海藻糖-6-磷酸磷酸酶家族基因的过表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba改善了风水的耐受性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPPs)，其编码成员gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba基因家族，可以改善植物的耐旱性。但是，潜在的动态调节的分子机制gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba干旱胁迫期间的基因仍不清楚。在这项研究中，我们探讨了一个功能gydF4y2BaArabidopsis TPP.gydF4y2Ba通过进行函数突变体和过表达线的比较分析来进行基因。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

的功能丧失突变gydF4y2Ba拟南芥人士gydF4y2Ba，一个成员gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba基因家族，导致一个干旱敏感表现型，而一个系过表达gydF4y2Ba人士gydF4y2Ba显著提高了海藻糖积累量和抗旱性。与野生型植物相比，gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体积累了更多的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在干旱,而gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba-过表达的植株积累HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在干旱。过度的gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba导致在干旱条件下增加海藻糖，蔗糖和总可溶性糖的含量;这些化合物可能在清除反应性氧物种中发挥作用。酵母单杂交和荧光素酶活性测定显示DREB1A可以与DRE / CRT元件结合在内gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子和激活的表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba．的转录组分析gydF4y2Ba人士gydF4y2Ba- 抑制植物揭示了所涉及电子传输活性和细胞壁改性的干旱抑制基因的表达水平，同时下调与水剥夺相关的应激相关转录因子的抑制因子。这些结果表明，其参与调节海藻糖和可溶性糖，gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba参与调控应激反应基因的转录。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba在干旱胁迫下调节海藻糖，活性氧物质和蔗糖水平的功能，以及表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba是由DREB1A激活的gydF4y2Ba拟南芥。gydF4y2Ba这些发现阐明了其分子机制gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba调节对干旱胁迫的反应。gydF4y2Ba

海藻糖是一种非还原性双糖，由两个以α， α- 1,1 -葡萄糖苷构型连接的Glc单元组成。这种化合物存在于植物、真菌、细菌和无脊椎动物中[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．除了作为碳源的功能外，它还在不利条件下用作保护化合物，例如脱水，高盐度，缺氧和营养饥饿[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．例如，海藻糖用作稳定膜和蛋白质在某些复活植物中的保护剂，例如gydF4y2BaMyrothamnus flabellifoliusgydF4y2Ba和gydF4y2BaSporobolusgydF4y2Ba使它们能够在脱水-复水循环中存活[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

原核生物中存在5条海藻糖合成途径，而真核生物中只有海藻糖-6-磷酸(T6P)合成酶(TPS)/T6P磷酸酶(TPP)途径[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．在此途径中，首先通过TPS由UDP-Glc和glc -6-磷酸合成T6P，然后通过TPP脱磷酸化生成海藻糖[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．T6P作为海藻糖合成途径中重要的磷酸化中间体，是调节植物代谢等生物过程的重要糖信号代谢物[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．尚未理解，海藻糖和T6P积累的分子机制和T6P的积累有助于增加干旱耐受性。然而，诸如蔗糖和海藻糖如蔗糖和海藻糖的积聚可以是氧化应激条件下的保护机制[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．由于海藻糖的丰度相对较低，除非其在细胞内的分布特别划分的情况下，否则它对渗透调节几乎没有影响gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，T6P是感测蔗糖浓度的特定信号分子[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．因为T6P存在于比蔗糖低三个数量级的浓度下，所以T6P水平的微小变化可以伴随蔗糖浓度的显着变化[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．因此，T6P水平的变化可能比其他糖的变化更有助于提高应激耐受性。gydF4y2Ba

海藻糖生物合成基因的结构性过表达是提高植物抗逆性的重要手段。因此,gydF4y2BaTPSgydF4y2Ba和gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba基因因其在海藻糖生物合成中的重要作用而受到相当大的关注[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．基因组gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba包含11.gydF4y2BaTPSgydF4y2Bas（gydF4y2BaAtTPS1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba）和10.gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Bas（gydF4y2BaAttppa-J.gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．其中，Attps1， - 2和 - 4 - 抑制TPS酶活性和所有TPP蛋白在酵母中异源表达时表现出TPP酶活性[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]．TPS和TPP在对不利条件的反应和作物产量的形成期间作为重要的生长调节剂。过度的gydF4y2BaAtTPS1gydF4y2Ba授予脱水耐性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，伴随着海藻糖和T6P水平的小增加[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．小麦gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba基因gydF4y2BaTPP-6AL1gydF4y2Ba被发现与1000粒重和谷物产量相关联[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]．从实用的角度来看，大米的过度表达gydF4y2BaTPP1gydF4y2Ba在玉米下的控制特异性启动子gydF4y2BaMADS6.gydF4y2Ba在不同程度的干旱下提高产量[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．对海藻糖生物合成基因的大部分研究集中于其在越来越多的作物生产中对抗反应及其作用的作用。潜在的机制gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba干旱条件下相关基因的调控及动态调控尚不清楚。gydF4y2Ba

10gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba基因在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba表现出不同的时空表达模式，表明它们可能具有不同的功能[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．gydF4y2BaAtTPPDgydF4y2Ba是优先表达在根冠上，而gydF4y2BaAtTPPDgydF4y2Ba可以改善耐盐性，表明该基因在对盐水条件的反应中发挥作用[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]．gydF4y2BaAtTPPAgydF4y2Ba和gydF4y2BaAtTPPGgydF4y2Ba倾向于在原表皮中表达，并可能在根表皮细胞分化过程中发挥冗余作用[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．gydF4y2BaAtTPPBgydF4y2Ba在幼叶中高度表达，并具有增加叶细胞数量的功能[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．gydF4y2BaAtTPPGgydF4y2Ba在气孔细胞中具有特定的表达谱，并参与了气孔闭合的调节gydF4y2BatppggydF4y2Ba抗脱落酸(ABA)调节的气孔关闭突变体[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．有趣的是,gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba是在脱水条件下特别诱导的。此外，与野生型(WT)植物相比，gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba- 通过气孔运动测定评估，发现-OVERExcressing植物对ABA治疗稍微敏感[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．这表明了gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在调节气孔运动中起重要作用，并可能参与调控干旱反应。虽然大米(gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba）gydF4y2BaTPP1gydF4y2Ba可以提高玉米对脱水的耐受性和提高粮食产量[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba[TPP调节干旱反应的分子机制仍然很大程度上是未知的。gydF4y2Ba

在这里，我们提供的证据表明功能缺失的突变体gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba导致干旱敏感的表型，表达升高gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba可以增加耐旱性。我们发现Dreb1a目标gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba并通过直接结合DRE/CRT基序介导干旱胁迫信号gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子，从而激活其转录。一项全球转录分析表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba调节应激反应中涉及基因转录的功能。gydF4y2Ba

TPPF1gydF4y2Ba突变体对干旱敏感gydF4y2Ba

启动子中的T-DNA插入突变gydF4y2BaArabidopsis Attppf.gydF4y2Ba（gydF4y2BaAt4g12430gydF4y2Ba)注释为gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba(SALK_087220)(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).我们鉴定出一个纯合子gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba利用等位基因特异性引物进行PCR扩增(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S1)。RT-PCR分析证实确有其事gydF4y2BaAt4g12430gydF4y2Ba转录本存在于WT中但不在gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac），表明突变导致失去了gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba函数。研究…的遗传性质gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba，突变体与WT Columbia-0回交。对FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba后代揭示了143个抗性的分离率：45个敏感植物（χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba[3：1] = 0.258 <χgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba_{0.05gydF4y2Ba}= 3.84;gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)，说明gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变被遗传为单一的隐性特征。gydF4y2Ba

系统发育分析表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba非常类似于gydF4y2BaOsTPP1gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)，在玉米中过表达可增加抗旱性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．然后对其抗旱性进行了分析gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体。在连续干旱处理28 d后gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba与野生型植物相比，野生型植物对干旱胁迫更敏感gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba植物与浇水条件下的WT植物类似（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).复水后第2 d，灌胃后的存活率gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba植物显着低于WT植物的植物（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae）。我们评估了脱离叶片的水分损失率。虽然脱离了叶子gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba水分的流失速度略快于WT叶片，两者的失水率没有统计学差异(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaF）。gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba过度表达增加了耐旱性gydF4y2Ba

评估功能gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在干旱压力下，我们克隆了gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba并产生了一个过表达的结构gydF4y2BaCaMV 35 sgydF4y2Ba启动子(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).然后将这种结构转化为WT植物。转基因T3纯合子系gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba表达水平大于获得WT植物的表达水平。选择具有不同表达水平的三条线（OE6，OE5和OE9）进行进一步分析（图。gydF4y2Ba2B.gydF4y2Ba）.三条线显示出不同程度的抗旱程度，与他们的转录水平成比例gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2CgydF4y2Ba）.例如，OE9植物显示出最高的植物gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba干旱26 d后生长旺盛。的gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在OE5植物中表达水平相对较低，其比OE9植物更剧烈地增长。WT和OE6植物在干旱胁迫下显示出严重的萎缩症状（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。OE5和OE9植物在干旱胁迫下比WT植物（28.4％）的存活率显着更高（45.7和82.7％）（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad）。因此，过度表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba提高了植物的抗旱性，且改良水平与改良水平成正比gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba基因的表达。因为过度表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba抗旱能力增强而丧失功能gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba降低了对干旱胁迫的耐受力，我们得出结论gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba积极调节干旱耐受性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

确认…的功能gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在干旱反应中，我们进行了一个补充实验gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba使用与上述相同的构建体的突变体。的gydF4y2BaCaMV 35 sgydF4y2Ba过度表达构建体转化为gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体。获得了8个T2转基因株系，并以gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba选择与WT相似的表达水平进行进一步分析。在干旱条件下，补种株系的表型与野生型株系相似gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S2）。这些结果证实，功能突变突变gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba授予干旱敏感性gydF4y2Ba拟南芥。gydF4y2Ba

