转录组分析毛虫vesicaria潜艇。水稻具有对比耐受聚乙二醇模拟干旱胁迫的线

背景

毛虫vesicaria无性系种群。水稻是甲壳素物种最具耐受性胁迫的物种之一。在我们之前的研究中，一些极其干旱的耐受/敏感毛虫获得线。然而，关于干旱耐受的机制很少毛虫．

方法

在这个研究二中大肠vesicaria潜艇。水稻对比鲜明的干旱耐受性线路用液体MS / PEG溶液进行处理。总RNA从7日龄全苗分离，然后应用于Illumina测序平台，为高通量转录测序。

结果

KEGG途径分析表明参与α-亚麻酸代谢该差异表达的基因（DEGS），酪氨酸代谢，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，半乳糖代谢，异喹啉生物碱的生物合成，莨菪烷，哌啶和吡啶类生物碱的生物合成，矿物吸收，均向上在耐旱特异性调控的（DT）毛虫干旱胁迫下线路，而参与核糖体，核糖体合成，嘧啶代谢，RNA降解，乙醛酸和二羧酸酯代谢DEGS，氨酰-tRNA的生物合成，柠檬酸循环，甲烷代谢，碳固定在光合生物，都下调。发现51度的视角是最显著上调（日志₂比例≥8）特异性在PEG处理下的DT系列中，包括乙烯响应转录因子，WRKY和BHLH转录因子，钙调素结合转录激活剂，富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶，丝裂原蛋白激活蛋白激酶激酶，Wd含有重复的蛋白质，OPDA还原酶，联烯氧化物环酶，水素，O-酰基转移酶WSD1，C-5甾醇去饱和酶，糖转运蛋白ERD6样12，海藻糖 - 磷酸磷酸酶和半乳糖醇合成酶4.这51次含量中的八个富含8 COG和17 KEGG路径。

结论

被发现最显着上调的DT在PEG处理下最显着上调，涉及精氨酸和脯氨酸代谢的次数的上调，α-亚麻酸代谢和碳固定和蛋白质合成的下调可能是至关重要的对于旱润耐受性毛虫．这些结果对揭示植物的抗旱性机制具有一定的参考价值毛虫而且还用于基因工程改善作物的耐旱性。

干旱是世界上最重要的环境压力之一[1那2那3.］.以前的研究表明，对干旱胁迫的植物反应是非常复杂的，并且在植物中探索耐旱耐受机制仍然是一个挑战[4.那5.那6.那7.］.利用Illumina HiSeq2000下一代测序（NGS）覆盖所述转录许多褶皱，并允许所检测到的转录物的定量[8.那9.］.通过使用下一代测序的基因的表达进行定量，从而能够进行定量的比较[10］.许多研究人员使用转录体测序来研究作物中干旱胁迫的反应[10那11那12那13那14那15那16］.

存在生物和遗传多样性的植物物种中的植物物种，然而，许多这些自适应机制都没有完全理解。使用对比度干旱耐受性的基因型的基因组鉴定干旱响应转录将有助于揭示代谢途径之间的相互作用响应干旱胁迫[12］.毛虫vesicaria无性系种群。水稻是十字花科植物中最耐旱的品种之一[17那18］.在我们之前的研究中，一些极其干旱的耐受/敏感毛虫获得线[19］.本研究利用Illumina测序技术，对耐旱(DT)和易旱(DS)中与耐旱相关的差异表达基因(DEGs)及其生化途径进行鉴定。毛虫基因型。一些选定的干旱应答基因的表达水平通过使用定量RT-PCR验证。据我们所知，这是关于整个转录组分析的第一份报告大肠vesicaria无性系种群。水稻．本研究结果为了解紫花苜蓿的抗旱性机制提供了有价值的转录组数据毛虫并且差异表达的基因对于改善作物中的耐旱性可能是有价值的。

Illumina RNA测序概述和De Novo集装箱大肠vesicaria潜艇。水稻转录

测序后总共314322210个原始读数产生25466002个干净读数，包括430166个N50值为638的独特基因 bp，平均长度511.56 英国石油公司。单基因长度在201到16517之间 bp（表1）1）.

