹配算法发现了7个支架，可能来自映射的重复结果基因组区域。对这7个支架进行SSR基序搜索，并开发了36对引物来扩增最有希望的重复区域(附加文件1:表S1)。

设计的36对引物中有6对(FANhyb19.1-7、FANhyb19.1-8、FANhyb19.1-9、FANhyb19.1-12、FANhyb45.1-5、FANhyb758.1-3)未产生任何扩增产物。从亲本中扩增的30对引物中，3对(FANhyb19.1-5、FANhyb611.1-1和FANhyb682.1-2)仅在‘Delmarvel’בSelva’群体中有多态性，2对(FANhyb19.1-13和FANhyb64.1-1)仅在‘Tribute’בHoneoye’群体中有多态性，13对在两个群体中都有多态性。这些引物对扩增了‘Delmarvel’בSelva’群体中的61个产物，但其中只有33个符合可接受的分离比，用于构建连锁图谱。引物对FANhyb19.1-1、FANhyb19.1-3、FANhyb19.1-4、FANhyb19.1-6和FANhyb19.1-15中的产物映射到HGIV中与重复结果相关的区域，而引物对FANhyb611.1-1、FANhyb682.1-1、FANhyb45.1-1、FANhyb45.1-2、FANhyb758.1-1、FANhyb758.1-4、FANhyb64.1-1、FANhyb64.1-2、FANhyb64.1-4和FANhyb64.1-4中的产物映射到与重复结果相关的其他HG(附加文件)2:表S2)。FANhyb19.1-15-121S和FANhyb19.1-4-189S分别在8.4 cM和10.1 cM处离重复结实区最近。1)．与HGIV不同，映射到HG的扩增子未用于' Tribute ' × ' Honeoye '群体的基因分型。使用8对“Tribute”和“Honeoye”引物扩增了32个产物，其中12个与群体使用时符合预期的分离比，并用于连锁分析。这些产品中的四种被映射到与重复结果相关的区域(“Tribute”的HG IV;无花果。1)，其余部分映射到HG IV，但在与该性状无关的LGs中。FANhyb19.1-15-121 T和FANhyb19.1-4-189 T是距离重复结果1.9 cM处最接近的标记。

在‘Capitola’× CF1116定位群体中与重复结果相关的8对SSR引物[24在“Delmarvel”דSelva”群体中扩增了59个产物(34个符合预期分离比)，在“Tribute”דHoneoye”群体中扩增了55个产物(31个符合预期分离比)。所有这些标记都映射到HGIV。Bx089-236S和Bx089-236 T分别在' Selva '和' Tribute ' HGIV重复结果的12 cM和6.1 cM处，是这组标记中距离最近的标记。1)．Bx089是' Capitola ' × CF1116定位群体中与重复结果联系最密切的两个标记之一[24］．

基于' Delmarvel ' × ' Selva '和' Tribute ' × ' Honeoye '居群的连锁图结果(图2)。1)，选择19个与重复结果密切相关的SSR标记，对育种科和商品栽培品种的亲本进行了检测(表2 - 1)1)．

比较亲本表型和标记谱

共有32个亲本草莓基因型，加上映射亲本和其他育种选择，被鉴定为19个与重复结果相关的标记(表2)2，附加文件3.:表S3)。对于所有亲本，无论开花模式如何，至少有4对引物扩增了与重复结果相关的产物。对于一个重复结果的亲本B2411RB，所有引物对都扩增了与重复结果相关的产物。如果所有引物都扩增了与重复结果相关的产物，特别是那些具有最高Kruskal-Wallis测试值的引物，则被认为是亲本具有重复结果表型的强烈迹象。在14个亲本中，除一对引物Bx250-242外，其余引物均扩增了与重复结果相关的产物，但在多年测试中，其中只有一半的引物在田间具有重复结果表型;因此，与重复结果相关的分子剖面不能可靠地预测田间的重复结果表型。Bx250-242在‘Delmarvel’בSelva’群体中没有映射到重复结果，在‘Tribute’בHoneoye’群体中也没有映射到重复结果。

在“Tribute”דHoneoye”群体中，使用Kruskal-Wallis非参数检验每个标记与开花周数(连续性状)之间的相关性时，发现有6个标记与重复结果关系最密切:FANhyb19.1-15-121、FANhyb19.1-4-189、Bx215-148、ChFaM148-184、Bx064-238和Bx089-236。不论开花模式如何，对育种亲本的标记表型进行检测，FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189要么都存在，要么都不存在，表明彼此的基因组非常接近(附加文件)3.:表S3)。这两个标记都来自同一个支架，FANhyb_rscf00000019.1，(附加文件1:表S1)，间隔18399个碱基对。重复结果表型的9个亲本均有标记FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189，除2个外均有标记Bx215-148。在此之前，Bx083_206和Bx215_131这两个相距仅7.3 cM的基因被推测为控制重复结果的基因的侧部，但在17个具有重复结果表型的基因型中，只有14个预测重复结果[24］．在本研究中，7个亲本中均存在标记FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189(表明重复结果)，而标记Bx215-148(没有扩增产物表明没有重复结果)缺失。在这种情况下，3个父母重复结果，4个父母一次结果。同样，FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189标记的存在并不是育种亲本重复结果的可靠预测因子。重复结果基因可能位于这两个标记所覆盖的区域和标记Bx215-148之间。Bx215-131是先前与重复结果密切相关的两个标记之一[24]，扩增子大小的差异很大程度上可能是由于当前研究中为了节省成本和提高腺苷酸可靠性而对引物进行了修饰。Bx215标记的引物序列在支架FANhyb_rscf00000019.1中没有序列相似性。Bx215引物序列在支架FANhyb_rscf00000331.1中具有序列相似性。这些结果表明，这两个支架可能是同一染色体的一部分，或者至少是同一同源组，并强调需要额外的努力来填补空白和连接支架，以实现“测序”基因组所提供的潜力。