DREB1A结合于干旱响应的DRE/CRT元件gydF4y2Ba人士gydF4y2Ba启动子gydF4y2Ba

搜索推动者地区gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba(转录起始位点上游2 kb区域)显示了一个DRE/CRT顺式作用元件“ACCGAC”和三个顺式作用aba响应元件(ABREs)。由于DRE/CRT元件能与DREB/CBF转录因子特异性互作，我们分析了DREB/CBF的共表达模型gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Badreb编码基因gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba，gydF4y2BaDREB2A,gydF4y2Ba和gydF4y2BaDreb1b.gydF4y2Ba，使用AtgenExpress可视化工具。表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba本质上是一致的gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S3）。要确认此共表达模式，我们使用RT-QPCR来量化成绩单水平gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba和gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba在干旱条件下。通过干旱诱导这两个基因，它们的表达模式基本相似（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA和B）。这些数据表明DREB1A可以激活表达式gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba通过与DRE / CRT主题结合。gydF4y2Ba

确定DREB1A是否识别gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba体内启动子，我们进行了酵母单杂交测定，以确定DREB1A是否可以直接与DRE / CRT“ACCGAC”主题联系起来gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子地区。全长2-kB启动子gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba(包括DRE/CRT和三个ABRE基序)克隆到诱饵结构中。有趣的是，一个没有任何猎物蛋白质的蓝色殖民地被鉴定出来，这表明全长片段是自动激活的(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S4）。当含有DRE / CRT基序和ABRE基质的539-BP P1片段被克隆到诱饵构建体中时（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac)，只有在DREB1A猎物存在时才观察到蓝色群体(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad），表明DREB1A可以识别和绑定到“ACCGAC”主题gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子。然而，当将AREB1(与ABRE motif结合)作为猎物加入时，没有获得蓝色菌落(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S4），表明含P1的ABRE主题和areB1之间没有相互作用。这些结果表明了gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子由Dreb1a具体地认可。gydF4y2Ba

Dreb1a.gydF4y2Ba编码ERF/AP2转录激活因子家族中DREB亚家族的一个成员[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]．确定DREB1A是否可以激活表达式gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba，我们采用双荧光素酶(LUC)分析报告基因表达。P1片段被引入gydF4y2Ba0800 - luc pGreen IIgydF4y2Ba载体生成报告基因构建，cDNAgydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba是插入gydF4y2Ba62 - skgydF4y2Ba生成效应构造。烟草（gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba)叶与效应体和报告体共转化，然后测定相对LUC活性。正如预期的那样，在效应体和报告体(包括0800 +)存在时，LUC活性更高gydF4y2Ba35年代gydF4y2Ba-gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba和gydF4y2BaP1:卢克gydF4y2Ba+gydF4y2Ba62 - skgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD, e)，比在阴性对照存在的情况下。这一结果提示DREB1A可以作为的转录激活因子gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

DREB1A积极调节gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba表达gydF4y2Ba

进一步确认直接规制gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba通过DREB1A，我们获得了相关的gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba行。这些品系包括一个T-DNA插入突变体(gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba）在未经翻译的地区gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba（gydF4y2BaAT4G25480gydF4y2Ba）在WT Columbia-0背景（Salk_018603）中（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）;和一个过度表达线gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba在Wassilewskija (WS)背景(CS69502)。纯合子的gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba通过使用等位基因特异性引物通过PCR扩增鉴定线（图。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba）.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析证实不是gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba转录物存在于此gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba突变体与wt相比（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).与WS植物相比，dreb1a过表达植物(DREB1A-OX)表现出更高的转录水平gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

以前，我们确认Dreb1a可以激活gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba转录(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.因此，我们进行了表达测定gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在这两个gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba突变体和DREB1A-OX植物。不出所料，文字丰富gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba植物比在浇水良好的对照和干旱条件下在WT植物中。因此，失去了gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba导致减少gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba表达式。与WS植物相比，DREB1A-OX植物的转录水平增加gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在控制和干旱条件下。因此，我们得出结论，Dreb1a在它中起着积极的作用gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba调节海藻糖和hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba水平以应对干旱压力gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba编码参与海藻糖生物合成的类卤酸脱卤酶水解酶超家族中的一种蛋白质。因此，我们监测了干旱处理前后海藻糖含量的变化。海藻糖含量在野生型和野生型中没有增加gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体，但在OE9植物中累积到较高水平，而不是WT或gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba干旱条件下的突变体（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba这些结果表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba过表达导致海藻糖积累以应对干旱胁迫。gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba在拍摄顶端商品（SAM）中表达[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]，我们测量了转录水平gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在SAM和REST(除SAM外的整个幼苗的其余部分)中。不出所料，在gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在控制和干旱条件下，SAM和其余部分之间的转录性丰度（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab),这表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba优先在山姆中表达。转录物丰度水平的明显差异在干旱条件下特别发生，表明这一点gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在山姆干旱压力的回应中起着关键作用。我们没有发现WT和全幼苗的海藻糖水平明显增加gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba干旱胁迫下。因此，我们测量了SAM中海藻糖的含量，以检测细微的变化。在对照和干旱条件下，我们测量了SAM和REST中的海藻糖含量，发现两种条件下SAM中的海藻糖含量差异有限(图2)。gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba）.虽然在干旱条件下在OE9植物中积累的海藻糖（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa），增加相对较小。因此，这可能不是对升高的耐旱性的唯一解释gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba-overmentring植物。低海藻糖水平不足以控制OsmoreGulation [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．因此，其他因素可能是提高抗旱性的原因gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba超表达。gydF4y2Ba