该个Unigenes包括94463个集群和335703个单身。Among the unigenes there were 308,310 (71.67%) with length from 200 to 500 bp, 76,255 (17.73%) with length from 500 bp to 1000 bp, 24,662 (5.73%) with length from 1000 bp to 1500 bp, 11,229 (2.61%) with length from 1500 bp to 2000 bp, 9709 (2.26%) with length longer than 2000 bp, and no unigenes shorter than 200 bp (Table2）.

基于NR注释和电子价值分布，发现在注释的unigenes 51,486中（37.02％）共享非常强大的同源性（电子值<10^− 60），31,700（22.80％）具有强烈的同源性（10^− 60 < Evalue < 10^− 30）和55，904（40.19％）显示出同源性（10^− 30 < E值< 10⁻⁵)(图。1）.在未成年人83,392中，具有22.86-80％和55,698的身份高于80％。

关于物种分布，83034单基因（59.70％）有19.32-80％，56，056单基因（40.30％）有相似性高于80％之间的相似性。注释给N的139090个Unigenes的，36254（26.06％）不得不序列的匹配从芸苔栗鸟，后面是fromBrassica Rapa.（27894，20.05％），Eutrema salsugineum.（5366，3.86％），Hordeum Vulgare.(3578 2.57%),拟南芥(3391, 2.44%),Physcomitrella patens.（3289,2.36％），亚麻荠漂白亚麻纤维卷（3249，2.34％）（图2）.

COG注释和充实

总共有105052个单基因被输入COG（蛋白质同源群簇）数据库，并分配到25个COG功能簇（图。3.)，其中“一般功能预测”聚类中unigenes的数量最多(15,472个，14.73%)，其次是“翻译、核糖体结构与生物发生”(14,062个，13.39%)和“翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣”(10,244个，9.75%)。相比之下，只有110个unigenes被划分为“细胞运动性”，98个unigenes被划分为“核结构”，3个unigenes被划分为“细胞外结构”。3.）.

去Anotation和丰富

GO（基因本体论）被NR注解表示4953个Unigenes分为69组，可以被分类为三个主要类别：“生物过程”（2859），“细胞组分”（643）和“分子功能”（1451）。在个Unigenes的最大数目（984）参与了“催化活性”中的“分子功能”类;在“细胞成分”类个Unigenes（168）参与了“细胞部分”的数量最多;在“生物过程”类个Unigenes人数最多（534）参与了“代谢过程”（附加文件1）.

KEGG通路注释和unigene富集

总共28,295个unigenes注释为344 kegg路径（附加文件2）.不同的Kegg途径中的未成语的数量范围为1至3245.核糖体（KO03010,3245 unigenes，11.47％）的地图，其次是碳代谢（KO01200,1483 unigenes，5.24％），氨基生物合成酸（KO01230,1360，4.81％），内质网的蛋白质加工（KO04141,1230 unigenes，4.35％）。

Kegg途径和与干旱耐受相关的途径

差在耐旱之间的基因表达/敏感毛虫通过使用RSEM映射回到前的DE Novo组装结果来分析MS / PEG处理下的线。如图1所示。4.有5560，4654，9605，8979和13951个Unigenes示出差异表达包括在DT上调和下调的个Unigenes VS DS，DT-MS VS DT-PEG，DS-MS VS DS-PEG，DS-MS VS DT-MS，DS-PEG VS DT-PEG，分别。

在the DS-MS vs DS-PEG group, 646 DEGs were enriched in 14 KEGG pathways (Q value < 0.05), i.e., 405 in Ribosome, 32 in Drug metabolism-cytochrome P450, 32 in Plant-pathogen interaction, 26 in Tyrosine metabolism, 40 in Phenylalanine metabolism, 37 in Plant hormone signal transduction, 32 in Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450, 30 in Chemical carcinogenesis, 36 in Phenylpropanoid biosynthesis, 47 in Glutathione metabolism, 54 in Lysosome, 7 in D-Glutamine and D-glutamate metabolism, 3 in Biosynthesis of siderophore group nonribosomal peptides and 1 in Atrazine degradation (Additional file3.）.