虽然育种亲本中存在与重复结果有遗传关联的标记并不表明该育种亲本在田间是否具有重复结果的表型，但至少有一些标记的缺失可靠地表明该植物具有一次结果的表型。如果在8个亲本中，FANhyb19.1-15-121、FANhyb19.1-4-189和Bx215-148这3个标记均不存在，则该表现型在该田间曾经结果。这与47个分子特征的“季节性开花”基因型的发现一致，Bx083_206和Bx215_131都缺失[24］．同样，只有一次结果的表型可以用SNP标记来识别[25］．并且，虽然Bx215_128观察到100%的阴性预测值，但仅观察到85%的阳性预测值[29］．在目前的研究中，对于一个一次结果的选择，标记FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189都不存在(没有扩增产物表示一次结果)，而标记Bx215-148存在(扩增产物表示重复结果)，表明重复结果与fanhyb19.1衍生的标记之间的关联比bx215衍生的标记更密切。更重要的是，在这个区域缺乏标记比存在预测重复结果的标记更可靠地预测一次结果。

预测家庭的预期隔离比率

被评估的31个家庭的家庭规模从56到130不等，平均规模为117个，只有两个家庭的后代少于100个(表2)2)．对于大多数家族，观察到的分离可以拟合多个密切相关的分离比。例如7:9 vs 3:5, 13:3 vs 3:1 vs 5:3, 1:1 vs 7:9。在这些家族中，从所有可能的分离比率得出的遗传假设被认为是有效的。从2016年重复结果苗圃中选择24株。13株存活下来，并生产了用于第二年观察植物繁殖的植株。与前几年第一年开花育种选择一样，2016年所有13个选择在2017年夏季和随后的夏季反复开花。

基于单位点模型，其中显性等位基因赋予重复结果，也表现为在第一年开花和结果，来自两个曾经结果的父母的家庭预计不会包含在第一年开花的个体。2个一次结果亲本(B2472 × B1031)中仅有1个家系第一年未开花个体，且双亲均存在重复结果标记。由一个重复结果的亲本和一个一次结果的亲本组成的家系被预测要么包含半第一年开花的后代(如果重复结果的亲本是杂合的)，要么包含所有第一年开花的后代(如果重复结果的亲本是纯合显性的)。18个系系由重复开花的亲本和一次开花的亲本杂交而来，但其中只有7个系系有半开花的子代。无论表型或标记谱如何，没有家系只包含第一年开花的子代。来自两个重复结果亲本的家系被预测包含所有第一年开花的后代(如果亲本一方或双方都是纯合子显性)，或第一年开花的后代数量是不开花的三倍(如果父母双方都是杂合子)。正如没有一个科系包含所有第一年开花的后代一样，有三倍于第一年开花后代的科系也没有一个来自于两个重复开花的亲本。基于已知亲本表型的一种可能的预测分离比与31个育种家族中仅8个的观察分离比相同(表2)2)．因此，观察到的分离比与亲本表型预测的分离比一般不支持单位点理论。

当使用单基因座模型通过标记谱预测家系分离比时，一个亲本的标记谱发生冲突(重复结果座一侧的标记表明亲本是重复结果子，另一侧的标记表明亲本是一次结果子，如附加文件所示3.:表S3)，两个选项都被考虑为父(Table . S3)2)．父母有冲突的标记谱和父母有一次结果的标记谱的家庭预测其后代要么第一年全部开花，要么第一年不开花，要么各开花一半(表2)2)．如果亲本具有冲突标记谱，而亲本具有重复结果标记谱，则预测其第一年开花的子代数量要么全部开花，要么半开花，要么是未开花子代数量的三倍(表2)2)．在31个家庭中，只有7个家庭观察到的分离比与基于父母标记谱的可能预测的分离比之一相同(表2)2，附加文件3.:表S3)。当观察到的表型和标记谱一起用于预测分离率时，31个家族中只有4个家族的分离率达到了预测的一个比例(表2)2)．此外，这4个家系来自于至少一个在映射位点具有冲突标记谱的亲本(表1)2，附加文件3.:表S3)，降低了任何解释的可信度。