在植物中，hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba是一种主要的反应性氧（ROS），其作为一种重要的信使来继承干旱应力信号[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]．因为gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在幼苗的SAM中有较高水平的表达(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)，我们测量了HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用DAB染色的级别来验证可能的功能gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba清除SAM中的ROS。与野生型相比，OE9型植株积累的H较少gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，特别是在新叶中，干旱处理24 h后。相比之下,gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体积累了更多的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在相同的条件下(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。即使海藻糖水平没有差异gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体和WT植物，失去功能gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba导致部分活性氧清除失败。这些结果表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba可能在抗氧化系统中发挥作用，在干旱条件下保护植物。众所周知，可溶性糖与植物中的氧化还原平衡有关[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]，我们确定总可溶性糖含量。如图1所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaE，与WT相比，OE9植物积累了更可溶的糖，而gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体在干旱条件下积累的可溶性糖较少。在植物中，T6P在调节代谢和发育中起着重要的作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．过度的gydF4y2BaTPP1gydF4y2Ba在玉米中与T6P和蔗糖水平的变化有关[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．如图1所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaF，蔗糖在OE9植物中累积到较高水平，而不是在对照和干旱条件下的WT植物，但没有积累gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体。因此,gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba表达会导致蔗糖水平的增加。gydF4y2Ba

WT和gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2BaOE植物在干旱条件下生长gydF4y2Ba

进一步评估角色gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在更广泛的范围内调节植物对干旱胁迫的响应方面，我们分析了WT和OE9植物的转录组。在充足的水分和干旱条件下，从2周龄幼苗中分离出总rna，并进行RNA-seq处理，有3个生物复制。总共获得了3gb的干净数据，并将其映射到TAIR 10组装中的基因模型中[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．计算WT和OE9植物中每个基因的每千碱基转录本每百万图读(FPKM)值。通过WT和OE9植物之间的两两比较，我们将差异表达基因(DEGs)定义为FPKM值至少变化两倍的基因(gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05)。对野生型和OE9型植物在充足水分和干旱条件下进行了比较分析。在干旱条件下，有440个基因表达上调，475个基因表达下调。我们预期这些基因中的一些将有助于提高干旱耐受性gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba-overexpressing植物(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).有趣的是，在OE9中440个上调基因中，有318个(72%)在干旱条件下的WT植株中受到了抑制。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)，而OE9中475个下调基因中有207个(44%)在干旱条件下的WT植物中被诱导(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).对这些结果的一个可能的解释是，SAM中海藻糖水平的升高可能通过调节干旱响应基因的表达来缓解干旱的严重影响。gydF4y2Ba

为了验证这一想法，我们对OE9植物中318个上调(ergu)和207个下调(digd)基因进行了基因功能注释(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S3和附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S4）。基因本体学（GO）分析显示，318和207基因参与各种生物和分子方法（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)，特别是对刺激和代谢过程的反应。功能注释分析表明，这些基因中有很大一部分编码转录因子和酶。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab）。干旱诱导植物气孔闭合并减少光合作用[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．在318埃格尔 - 美国中，三个与电子传输活动有关：gydF4y2Baenh1.gydF4y2Ba，编码参与金属离子结合的柠檬蛋白家族蛋白质;gydF4y2BaCYP81D1gydF4y2Ba，对成员进行编码gydF4y2BaCYP81DgydF4y2Ba细胞色素家族p450s;和gydF4y2BaCYP71B13gydF4y2Ba，编码假定的细胞色素P450。一些基因参与了碳水化合物的代谢，例如gydF4y2BaSFP2.gydF4y2Ba，它们编码了参与糖类运输的糖 - 搬运工家庭蛋白质，以及gydF4y2BaSUC1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSUC5gydF4y2Ba，编码参与蔗糖新陈代谢和运输的蔗糖 - 质子对称系列的成员。OE9植物中这些基因的表达水平增加可增强光合作用并在干旱条件下维持碳水化合物平衡。此外，一种细胞壁生物生物生物生物生物发生基因，gydF4y2BaXTR8.gydF4y2Ba被确认。该基因的产物参与细胞壁修饰，提高细胞壁硬度，进一步影响离子泄漏的变化[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]．ergu也包括在内gydF4y2BaFSD3gydF4y2Ba，编码一种过氧化物酶;FSD3清除ROS，可以提高OE9植物在干旱条件下删除ROS的能力[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．这一假设得到了不同品系中ROS积累模式的支持(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。因此，OE9植物的增加的耐药性与在干旱胁迫下在WT植物中通常干旱抑制基因的基因的转录物水平增加有关。gydF4y2Ba