在DT-MS和DT-PEG组中，395个DEGs富集在8个KEGG通路(Q值< 0.05)，即257个DEGs富集在核糖体中，42个DEGs富集在植物-致病菌相互作用中，20个DEGs富集在苯丙氨酸代谢中，31个DEGs富集在精氨酸和脯氨酸代谢中，39个DEGs富集在植物激素信号转导中，21个DEGs富集在苯丙氨酸生物合成中。13在α -亚麻酸代谢和41在d -谷氨酸代谢(附加文件4.）.

常见的途径在DS-MS VS-PEG和DT-MS VS DT-PEG之间是植物 - 病原体相互作用，苯丙氨酸代谢，植物激素信号转导，核糖体，苯丙酮化生物合成，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢;特异性在DS-MS VS-PEG中的途径是药物代谢 - 细胞色素P450，尿嘧啶降解，酪氨酸代谢，细胞色素P450的异种术，副血管生物合成，非纤维素肽，化学致癌物，谷胱甘肽代谢，谷胱甘肽代谢，谷胱甘肽代谢。特异性在DT-MS VS DT-PEG中的途径是精氨酸和脯氨酸代谢和α-亚麻酸代谢（附加文件3.和4.）.

参照Audic算法[20.]，FDR（假发现率）是基于的P.-Value对应于转录物的差异表达试验。通过使用“FDR≤0.05和日志的绝对值₂比≥1” 作为阈值，我们在DS-MS VS DS-PEG组3287个Unigenes上调和鉴定6318下调;在DT-MS VS DT-PEG夫妇，2299个Unigenes上调和2355下调（图4.）.它在DT-MS VS DT-PEG但不是在DS-MS VS DS-PEG已检测到2946度的视角，其中1584是上调和1362下调是具体地，449有N T个注释和552注释以232 KEGG途径（数据未示出）。

KEGG途径分析表明，在DT-MS VS DT-PEG但不是在参与α-亚麻酸代谢DS-MS VS DS-PEG，DEGS，酪氨酸代谢，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，半乳糖代谢，异喹啉生物碱的生物合成，稀氧烷，哌啶和吡啶生物碱生物合成，矿物吸收，都是上调的（原木₂比例≥1）;涉及核糖体，核糖体生物发生，嘧啶代谢，RNA降解，乙醛酸和二羧酸酯代谢，氨基酰基-TRNA生物合成，柠檬酸盐循环，甲烷代谢，甲烷代谢，碳固定在光合生物中的含量，都是下调的（日志₂Ratio ≤ − 1). Most DEGs involved in Porphyrin and chlorophyll metabolism, Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis, Arachidonic acid metabolism, Glutathione metabolism, glycerophospholipid metabolism, Phenylalanine metabolism, Plant-pathogen interaction, were up-regulated (log₂比例≥1）;参与细胞周期最DEGS，过氧化物酶体，碳代谢，在ER蛋白加工，肌动蛋白细胞骨架，精氨酸和脯氨酸代谢，丙酮酸代谢，磷酸戊糖途径，氮代谢，剪接体，细胞凋亡，赖氨酸降解，溶酶体，钙信号传导途径的调节，MAPK信号传导途径，丙代谢，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，蛋白酶体，嘌呤代谢，RNA运输，氧化磷酸化，下调（附加文件5.）.