预测涉及的额外基因座的数量

具有显性等位基因的单个位点可产生重复结果的模型不被观察到的分离率或亲本表型与所映射位点标记谱之间的比较所支持。假设环境条件，如马里兰州的高温，导致具有重复结果标记的个体具有一次结果的表型，这就要求所有具有重复结果标记的个体在马里兰州的高温下始终具有一次结果的表型，而只有大约一半的个体具有这种表型。一个假设，即映射的显性重复结果等位基因在马里兰州的高温中只有50%的外显率，可以解释育种亲本标记谱和表型之间的差异，但不允许该性状已被遗传映射。50%的不完全外显率在作图时表现为性状与位点的完全随机关联。根据定义，基因座和表现型看起来是不相关的。这一假设与两项研究相冲突，这两项研究在马里兰州的两个人群中绘制了这一位点[9，17，18］．同样，对于具有重复结果标记的个体，有一半时间具有一次结果的表型的环境解释，在本研究中对父母进行了数年的测试，并观察了多年的一致表型，这并不支持。解释这种分歧的最简单的情况是存在一个额外的位点，在作图群体中没有隔离，或至少没有检测到，但在一些繁殖群体中隔离。虽然一次结果亲本的标记谱与其表型一致，但许多具有重复结果标记谱的育种亲本具有一次结果表型，这表明有某种物质干扰和抑制了所映射的显性重复结果基因。因此，我们测试了一个具有非加性抑制作用的附加位点的效果。

对所有可能的表型和标记谱组合进行假设分离比的计算，这些组合来自于与显性抑制基因座(81个亲本组合)或隐性抑制基因座(81个组合)组合的映射基因座3.，附加文件4:表S4和附加文件5:表S5)。特异于一个显性抑制位点上的上位性基因的分离比分别为13不开花比3开花，7不开花比1开花。特异于一个隐性抑制基因上位位的两个分离比为3不开花:5开花，7不开花:9开花。

两个家庭(表2)具有最适合于作用于所映射位点的显性上位抑制子的分离比率(表1)．B2475 × B1031和B2488 × B1806的104株和120株幼苗的分离比最适合于不开花与开花的7:1 (p>χ²= 0.2356和0.1675)。次优拟合比率(p>χ²= 0.0415和0.035，分别为两个家系)包括13:3，也表明显性抑制因子，和3:1，这可以解释为显性或隐性抑制因子，父母双方都是一次结果(附加文件)4:表S4和附加文件5:表S5)，但不受单个映射位点的影响。

两个家庭(表2)具有最适合作用于映射位点的隐性上位抑制基因的分离比率。B1776RB × B1031的104株幼苗的分离比最适合未开花与开花比例为3:5 (p>χ²= 0.4178)，比例为7:9 (p>χ²= 0.0379)，两者都与重复结果和一次结果的亲本之间的杂交一致(附加文件4:表S4和附加文件5:表S5)。观察到的比率也符合1:3的比率(p>χ²= 0.0415)，在一次结果和重复结果的亲本之间的杂交中，可以用一个隐性的，而不是显性的抑制基因来解释4:表S4和附加文件5:表S5)，不能仅用映射位点来解释。

B2396 × B1031的104株株系的分离比最适合未开花与开花的比例为3:5 (p>χ²= 0.5434)，其次是7:9 (p>χ²= 0.4890)。不幸的是，在一个隐性抑制基因作用于一个显性位点的模型下，如果双亲都是一次性结果子，那么这些比例就不存在了。观测到的偏析比弱地拟合1:1的比率(p>χ²= 0.0499)，并且可以用显性或隐性抑制基因来解释(附加文件4:表S4和附加文件5:表S5)，但不能仅用所测位点来解释，因为双亲都是一次结果子。

在B2480和B1820的亲本中观察到15:1的分离比，这两个亲本具有一次结果的表型和标记谱(表2)2，附加文件5:表S5)，不能通过单个显性或隐性的上位性抑制位点来预测。当考虑亲本表型和双亲的标记谱时，几个家系观察到的分离比率不能用单一的抑制位点来解释，无论是显性的还是隐性的。

虽然许多观察到的比率可以用一种或另一种模型来解释，但当比较具有共同父母的多个家庭时，没有预测的共同父母的基因型会导致所有观察到的分离比率。这些结果表明，在Beltsville育种计划池中可能存在两个或多个作用于该位点的抑制位点。重复结果受多个位点控制，受环境影响，这是以前在一个定位群体在多个位置进行无性繁殖和评估时提出的[9，16］．在目前的研究中，大约一半的亲本的标记谱和表型之间的差异表明，所绘制的位点不是受热影响的位点。相反，当前研究中涉及的一个或多个抑制位点可能被热激活。

在重复结果只由一个位点上的显性等位基因控制的模型下，如果重复结果的亲本是纯合的，那么一次结果的亲本与重复结果的亲本之间的杂交应该产生全部重复结果的后代，或者如果重复结果的亲本是杂合的，那么一半重复结果和一半一次结果的后代。2008年，36个育种家族从苗木种植到一块田地，并在2008年和2009年夏季进行评估6:表S6)。28个家族是由一次结果和多次结果的双亲杂交产生的。其中两个科在2009年包含了全部重复结果的后代，如果重复结果仅由一个显性等位基因控制，这是有可能的。然而，在2008年，即幼苗种植和首次评估的年份，子代分离和适合率可以用上位性抑制因子(显性或隐性)来解释(附加文件)4:表S4，附加文件5:表S5和附加文件6:表S6)。2009年，这些家族中有19个以1:1的比例分离，如果重复结果仅由一个显性等位基因控制，这也是可能的。2008年，即种植年，这19个科中有14个科的分离比率可以用上位性抑制因子(显性或隐性)来解释(附加文件)4:表S4，附加文件5:表S5和附加文件6:表S6)。在2008年种植的8个家庭中，有8个来自于两个曾经结出果实的父母。2009年，也就是评估的第二年，这三个科的所有后代都重复结果。在2008年，也就是评估的第一年，这三个家系的分离比例最符合7:1的比例，一次结果和多次结果。7:1的比例仅来自于两个曾经结果的亲本的杂交，仅来自于一个显性抑制基因在所映射的位点上起上位性作用。这种抑制因子只在第一个评估年起作用，而不是在植物度过冬季之后。