令人惊讶的是，207个DIG-DS包括许多应力响应性转录因子，包括MYB，WRKY和基础螺旋环 - 螺旋（BHLH）类型。具体而言，这些包括在内gydF4y2BaMYB90gydF4y2Ba调节花青素合酶的，在不利条件下影响花青素积累[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba];和gydF4y2BabHLH38gydF4y2Ba和gydF4y2BabHLH39,gydF4y2Ba可以改善体内铁元素的平衡[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．dig - d还包括与干旱相关的基因，如gydF4y2BaLTP3gydF4y2Ba，gydF4y2BaLTP4,gydF4y2Ba和gydF4y2Bacor413im1gydF4y2Ba；ABA信号调控基因gydF4y2BaAFP3gydF4y2Ba．由于干旱诱导的野生型基因转录水平在OE9植物中下调，我们推测gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba通过刺激干旱期间刺激剧烈增长而导致干旱反应。为了验证RNA-SEQ数据，我们进行了定量RT-PCR以测量几种注释基因的表达水平（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).结果与RNA-seq数据一致。gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba通过积聚可溶性糖增加耐旱性gydF4y2Ba

以前的研究gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba家庭主要集中在他们的功能上gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba成长和发展以及改善作物生产[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．它们一直是某些作物品种(包括小麦和水稻)实际田间试验的主题[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．例如,gydF4y2BaOsTPP1gydF4y2Ba显示基因在玉米中过表达时增加干旱耐受性和产量[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．作为一个成员gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba家庭gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， 这gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba基因与gydF4y2BaOsTPP1gydF4y2Ba，其在脱水条件下特别诱导[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．在本研究中，表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba干旱诱导(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba功能的丧失gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba导致干旱敏感性，而其过度表达增加了干旱耐受性（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些结果表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba对抗旱性有积极作用。gydF4y2Ba

海藻糖是在维持细胞渗透平衡中用作OsMoplotectant的非还原二糖[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．海藻糖被认为是一种渗透剂，可以保护复活植物，比如gydF4y2BaSelaginella.gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaMyrothamnus flabellifoliusgydF4y2Ba［gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]，从干燥中。在脱水条件下，海藻糖在稳定脱水相关酶和蛋白质以及脂质膜中起作用，并且可以清除ROS以保护生物结构免受损伤[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．海藻糖作为一种非还原性双糖，具有稳定性和不反应性。它在真菌、细菌、昆虫和节肢动物中积累到很高的水平，在某些情况下，它扮演着碳储存分子和保护化合物的双重角色。海藻糖也可能是提高植物抗旱性的目标。增加的表达式gydF4y2Ba泛太平洋伙伴关系gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba导致海藻糖含量增加了四倍[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．我们的研究结果表明海藻糖含量非常低gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(即使在干旱条件下，也低于10 μg/g FW)，与以前的报告一致[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．功能的丧失gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在含水良好的浇水或干旱条件下不影响海藻糖含量，与前一项研究一致[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．这可能是由于其他基因的互补效果导致gydF4y2BaAtTPPGgydF4y2Ba（副本gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba）.然而，过度表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba与野生型相比，干旱条件下海藻糖含量增加了25%(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba即使我们检测到…的轻微影响gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba作为渗透保护器，OE9植物显示出增加的ROS清除能力（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).干旱条件下可溶性糖水平的提高也可能有助于渗透保护(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae).因此，过度表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba增加了可溶性糖的水平，随后可以保护细胞免受氧化损伤并增强耐旱性。gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba-Tresxcressing植物维持碳水化合物代谢并在干旱胁迫下表现出降低的干旱敏感性gydF4y2Ba

我们没有发现显著的耐旱表型与有限的海藻糖积累之间的相关性，这表明一些其他的途径可能是增加海藻糖耐旱能力的原因gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba．因此，我们对OE9和WT植物在充足水分和干旱条件下的转录进行了比较分析。过度的gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在干旱条件下，改变了许多编码转录因子和酶的基因的转录水平(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab）。在干旱胁迫期间，在ERG-US中，在OE9植物中被上调318。它们编码涉及电子传输活性，碳水化合物代谢，细胞壁改性和ROS清除的蛋白质。因此，过度表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba可能有助于增加光合作用，保护生物成分免受ROS造成的损伤，并在干旱条件下维持碳水化合物代谢。在干旱胁迫下在OE9植物中下调的207个基因包括许多与胁迫相关的转录因子基因和干旱相关基因。该结果表明增加了表达的表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba以某种未知的机制减少干旱胁迫的负面影响。考虑到HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba而干旱诱导的调控因子在OE9植物体内的表达水平相对较低，这种干旱负效应的缓解可能部分是由于ROS的去除，这将提高OE9植物细胞的渗透调节能力。因此，增加的表达gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba能够维持基因表达与代谢之间的平衡，并增强对干旱条件的适应性。gydF4y2Ba