在DT-MS VS DT-PEG中专门检测到的2946次DS-MS VS DS-PEG中，1890年对NCBI数据库进行爆炸点击（附加文件6.），其中51次最显着上调（日志₂比率≥8),包括3度trehalose-phosphate磷酸酶、2丙二烯氧化环化酶,ethylene-responsive转录因子2,1水通道蛋白TIP1-1, 2糖转运ERD 6 12日1转录因子MYC3-like, 1 senescence-associated 101 -,羧酸酯酶1 calmodulin-binding转录激活2,1对1 cysteine-rich受体蛋白激酶17日galactinol合酶4 1增殖蛋白激酶激酶4 1转录因子bHLH19-like, 1 C5-sterol desaturase, 1 WD repeat-containing蛋白质,WRKY转录因子1,1 O-acyltransferase WSD1, 2 low-temperature-induced 65 kDa蛋白质;其中有275个unigenes的表达显著下调(log₂Ratio ≤ − 8), including 38 DEGs for ribosomal protein. Fourteen of the 51 most significantly up-regulated DEGs were enriched in 8 COG pathways and 7 in 17 KEGG pathways (Additional file7.和8.）.

RNA-SEQ验证：qRT-PCR分析

对16个选定的基因进行定量RT-PCR（qRT-PCR）分析，以验证RNA-seq结果。ERF4（c189274 g1 i1）、MLO2（c205019 g2 i1）、铁蛋白（c194336 g1 i1）、受体样蛋白激酶（c203474 g1 i1）、脱水蛋白ERD14（c194017 g1 i1）、抗病蛋白RPP-13（c207395 g1 i3）、O-酰基转移酶WSD1样（c175262_g2_i1）、水通道蛋白TIP1（c194457_g2_i2）、前mRNA剪接因子CLF1（C161655G2I1），qRT PCR发现，在DT-MS和DT-PEG中，钾转运蛋白（c197830_g3_i1）、衰老相关羧酸酯酶（c191638_g3_i8）、转录因子MYC3（c187590_g3_i3）、早花3（c200550_g2_i1）表达上调；脯氨酸脱氢酶（c201592 g1 i1）；NRT1（c193030 g1 i3）、核糖体（c178914 g1 i1）在DT-MS和DT-PEG中被qRT PCR发现下调。qRT PCR结果与RNA seq结果一致（图。5.和6.）.

使用具有对比性干旱耐受的线的比较研究是用于识别干旱响应基因的有用工具。专门在耐受性基因型中鉴定Degs对于揭示负责应力耐受性的机制是有价值的[21］.在本研究中，我们提供了两种植物的完整幼苗的详细转录组谱毛虫具有对比的耐旱性的线条。

ABA响应与胁迫信号转导

干旱胁迫诱导ABA积累，从而导致气孔闭合，以保持植物中的水位[22那23那24]. 证据表明怀疑包括ABA诱导的蛋白质，在水稻中的干旱胁迫下上调[25］.oswrky45过度表达增加了干旱耐受性[26]，而激活的表达WRKY57产生了耐旱能力拟南芥[27］.在本研究中，196°的腕骨转录因子19°的衣物转录因子在干旱耐受性中明显上调毛虫干旱胁迫下的线（以下称为显着上调），其中用于衣物转录因子55样（C195662 G1 I2）在耐旱中最显着上调（C195662 G1 I2）毛虫PEG模拟干旱胁迫下的线PI 426649（以下称为最明显上调）。

基本螺旋 - 环 - 螺旋（bHLH）基因在植物激素信号传导很重要的。赖斯OsbHLH148用OsJAZ蛋白质相互作用[赋予耐旱性28］.拟南芥bHLH122和PebHLH35从Populus Euphratica.是干旱和耐盐性和渗透信号的正调节因子[29那30.］.在这项研究中5度的视角对转录因子的bHLH均下调，8上调，其中一个转录因子bHLH19样（c196938 G3 I6）是最显著上调（附加文件6.）.