一个映射项目通常会识别出一些与感兴趣的性状密切相关的标记，这些标记在育种中可能有用，特别是如果映射项目指出哪些标记与该性状是耦合的，哪些与该性状是排斥的。然而，由于育种项目经常使用不同背景的多个亲本，在一个映射种群中确定的最接近的标记可能对一些育种亲本没有用处。因此，拥有与性状相关的多个可用标记，用于在育种群体中操纵某一性状是有帮助的。在这项研究中，草莓基因组序列的可用性使我们能够在感兴趣的性状附近寻找其他标记。通过与先前标记到该性状的引物序列的相似性，这种挖掘栽培草莓大序列-支架的过程是成功的，并已用于其他研究[24］．开发了5对新的SSR引物，并在一个被测群体中重复结果，4对引物在另一个被测群体中重复结果。这一过程的成功凸显了继续组装和注释全基因组序列的价值，尽管这通常是一项乏味而费力不讨好的工作。

用19个标记而不是1个或2个标记来表征亲本，这为标记谱和已知表型之间的分歧提供了初步的信心，这不是由于赋予性状的基因和最接近的标记之间的简单重组事件。使用Kruskal-Wallis非参数检验与重复结果最密切相关的标记与JoinMap生成的图谱不完全一致，图谱之间也不完全一致。Kruskal-Wallis检验作为连锁作图的后续，在确定哪些标记最有可能预测表型方面是有帮助的，无论是在确定所需的幼苗还是在选择亲本方面。在两个群体中结合作图和Kruskal-Wallis测试有助于确定三个标记(FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189和Bx215-148)，这些标记可以最好地预测具有一次结果标记的亲本(在这三个标记不存在的情况下)也会有一次结果的表型。这三个位点均与显性重复结果位点耦合连接。其中两个标记(FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189)是本研究从一个连续序列中获得的，分别在一个定位群体的重复结果期1.9 cM和另一个定位群体的重复结果期8.4 cM和10.1 cM处进行了定位。绘图差异不被认为是任何比简单的实验误差更复杂的证据。

虽然这三个标记的缺失在鉴定一次结果的亲本时非常有用，但它们的存在不能用来鉴定重复结果的亲本，并且错误地预测了大约一半的亲本的重复结果。当FANhyb19.1-15-121和FANhyb19.1-4-189基因存在或Bx215-148基因存在时，重复结果的概率约为43%。Bx215-128的阳性预测率仅为85% [29］．Bx083_206和Bx215_131相隔7.3 cM和1108 Kb，并被假设为控制重复结果的基因的一侧，预测重复结果率仅为82%(17个具有重复结果表型的独立基因型中的14个)[24］．标记之间的双重重组被认为是原因之一[24］．在多次作图研究中只检测到一个基因组区域，而且许多被测品种的表型在许多环境中都是众所周知的，这表明标记谱和表型之间的差异是由于多个基因受到环境的强烈影响[25］．这些独立的发现表明，至少存在一个或更多的附加的独立位点，对所映射的位点具有上位效应。由于隐性的一次结果表型可以通过这些相同标记的缺失可靠地预测，这表明假设的上位位点是映射的显性重复结果位点的抑制因子。而且，最可能受到环境效应和/或不完全外显的影响的是未映射的上位位点，而不是已映射的位点。9，25］．

标记谱结合亲本的已知表型不能预测除四个亲本组合外的所有后代的分离率。重复结果完全由一个具有完全显性等位基因的基因座控制的假设的这两个失败，导致假设至少有一个额外的和独立的基因座影响重复结果存在于这个育种计划池。由于一般假设遗传效应为加性的作图过程中只检测到一个位点，假设该附加位点具有非加性遗传效应。上位性被认为比不完全外显率的非加性效应更有可能，因为通过遗传连锁和育种亲本表型和标记谱比较获得了综合证据。当一行证据允许多种解释时，综合证据则不允许，并排除了映射位点的不完全外显是观察到差异的重要原因。这一证据也表明，第二个位点通过在所映射位点上的上位性，起到了重复结果的抑制作用。

对所有可能的表型和标记-谱组合进行假设分离比的计算，这些组合来自于与显性抑制基因座(81个亲本组合)或隐性抑制基因座(81个组合)组合的映射基因座4:表S4和附加文件5:表S5)。并不是所有观察到的比例都可以用一种或另一种模型来解释，当比较具有共同父母的多个家庭时，没有预测的共同父母的基因型会导致所有观察到的分离比率。一些家系的分离率提供了强有力的证据，证明存在额外的位点，一些是显性的，一些是隐性的，也许还有一些共同作用，影响由单个定位位点的显性等位基因所赋予的重复结果。