AtTPPFgydF4y2Ba是DREB1A的直接下游靶标吗gydF4y2Ba

虽然TPS和/或TPP的过表达被广泛用于提高植物的抗旱性[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba研究表明，干旱胁迫下海藻糖生物合成途径的基因动态调控的分子机制尚不清楚。DREB1A是一种DREB/CBF转录因子，可与DRE/CRT特异性相互作用gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用元件，调控多种胁迫诱导基因的表达，提高抗逆性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．在gydF4y2Ba拟南芥，gydF4y2BaDREB1A表达可以通过增加晚期胚胎发生丰富的蛋白质水平和相容的溶质内容来改善非生物胁迫耐受性[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．在另一项研究中，海藻糖水平在WT和gydF4y2Ba35 s: DREB1AgydF4y2Ba转基因植物在干旱条件下生长2-3天[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．在这里，表示gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在干旱胁迫下，与干旱胁迫下的表现一致gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b).酵母单杂交分析表明，DREB1A可以直接结合干旱响应的DRE/CRT元件gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子，LUC活性检测进一步表明DREB1A可正性激活gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba基因的表达。此外，转录丰富gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba在DREB1A-OX突变体中，DREB1A-OX突变体的表达量远高于野生型(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae, f).虽然gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba也被诱发在gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba突变体在干旱条件下，这种现象可能是由于其他调节基因的存在。因此,gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba似乎是Dreb1a的直接下游目标，gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2BaDREB1A在植物中的表达受到DREB1A的正调控。gydF4y2Ba

我们开发了一个假设的反应模型gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba在干旱胁迫下(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.在正常条件下，有足够的水分来满足植物的所有需求，以及胁迫诱导的基因gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba处于“OFF”位置。当植物遭遇干旱胁迫时，gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2Ba切换到“ON”位置。DREB1A以高含量表示，并在启动子中与DRE / CRT主题结合gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba激活它的转录。增加的表情gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba最可能影响T6P信号，这可能导致可溶性糖的增加。可溶性糖作为渗透剂，保护幼叶细胞免受ROS的伤害，并允许它们正常完成生命周期(图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

我们的结果表明gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba与干旱条件下可溶性糖水平的变化有关。gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba-过表达的植物显示出可溶性糖水平的增加，这可能作为渗透物保护细胞免受ROS损伤。我们的结果还表明DREB1A可以直接与gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba启动子和激活gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba干旱条件下的转录。这些发现阐明了转录调控gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba并且还提供一种实用的工具，用于通过操纵改善植物的耐旱性gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

文中使用的生态型为Col-0。本文分别插入功能丧失gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba官方种子（Salk_087220）由袁勤教授从福建省农业和林业大学海西科科技学院和生物技术中心提供。种子的gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2BaT-DNA插入系(SALK_018603)和DREB1A-OX系(CS69502)均来自拟南芥生物资源中心(ABRC)。在含卡那霉素的琼脂培养基上进行了单拷贝和纯合子的鉴定。将分层种子转入MS培养基或土壤，在22℃、16 h光照/8 h暗周期、80 μmol quanta m条件下培养gydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}光照强度和50%的相对湿度。gydF4y2Ba

为了gydF4y2BaTPPF1gydF4y2BaT-DNA插入鉴定，从叶片中提取总基因组DNA，用引物LP: 5 ' -TTCACCTGCACACAACAAATC-3 '， RP: 5 ' -CCCAACATGGATGGTTCTTC-3 '和LB: 5 ' - atttttgccgatttcggaac -3 '进行PCR。gydF4y2Ba

用于识别gydF4y2BaDreb1a.gydF4y2BaT-DNA插入鉴定，使用的PCR引物对是：LP：5'-GcCacacattCatacgcaAAGA-3'，RP：5'- agctcgagctgccatctcagcg-3'and Lb：5'-gcgtggaccgcttgctgcaact-3'。gydF4y2Ba

干旱应力分析gydF4y2Ba

一周大的野生型(Col-0),gydF4y2Ba35S：Attppf.gydF4y2Ba转基因,gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变植物和土壤中生长的互补植物（来自丹麦的Pindstrup，pH 5.0,0-10 mm，使用相同的黑色塑料罐10cm×10cm，干重的土壤：100g±0.1g，并确保在生长室（16小时光/ 8小时黑暗，22℃，50％湿度）通过扣留水进行干旱胁迫，将填充的水相同）约26d（持续时间为14至26天在每个实验中的生长条件和每个容器中的幼苗数量，适用于gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变干旱测定，在容器中种植的4个幼苗，干旱日为28 d;为了gydF4y2Ba35S：Attppf.gydF4y2Ba转基因株系干旱试验，9株幼苗栽于容器中，干旱日均为26 d;补充试验中，5株幼苗在容器中种植，干旱天数为14 d)。当各试验差异明显时，重新浇水，在2 d后测定其存活率。gydF4y2Ba

质粒构建体和植物转化gydF4y2Ba

用TRIzol (RNAiso plus, 9109)提取2周龄Col-0幼苗的总RNA。用18聚寡核苷酸(dT)引物合成了cDNA第一链。随后的PCR扩增gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2BacDNA涉及引物对TPPF-F和TPPF-R（附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S1)。gydF4y2Ba