Ethylene-responsive转录因子

以前的研究表明，乙烯响应转录因子（ERF）参与植物中非生物应激反应[31.］.转录GhERF4是迅速增加gossypium hirsutum当植物暴露于盐胁迫时[32.，过度表达ERF增加耐旱性[33.那34.那35.那36.]. 在这项研究中，乙烯反应转录因子的18个DEG中有17个上调，其中ERF056的两个（c163592 g1 i1，c163592 g2 i1）上调最为显著（其他文件6.）.

抗氧化剂和ROS调制

活性氧物质（ROS）常常作为第二信使在响应不同的刺激[调制气孔关闭22那37.］.在拟南芥钙调素结合转录激活因子1（AtCAMTA1）通过诱导ABA对干旱胁迫的反应参与膜完整性的调节。这个camta1突变体高易受干旱胁迫的影响[38.］.在这项研究中10度的视角为钙调蛋白结合蛋白均上调，其中一个用于钙调蛋白结合转录激活2样（c195596 G1 I7）是最显著上调（附加文件6.）.

Mos富含半胱氨酸受体样激酶(CRKs)受ROS调控[39.］.有人发现CRK45通过诱导aba响应和胁迫诱导基因的表达，正调控植物对干旱和盐胁迫的响应。CRK45过度表达增强植物的耐旱性[40］.过度表达拟南芥CRK5也增加了ABA的敏感性，从而增强了抗旱性[41.］.在该研究中，上调了富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶的12℃的10℃，其中用于半胱氨酸的受体样蛋白激酶17（C196393 G1 I2）最显着上调（附加文件6.）.

已经表明，Mapks参与了对不同环境刺激的响应中的植物信号转导[42.那43.那44.那45.那46.］.MAPK、MAPKK和MAPKK激酶构成一个功能性MAPK级联。MAPK的激活有助于其转位到细胞核磷酸化并激活转录因子[47.］.AtMKK1在拟南芥激活ATMPK3以转移非生物速度信号[48.]. NtMEK2（MAPKK）激活WIPK和SIPK进行干旱信号传输[49.］.过度表达ghmkk1.增加耐旱性尼古利亚娜·宾夕法尼亚州[41.］.过度表达AtMKK1在里面拟南芥ROS水平降低，耐旱性增强，而AtMKK1缺乏导致ROS升高，促进耐受性增加了敏感性[50.］.植物在表达AtMKK4在干旱胁迫下，活性氧积累较少，水分流失较少[51.]）。在该研究中，最显着上调（C198487 G1 I1）的一项用于丝裂原激活的蛋白激酶激酶4（C198487 G1 I1）（附加文件6.）.

南汽基因如snac3.有助于抗旱和渗透调制与ABA相似[52.］.snac3.可与WD结构域蛋白互作调节水稻活性氧。在本研究中，NAC结构域蛋白的13个DEG全部上调，其中WD重复蛋白53 (c198319 g1 i2)的一个DEG上调最显著(附加文件)6.）.

α-亚麻酸，茉莉甲酸信号和细胞膜稳定性

植物在逆境中通过调节油酸和亚麻酸的水平来保持膜的流动性和完整性[53.］.α-亚麻酸为信使包括通过氧化修饰[产生茉莉酮酸的主要前体54.那55.那56.］.反义的表达拟南芥-3脂肪酸去饱和酶基因导致烟草耐盐/耐旱性降低[57.]，而过度表达FAD3或FAD8提高了抗旱能力[58.］.Lenka等人[12发现干旱耐水稻干旱胁迫显着诱导含有α-亚麻酸代谢的八种酶。在本研究中，我们还发现所有参与α-亚麻酸代谢的次数上调（附加文件5.）.

茉莉酸（JA）在干旱胁迫期间在气孔闭合中发挥着关键作用[59.］.它也涉及生产抗氧化剂抗坏血酸调节和谷胱甘肽代谢[的60.］.基于由维克和齐默尔曼[确立的途径61.]， JA由α -亚麻酸产生，在此过程中氧化烯环化酶和OPDA还原酶(OPR)起重要作用[62.那63.那64.那65.那66.］.在这项研究中，上调了所有四次OPDA还原酶和9℃的氧化烯环环酶（C184414 G1 I1，C184414 G2 I1）的两次，最显着上调（附加文件6.）.