先前，在二倍体参考基因组v2.0中，重复结果区两侧的两个标记被用于搜索序列同一性。a1序列，全长1108 Kb，包含234个预测基因，其中15个被分类为开花相关基因，其中1个与开花相关基因序列同源开花位点t蒋春暄对于费马大定理()(24]，这是植物调节的关键f . vesca［30.］．的作用开花位点t受到强烈的影响君士坦斯，是分子水平上广为人知的上位性例子[31］．在f . vesca，同系词的过度表达constans1过表达抑制因子(Fv SOC1)在短昼诱导下能抑制花的形成，而SOC1的沉默则能在短昼和非诱导长昼连续开花，这与花抑制基因中的突变体相似F. vesca终末花(Fv TFL1)， Fv SOC1激活茎尖Fv TFL1，导致草莓开花受到抑制[32］．只要考虑SOC1如何作用于CONSTANS, CONSTANS又作用于FLT，就可以支持一个位点受两个抑制位点上位性影响的概念。

春化对开花也有很强的影响，据报道，在一些草莓基因型中有春化需求，而在其他基因型中没有[33］．显性上位性抑制基因似乎只在评估的第一年起作用，而不是在经历冬季后起作用，这可能是影响春化的基因，与重复结果受环境影响的观点一致，可能是不完全外显。

在二倍体中已鉴定出66个基因同源体，通过序列相似性推测它们与所有已知遗传开花途径的基因相对应f . vesca［34］．这些只是几个例子，支持了其他基因座也可以影响在HG IV上所绘制的重复结果位点的作用的观点。对影响植物开花的基因数量和它们之间已知的上位性相互作用的累积知识提出了一个问题，即为什么迄今为止只绘制了一个控制草莓重复结果的基因座。

由于用于表型的方法和所使用的人群，很可能只有一个位点被检测到。在苗年之后，从' Tribute ' × ' Honeoye '收集数据，以便在多个州进行无性繁殖和测试[9］．当重复杂交并在马里兰州进行测试时，124株幼苗中有37株在种植当年的夏季开花结果，最符合3株未开花与1株开花的分离比。在接下来的夏天，存活的122个后代中有69个在整个夏天开花结果，最符合1:1的比例。正如贝尔茨维尔育种计划在2008年和2009年评估的许多家庭一样，几个重复结果的后代在种植的那一年被抑制开花(附加文件)6:表S6)，但在收集数据绘制地图后的年份中没有出现[9，16］．也许这是一个错失的绘制草莓春化基因的机会。

定位种群通常是由具有极端对立表型的亲本发展而来的。之所以使用“Tribute”דHoneoye”和“Delmarvel”דSelva”群体，是因为它们的父母具有相反的表型。目前的研究表明，可以从两个具有重复结果标记和重复结果表型的亲本中获得分离家系(表2)2)或来自两个曾经生育后代的父母(附加文件)6:表S6)。通常选择只允许定性评估和一次发现一个位点的映射种群，如“Delmarvel”דSelva”种群，其分离为1:1。

测绘软件通常假定遗传效应是累加的，包括一些正在使用的新方法[25，35］．一些绘图程序允许用户掩盖一个位点的效果，以识别其他位点。采用R/QTL技术鉴定了葡萄原花青素组成具有上位性影响的位点[36它有几个我们的人口没有满足的要求。多QTL方法(MQM)，可通过MapQTL软件[37]在本研究中使用了最显著的连锁标记来检测QTL作为辅助因子来控制遗传背景，并允许检测额外的显著QTL。该方法在' Delmarvel ' × ' Selva '群体或' Tribute ' × ' Honeoye '群体中均未检测到额外的显著QTL [17，18］．

同样，由于表型数据的收集方式/时间以及群体父母的遗传组成，很可能只有一个位点被多个研究小组在多个群体中检测到。然而，这并不能解释这些多个群体不太可能发现相同的位点。如果假设控制重复结果的多个位点在遗传距离和表达上都是独立的，那么至少有一个类群应该发现了影响重复结果的独特位点。所有组都发现了相同的位点，这一事实表明，所绘制的位点是唯一能够独立于其他位点影响种族隔离的位点。尚未映射的位点依赖于待揭示的映射位点。无论亲本是一次结果型还是重复结果型，当亲本都具有已定位位点的重复结果标记谱时，上位抑制基因座可以最有效地定位。来自当前研究的可能的例子包括任何重复结果的亲本B2409RB、B2325或B2411RB与一次结果的亲本B1806杂交，后者具有重复结果的标记，因为所得到的家族以接近1:1的比例分离(表1)2)．除了表型外，在已知位点上对所有育种亲本进行分子特征鉴定的育种计划可能有助于从年度育种家系中确定所需的连续图谱。

利用基因上与重复结果相关联的引物序列搜索基因组序列支架，得到了五个与重复结果密切相关的新标记。该方法可能不是很有效，因为大多数扩增产物没有按计划使用，或者没有映射或映射到非目标连锁群。注释基因组序列的额外努力将有助于本研究和其他遗传研究类型。