PCR产物与花椰菜花叶病毒(gydF4y2BaCAMV.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba35年代gydF4y2Ba启动子，然后插入agydF4y2BaPMDC140gydF4y2Ba与网关技术（Invitrogen）的二进制向量。将构建体引入gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba拉紧gydF4y2Bagv3101gydF4y2Ba通过花卉浸润转化为Col-0（用于过度表达分析）和gydF4y2BaTPPF1gydF4y2Ba突变体(用于互补实验)。gydF4y2Ba

RT-PCR和RT-qPCR分析gydF4y2Ba

用TRIzol (Takara, RNAiso plus, 9109)从2周龄幼苗中分离总RNA。合成了cDNA第一链。调整每个cDNA池的体积，使其具有相同的PCR信号强度gydF4y2BaeIf-4AgydF4y2Ba在28日周期。RT-PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。所有pcr检测均为3个重复。gydF4y2Ba

使用CFX96实时PCR检测系统（BIO-RAD），用SYBR预混物（Takara）进行RT-QPCR分析，gydF4y2BaEIF-4AgydF4y2Ba作为内标。RT-qPCR引物在附加文件中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S2。gydF4y2Ba

海藻糖含量的估计gydF4y2Ba

根据制造商的协议（Solarbio，BC0330）估算海藻糖含量。该方法的原理与溶于糖 - “蒽比例”的测定相同。唯一的区别是标准物质的应用。海藻糖（10mg / ml）用于在海藻糖含量测量中绘制标准曲线。然而，该方法具有一些限制，并且只能估计海藻糖含量，因为植物中其他可溶性糖产生的信号可能会影响确定。在MS培养基上生长的两周龄幼苗用或没有20％聚乙二醇（PEG）进行4小时，取样约0.1g叶片组织以确定海藻糖含量。将样品在液氮中研磨，加入1ml萃取缓冲液以均化。在室温下孵育45分钟（在孵育期间均匀混合3-5次），将样品以8000×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在25℃下10分钟。上清液用于测定海藻糖含量。首先，用标准海藻糖溶液（10mg / ml）绘制标准曲线。将0.25ml海藻糖标准液混合，用1ml蒽酮溶解在80％h中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba然后在95℃下保持水浴10分钟，并在620nm处记录混合物的吸光度。用相同的方法测定丙ped样品上清液。海藻糖含量由620nm的海藻糖标准曲线计算。gydF4y2Ba

分析HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba积累gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用DAB染色测量积累。对于DAB染色测定，在MS板上生长10d的幼苗未处理或用PEG6000处理24小时，然后在染色缓冲液中孵育（0.1mg / ml溶解在0.1M HCl，pH 3.8中的甜点。在12小时后，将幼苗在75％乙醇中散，用于后续显微镜检查。gydF4y2Ba

可溶性糖含量测定gydF4y2Ba

总可溶性糖的测量方法如参考文献所述[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．在塑料幻灯片上的十天幼苗用或没有20％PEG处理1 D，之后对其进行预约0.1g叶片组织以确定可溶性糖。收集0.1g的样品并在2.5mL DDH中均化gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.煮沸15分钟，在室温下冷却后，以12,000rpm离心15分钟。然后将上清液用于测定。将50μl上清液用2.5mL蒽酮摄入液体混合并煮沸10分钟，在室温下冷却，然后将混合物的吸光度记录在620nm。可溶性糖含量的含量根据620nm的葡萄糖的标准曲线计算。gydF4y2Ba

蔗糖含量测量gydF4y2Ba

由植物组织蔗糖含量检测试剂盒（Solarbio，BC2465）测定蔗糖含量。塑料载玻片上的十天幼苗用或没有20％PEG处理1 D，之后对蔗糖测量进行约0.1g叶片组织。将样品接地后，加入0.5mL萃取缓冲液并在80℃下孵育10分钟。之后，将样品在25℃下以4000×g离心10分钟。基本方法是间苯二酚法，方案与参考文献相似[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．将上述上清液50 μL加入50 μL 2 M NaOH中，在100℃煮沸5 min，室温冷却，然后与350 μL HCl和100 μL 0.1%间苯二酚混合。然后用100°C水洗10 min，冷却至室温。在A480处测定蔗糖含量。gydF4y2Ba

酵母一个杂化分析gydF4y2Ba

酵母单杂交试验是根据Matchmaker单杂交系统用户手册(Clontech)进行的。质粒gydF4y2BapJG4-5gydF4y2Ba用于表达Dreb1a创建猎物矢量。记者质粒gydF4y2BapLacZi-2μgydF4y2Ba被修改过gydF4y2BaPlaczi.gydF4y2Ba(Clontech)如前所述;它是一种高复制自主载体[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．为构建食饵载体，采用PCR方法从Phanta超保真DNA聚合酶(Vazyme)中扩增出DREB1A编码序列，并克隆到该载体中gydF4y2BapJG4-5gydF4y2Ba通过克隆表达载体ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme, C112-01)，利用pJG4-5与gydF4y2BaeCORI.gydF4y2Ba和gydF4y2BaXhoIgydF4y2Ba网站。带适配器的引物是DREB1A-F和DREB1A-R（附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S1)。创建诱饵向量gydF4y2Bap1-placzi-2μgydF4y2Ba， 这gydF4y2BaP1gydF4y2Ba含有DRE/ARE顺式元件的启动子区域。gydF4y2BaP1gydF4y2Ba通过PCR扩增P1-F和P1-R(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：表S1）使用野生型的基因组DNA模板。将PCR产物引入gydF4y2BapLacZi-2μgydF4y2Ba载体用克隆滤乱II使用线性化克隆套件gydF4y2BapLacZi-2μgydF4y2Ba与gydF4y2BaeCORI.gydF4y2Ba和gydF4y2BaKpnIgydF4y2Ba网站。将这两个构建物共转化到酵母菌株中gydF4y2Baegy48gydF4y2Ba通过Matchmaker一混合系统用户手册中描述的协议，并在缺乏Uracil和色氨酸的相应选择性丢弃介质（SD）上选择并补充X-GAL。在三个独立实验中并行测试每个相互作用三次。gydF4y2Ba