以前的研究表明，水通道蛋白（通道蛋白）起到降低离子渗漏（IL）和丙二醛（MDA）中起重要作用，从而减小由非生物胁迫膜损伤[67.］.香蕉水通道蛋白基因的表达MAPIP1; 1提高盐胁迫下的耐盐性拟南芥[68.］.在这项研究中，最显着上调的Aquaporin Tip1-1（C194457 G2 I2）中的一项（附加文件6.）.

表皮的蜡在逆境条件下减少非气孔失水[中发挥重要作用69.］.C-5甾醇去饱和酶催化C-5双键的掺入D7甾醇中以形成D5，7-甾醇。真菌过度表达C-5去饱和酶固醇在番茄增加蜡沉积和干旱耐受性[70]. 在这项研究中，C-5甾醇去饱和酶（c201142 g1 i2）的一个DEG最显著上调（补充文件6.）.

O-酰基转移酶WSD1也涉及皮带蜡生物合成[71]. 张等[35.]表示KCS.和WSD.和他们的上游调节剂在干旱胁迫下上调。在该研究中，最显着上调O-酰基转移酶WSD1样（C175262 G2 I1）的一项用于O-酰基转移酶（C175262 G2 I1）（附加文件6.）.

海藻糖，半乳糖苷和糖转运

在植物中的各种非生物胁迫导致糖分积累在液泡[72那73那74]，这表明糖生物合成和空泡糖转运蛋白在这些条件下发挥重要作用。糖转运ERD6干旱胁迫诱导表达[75]， 尽管ERD6-like运输车（ESL1）表达由干旱和ABA处理[增强76］.在这项研究中2个DEGS为糖转运ERD 6样12（c197650_g1_i3，c197650_g1_i5）的最显著上调（附加文件6.）.

海藻糖也是保护植物免受胁迫[重要77］.海藻糖-6-磷酸(T6P)被认为是响应环境的信号代谢物[78］.在植物中，T6P被海藻糖-6-磷酸磷酸酶去磷酸化，产生海藻糖[79］.在本研究中，海藻糖-磷酸磷酸酶的6个deg均上调，其中3个上调最多(附加文件)6.）.

半乳糖醇合成酶（GOLS）在蔗糖和RFO之间的碳分区中起重要作用GOL.基因产物报功能应对非生物胁迫[80那81那82那83］.转基因拟南芥和Brachypodium distachyon过度表达AtGolS2累积更多的半乳糖醇和棉子糖，并显示出增强的旱耐水性[84那85］.在这项研究中一个单一基因的半乳糖苷合酶4（c194151 G2 I3）是最显著上调（附加文件6.）.

碳固定和蛋白质合成的下调

Lenka等人[12发现，在干旱胁迫下，碳固定上调，而在这项研究中，我们发现在耐旱性中毛虫光合生物中的碳固定的碳固定线在干旱胁迫下全部下调（附加文件5.）.核糖体是对于蛋白质合成的地方。丁德萨和比尤利[86氨基酸掺入]发现下降和耐旱苔多核糖体人口Tortula Ruralis.在干旱压力下。在该研究中，Kegg途径分析表明，核糖体，核糖体生物发生，氨基酰基-TRNA生物合成中涉及的次数在耐旱中均下调毛虫在PEG模拟的干旱胁迫（附加文件5.）;Blast分析还表明，10 9的DEGS用于翻译起始因子，8度的视角ATP合酶，6度的视角为核糖体RNA基因，5 6的DEGS用于真核翻译起始因子，121度的视角为核糖体蛋白118，被下调，其中该38度的视角为核糖体蛋白进行了最显著下调（附加文件6.)，表示毛虫也可能通过在光合生物蛋白质的合成和固碳的下调对干旱胁迫响应。