与其他人观察到的情况相似[24，25，29，35]，一次结果的亲本标记谱几乎总是表明一次结果的表型，然而重复结果的亲本标记谱错误地预测了重复结果的表型，在当前研究中大约有一半的时间。造成这种差异的原因不可能是显性等位基因的不完全外显。50%的外显率会导致该性状与致病基因周围的基因组区域之间的随机关联，从而阻止了几个研究小组对该性状的定位[9，16，17，18，23，24，25]，因为基因作图需要性状和标记之间的非随机关联。最简单的解释是，存在一个或多个独立的基因座，在具有重复结果标记的个体中抑制重复结果，但表型为一次结果。这是上位性的一个例子。

一个或多个上位性抑制基因座的存在是通过标记特征和多年表型评价从亲本分离的子代来证实的。在四个家系中观察到作用于一个上位性抑制基因位点的特异性分离率。两个家系的分离比最好的解释是一个显性抑制因子作用于所测位点，而对于另外两个家系，则是一个隐性抑制因子。

虽然不完全外显可能对所测位点没有显著的直接影响，但不完全外显和生长环境可能是作用于上位抑制位点的重要因素。这可能解释了在不同州种植的个体之间的表型差异，正如草莓行业中普遍注意到的那样[25]和遗传连锁研究[9，16］．环境和/或对上位抑制基因座的不完全外显效应也可能导致当前研究中产生的略有不同的图谱(图。1)．

其中一个在所测位点上起上位性作用的抑制基因座是显性抑制基因座，它只在第一年，即播种新苗的那一年起作用，而在随后的年份不起作用。

开发重果区SSR标记

为了进一步利用标记充实重复结果区，使用先前映射到该区域的标记设计了额外的SSR标记[17，18］．每个SSR标记连接重复结果的正向和反向引物序列(表1)在栽培草莓的参考基因组(FANhybrid_r1.2)中寻找相似的序列，F。×ananassa［38]，下载至草莓园网站(http://strawberry-garden.kazusa.or.jp， 2016年4月访问)。使用Python编程语言的自定义脚本(可根据要求提供)，允许高达4 bp的不匹配(近似精确匹配算法)。选择含有与引物序列高度相似区域的基因组序列支架，设计重复结果区SSR标记。重复基序采用SSR标记工具(SSRIT，http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)．利用Genious 7.2软件工具在SSR-flanking序列中设计寡核苷酸引物[39］．引物设计满足以下参数:扩增子大小在100 - 450 bp之间;引物长度18 ~ 25 bp, GC含量40 ~ 60%;熔化温度在55°C至65°C之间(最佳59°C)。

将所开发的SSR引物对与亲本(Tribute、Honeoye、Delmarvel、Selva)进行多态性检测。用检测多态性的引物对从中提取的种群进行基因分型。关于这两个映射种群的详细信息已在前面描述[17，18］．利用8个SSR标记(Bx052、Bx056、Bx059、Bx064、Bx083、Bx089、Bx215、Bx250)对定位群体进行基因分型[24］．

为了用于亲代筛选和基因定位，正向引物的5 '端被修改，添加了M13序列(5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ')，并且单独的M13引物被荧光染料6-FAM、VIC、NED和PET标记(应用生物系统公司，福斯特城，CA, USA) [40］．通过添加短序列(GT, GTT或GTTT)对反向引物的5 '端进行修饰，以促进腺苷酸化，使产物尺寸更均匀[41］．聚合酶链式反应(PCR)扩增如所述[40］．引物对首先与映射亲本进行测试，那些在亲本之间产生扩增子多态性的引物对在映射群体中扩增后，根据产物大小和荧光染料颜色将其组合成最多4个引物对产物的复合物。电泳样品按所述方法制备[17］．PCR产物用ABI3730 DNA分析仪(Applied Biosystems Inc.， Foster City, CA, USA)毛细管电泳分离。使用GeneMapper 3.5软件(Applied Biosystem)和GENSCAN 500HD (LIZ)作为内部大小标准确定等位基因大小。为了在' Tribute ' × ' Honeoye '和' Delmarvel ' × ' Selva '群体中定位ssr，按照所述进行了连锁分析和遗传连锁图构建[17，18］．Kruskal-Walis检验的非参数方法[42]用于识别与重复结果区联系最紧密的标记。标记笔P≤0.005被选为联系最紧密的。

种植重复结果的幼苗

种子发芽后移植到温室中72孔的托盘中。幼苗种植在Henry A. Wallace Beltsville农业研究中心连锁农场(39°01′22.43″N, 76°54′59.26″W，海拔43.6 m)。观察样地和重复评价样地位于北农场(39°01′48.42″N, 76°56′07.99″W，海拔49.4 m)。白天的长度是在马里兰州的格林贝尔特记录的。联动农场的气温(2016年)记录为1.5米高。一个2米高的气象站位于距离Linkage Farm所有农田不到300米的地方，用41,303-5A RM Young六板太阳辐射屏蔽内的CS107温度传感器测量遮蔽温度(Campbell Scientific, Logan, UT)。测量每10秒进行一次，平均间隔15分钟。数据通过RF450无线电(Campbell Scientific)的900 Mhz扩频协议传输到NL100网络链路(Campbell Scientific)，用于与Vista Data Vision传感器数据管理软件(冰岛雷克雅未克)进行显示。