双荧光素酶报告器测定gydF4y2Ba

通过基因特异性引物DREB1A-F1和DREB1A-R1从WT cDNA扩增全长DREB1A开放阅读框（ORF）（附加​​文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S1)，并克隆到效应器向量中gydF4y2BaPGREENII62-SK.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba在…的控制下gydF4y2BaCaMV 35 sgydF4y2Ba．539英镑gydF4y2BaATTPPF P1gydF4y2Ba用特异性引物P1-F1和P1-R1扩增启动子片段(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S1)，然后连接到报告向量，gydF4y2Ba0800 - luc pGreen IIgydF4y2Ba［gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

将效应和记者构建体转化为gydF4y2Bagv3101gydF4y2Ba通过辅助质粒gydF4y2BapSoup-P19gydF4y2Ba．gydF4y2Ba农杆菌肿瘤GV3101gydF4y2Ba然后在以下组合和比例下渗透到烟草植物中浸润上述质粒：gydF4y2Ba吕克·+ 35 s: DREB1AgydF4y2Ba（1：9）;gydF4y2BaP1gydF4y2Ba：gydF4y2Ba吕克·+ 62 - skgydF4y2Ba（1：9）;gydF4y2BaP1:卢克gydF4y2Ba+gydF4y2Ba35 s: DREB1AgydF4y2Ba（1：9）;在21℃下在16-H光/ 8-H深色光周期下在生长室中渗入渗透烟草植物。之后，通过双荧光素酶报告系统（Promega）收获2厘米直径的叶片和Renilla测定，用Infinite200 Pro Microplate Reader（Tecan）。启动子活性表达为LUC至REN的比例。gydF4y2Ba

RNA测序（RNA-SEQ）和分析gydF4y2Ba

用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN 74904)提取2周龄幼苗总RNA。2微克RNA用于构建文库;每个样本重复三次。本研究使用的转录组数据集是通过Illumina HiSeq平台获得的，生成了150-bp高质量的修剪对端reads。利用HISAT2将修剪后的序列映射到拟南芥的参考基因组序列(gydF4y2Bahttp://ccb.jhu.edu/software/hisat2/faq.shtml.gydF4y2Ba），默认设置[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．使用edger分析差异表达的基因（gydF4y2Bahttp://bioinf.wehi.edu.au/edgeR/gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．如果基因的表达变化是WT的两倍以上，则认为其表达差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

在当前研究期间生成和分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。gydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

ABRE:gydF4y2Ba

ABA响应元件gydF4y2Ba

CaMV:gydF4y2Ba

花椰菜马赛克病毒gydF4y2Ba

去：gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

MAPK:gydF4y2Ba

促丝糖型活化蛋白激酶gydF4y2Ba

ORF：gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

qPCR:gydF4y2Ba

定量PCR.gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

rt - pcr:gydF4y2Ba

逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

山姆:gydF4y2Ba

技条顶端分生组织gydF4y2Ba

T6P：gydF4y2Ba

Trehalose-6-phosphategydF4y2Ba

泛太平洋伙伴关系:gydF4y2Ba

海藻糖-6-磷酸磷酸酶gydF4y2Ba

我们感谢Yuan Qin博士和刘辰博士供应gydF4y2BaAtTPPFgydF4y2BaT-DNA插入管线（Salk_087220）和Wassilewskija（WS）种子。gydF4y2Ba

该工作得到了中国国家自然科学基金（31771862和31471170）和甘蔗开放基金国家工程研究中心（2017.1.5）。资金机构没有参与数据的设计和收集，分析和对数据的解释以及写作稿件。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 林庆芳、杨焦对这项工作贡献相当。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 福建农林大学基因组学与生物技术中心，作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福建省海霞应用植物系统生物学重点实验室，福建福州350002gydF4y2Ba

   临丰林，焦阳，琼利王，洪朱，志勇陈，y阳道王gydF4y2Ba

2. 福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心，福建福州350002gydF4y2Ba

   凯王gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

KW和QFL设计了实验;QFL，JY，Hz，ZYC和YHD进行了实验工作;QFL，JY，Hz，ZYC和QLW进行了相关的数据分析;kw，qfl和qlw写了稿件。所有作者都读过并批准了稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba凯王gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

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