每年的塑胶养殖系统[43]，在贝尔茨维尔用于种植和选择一次结果的草莓，在2008年进行了调整，用于评估预计将分离重复结果的幼苗，并在炎热的夏季条件下最大限度地提高开花和果实质量。在田间用2600系列II型塑料地膜层(rain - flo Irrigation, East Earl, PA)制作了一个凸起的床，形成了一个7厘米的树冠，以帮助阻挡雨水。与黑色地膜相比，苗床上覆盖着黑白相间的塑料地膜，以降低土壤温度，因为土壤温度是重复结果草莓夏季结果的关键[10］．随着床层的制作，在每个床层的长度上安装两行15密滴带(线间距为30厘米)。它们被放置在床面以下7厘米处，床中心两侧各16厘米处，以最大限度地利用两行种植的幼苗，距离床中心18厘米，即床的长度。种植后，每周浇水施肥5.6 kg·ha⁻¹氮。用手定期清除种植洞中的小杂草。将草莓幼苗的匍匐茎从塑料覆盖物下面拉出来，远离邻近的幼苗，也远离苗床中心，以防止相邻种植孔中的表型混淆。

在苗期鉴定“重复结果”基因型

先前的研究描述了如何在苗期确定重复结果的基因型。种子在冬末至初春萌发，春季在田间生根，盛夏至初秋评价开花结果[12］．另外，在第一年的前六周开花表明选择将重复结果[13］．在Beltsville，从2008年到2011年，对几个期望分离以重复结果的苗木家庭进行了评估，评估其在苗木年开花，并在第二年重复开花/结果。2008年、2009年、2010年、2011年分别种植67个、48个、46个、24个子代。从6月底到10月初，每两周对每棵幼苗进行编号，记录(开花/未开花)数据。此外，秧苗第一次开花时，就会在一米高的线杆上用塑料旗做标记。这块地在冬天一直保持着，并进行培育，以鼓励来年结果。每年6月，在项目中所有田地的第一个春季结果期结束后，再次收集前一年种植的幼苗的开花数据。这样，就可以确定第一年开花的幼苗是否会在春实结束后的第二年反复结果。在这四年中，许多第一年不开花的幼苗在第二年夏天反复开花(附加文件)6:表S6)，并在随后年份被选为潜在品种。所有第一年开花，第二年健康的幼苗，在第二个夏天反复开花结果。2011年以后，在种植当年开花的苗木简单用铁丝标记，开花苗木数作为每个科活苗总数的一部分;第二年没有收集隔离数据。

比较亲本表型和标记谱

自2007年以来，年度杂交计划被分为两种类型:一种是设计为一次结果的杂交(“一次结果”杂交)，7月种植在黑色塑料床上，第二年结果;以及那些设计为重复结果而分离的(“重复结果”杂交)，在3月份种植在白色塑料床上，并在同年结果。2)．这两种类型的幼苗每年都被鉴定为具有栽培潜力的品种，称为“选择”，并被分配选择编号，通过多年的额外评估来识别它们。选择作为幼苗后的一年，在六个植物“观察地块”中进行评估。从曾经结果的杂交品种中选择的品种在温室中由操作员进行繁殖，并在选择后的8月进行种植，这是在幼苗种植的一年之后，但也是在选择的同一年。这些选择在第二年春天进行主观评估，如果再次选择，则在复制的地块中再次传播和评估[44］．在主要结果期结束后，对观察小区和复制小区的所有选择进行评估，以确定任何可能再次开花的，即使它们没有被选择。自2008年首次在不同的时间在不同的田地里种植一次结果和重复结果的杂交品种以来，从一次结果的田地里选择的幼苗都没有被重新归类为重复结果。

从重复结果的杂交品种中选择的品种在温室中由跑步者繁殖，然后在步入式冷却器中冷却10到12周，然后在第二年春天种植在观察区，距离它们被选中不到一年。这些选择在它们被种植到观察地块的同一年进行评估，一年之后它们被评估和选择为幼苗。没有成为跑步者的选择没有进一步评估。重复结果的选择在观察地块中进行了多次检查，以确保它们在整个夏秋两季仍然结果，并观察果实质量在一年中是如何变化的。在育种过程的这一步没有被丢弃的选择每年作为育种计划的亲本使用。

2015年作为亲本生成2016年重复结果分离家系的所有引物对都映射到整个重复结果连锁群。从草莓育种计划的所有育种选择中收集脱氧核糖核酸(DNA)，用感兴趣的分子标记进行表征。每年，从每个观察地块中，收集仍折叠的幼叶并干燥长期储存。从观察地收集树叶并放置在有标记的玻璃纸信封中(Clearbags, Selmer, TN)。最多6个信封，每个信封代表一个选择，放置在一个加仑大小的可密封塑料袋中，装有约177 mL分子筛干燥剂，4A型圆珠，形式8 × 12 (ADCOA, Gardena, CA)，带有湿度指示卡。密封袋中留有空气，便于干燥，前两天反复转动袋口，直至指示卡保持蓝色。干燥剂每年更新一次。从草莓育种项目2016年重复结果苗木家族的亲本中，使用TissueLyser (Qiagen, Inc.)对干叶组织进行碎片化，并在QIAcube®机器(Qiagen, Inc.)中使用DNeasy®Plant Maxi Kit (Qiagen, Inc.)提取DNA。

与育种亲本进行pcr，以绘制新标记。pcr在96孔板中完成，每次选择两个反应作为复制，每个板一对引物。每个盘子上都有“Tribute”、“Honeoye”、“Delmarvel”和“Selva”，以确定产品的大小。

预测家庭的预期隔离比率

根据亲本，预测了各育种科第一年开花(后续年份重复结果)的分离率。预测是基于父母的已知田间表型(多年)和每个家庭父母的分子谱。预测也基于多项研究的结果，这些结果表明重复结果是由单个位点上的显性等位基因授予的[18，23，24，25］．在这个模型中，一次结果的亲本是纯合的，并且只能传递一次结果的等位基因。重复结果的亲本可能是纯合子显性只传递重复结果的等位基因，也可能是杂合子显性只传递重复结果的等位基因。对于与重复结果最密切相关的连锁群部分标记数据不一致的亲本(附加文件)3.:表S3)，在进行隔离预测时考虑了这两种选项(表S3)2)．当需要测试其他分离比率时，它们是基于已知单一位点(具有显性重复结果等位基因)存在的假设，与其他独立位点结合，其中一个等位基因赋予一种或另一种开花模式，并具有上位抑制作用(附加文件)4:表S4和附加文件5:表S5)。

确定每个苗木科的实际分离比

2016年春季，草莓育种项目的苗木家庭被种植在贝尔茨维尔农业研究中心(BARC)的一块田地上，预计将进行分离以重复结果。整个夏天，从6月下旬到9月下旬，任何开花的植物都打上了白旗。从这些幼苗中进行选择，并在第二年的观察小区中进行评估。对于每个科，都记录了开花植物的数量、不开花植物的数量以及患病或死亡植物的数量。使用卡方拟合优度检验将观察到的分离比与预期的分离比进行比较。计算较大卡方值的概率，而不是使用排除概率。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章[及其补充信息文件]中。

巴克:

贝尔茨维尔农业研究中心

DN:

天中性

背景:

脱氧核糖核酸

蒋春暄对于费马大定理:

开花位点t

阵线TFL1:

花椰菜终末花1

HG:

部分同源的组

格林:

连锁群

统一民族运动党:

多QTL法

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

QTL:

数量性状位点

SD:

短暂的一天

SOC1:

constans1过表达抑制因子

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

SSRIT:

SSR识别工具包

我们:

美国

美元:

美元

USDA-ARS:

美国农业部农业研究局

作者要感谢John Enns和Philip Edmonds的田间准备和维护，温室植物和幼苗的维护，异花授粉，种子提取和发芽，以及幼苗移植。我们要感谢Mariam Manzoor、Oma Akuya、Asiah Lane和Arhamur (Abir) Rauf协助田间和温室的植物维护，并在田间培育重复结果的幼苗。我们还要感谢USDA-ARS BARC研究农场服务，为温室维护、温室杀虫剂应用、现场准备以及监测和维护现场环境条件的设备和数据。

本项目由KSL管理的USDA-ARS内部项目8042-21220-257-00(原8042-21220-254-00)和LJR管理的USDA-ARS内部项目8042-21000-279-00资助。访问科学家PC的部分资金来自8042-21220-257-00项目，部分资金来自西班牙经济和竞争力部的Juan de la Cierva-Incorporacion (IJCI-2014-22301)。访问科学家，JVD由美国农业部- ars项目8042-21000-279-00资助。

从属关系

1. USDA-ARS，水果和蔬菜遗传改良实验室，美国马里兰州贝尔茨维尔巴尔的摩大道10300号BARC- West 010A号楼，邮编20705-2350

   k·s·莱尔斯和l·j·罗兰

2. 埃斯奎拉大学遗传系Técnica高级工程师学院Agrónomos，格雷戈尔·孟德尔大厦(C-5)，拉巴纳莱斯校区，科尔多瓦大学，14071,Córdoba，西班牙

   卡斯特罗和迪

3. 美国密歇根州立大学植物与土壤科学大楼A342C园艺系，密歇根州东兰辛，48824-1325

   j·f·汉考克

4. 密歇根州立大学植物、土壤和微生物科学系，A384-D植物和土壤科学大楼，密歇根州东兰辛，48824-1325

   c·k·维巴德

贡献

KSL构思研究思路，获取或生成所有育种材料，监督所有项目活动，确定并测试预期的分离比。LJR指导JVD使用先前与重复结果相关的标记来开发额外的标记来饱和该基因组区域。JFH和CKW先前开发并繁殖了本研究中用于绘制新标记的' Tribute ' × ' Honeoye '群体。PC对两个定位群体的新、旧标记进行了定位，并对本研究所用的亲本进行了分子表征。KSL写了第一稿，由JVD和PC贡献了重要的部分，所有作者都参与了修改手稿草案。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到路易斯．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。BARC农场服务人员提供内部支持，根据所需工作时间向USDA-ARS BARC项目收费。提及商标、专有产品或供应商并不构成美国农业部或本研究中涉及的任何其他机构对该产品的保证或保证，也不意味着批准排除其他可能合适的产品或供应商。

出版商的注意

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