其他途径和可能与天旱耐受相关

在this study it was found that two DEGs for low-temperature-induced 65 kDa protein-like (c183129 g1 i2, c183129 g3 i4), one for lipase ROG1 (c185493 g1 i1), one for disease resistance protein (c192485 g1 i11), one for amino-acid permease BAT1 (c205647 g1 i3), one for ankyrin repeat-containing protein (c201331 g1 i3), one for acyl-activating enzyme 19 (c188918 g1 i1), one for phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 6 (c195141 g2 i3), one for potassium transporter 9-like (c197830 g3 i1), one for phosphoglycerate mutase-like protein 2 (c190346 g1 i4) were most significantly up-regulated (Additional file6.）.它们在耐旱方面的作用有待进一步探索。

所有deg均上调的KEGG通路，如酪氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、半乳糖代谢、异喹啉生物碱的生物合成、莨菪碱、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、矿物吸收;大多数deg上调的KEGG通路，如卟啉和叶绿素代谢、泛素酮等萜类-醌类生物合成、花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢、植物-病原体相互作用等均上调(Additional file)5.）.BLAST分析表明，所有5次脱水响应元件结合蛋白，谷胱甘肽S转移酶9的9个，转录因子MYB的8个，10℃，钙素B样蛋白的4个，5摄氏度，所有16次受体样蛋白激酶，含有17℃的含有CCCH结构域域的蛋白质，所有14次用于F箱蛋白质，上调（附加文件6.）.这些上调的通路和DEGs也可能在植物抗旱性中发挥重要作用毛虫．

基于转录组分析，我们推测乙烯响应转录因子、WRKY和bHLH转录因子中上调最显著的DEGs参与胁迫信号传导和ABA响应;参与抗氧化剂和ROS调节的钙调素结合转录激活因子、富半胱氨酸受体样蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶和WD重复含蛋白的DEGs;参与JA生产的OPDA还原酶和烯丙基氧化环化酶的DEGs，参与d5,7 -甾醇生产的C-5甾醇去饱和酶，参与减少离子泄漏的水通道蛋白和参与表皮蜡生物合成的丙二醛，参与角层蜡生物合成的o -酰基转移酶WSD1;海藻糖磷酸磷酸酶、半乳糖醇合酶4和糖转运体ERD 6-like 12参与渗透保护剂的生产，上调参与α -亚麻酸代谢的DEGs，下调碳固定和蛋白质合成可能是耐干旱的关键毛虫线PI 426649.这些结果可能是在耐旱的揭示机制有价值毛虫提高作物中的耐旱性。

材料

在这工作毛虫vesicaria无性系种群。水稻PI 426649和PI 426652对peg模拟干旱胁迫高度敏感[19]被用于转录分析。

方法

组织取样、RNA提取、文库制备和Illumina测序

毛虫PI 426649和PI 426652的种子最初来自农业研究服务，USDA在浸入液体MS培养基中的滤纸上发芽[87]没有糖或有机成分。七天后，用20％PEG-6000 /液体MS处理幼苗，然后在液氮中收获并冷冻，然后储存在-80℃。耐旱PI 426649表示为“DT和干旱敏感PI 426652表示为”DS“。用液体MS培养基处理如“MS”表示，同时用PEG处理表示为“PEG”。对于本研究，采取了四个样品（DT-MS，DT-PEG，DS-MS，DS-PEG），其具有两个生物重复。根据制造商的方案，从使用Trizol总RNA提取试剂（Takara）在-80℃下储存的整个幼苗中分离总RNA。RNA完整性由1.5％的人凝胶电泳验证，并使用2100生物分析仪分析仪（Agilent，CA，USA）确认。如所述进行MRNA富集，RNA碎片，第一和第二链CDNA合成和净化，测序适配器连接和PCR扩增。14］.这libraries were applied to Illumina sequencing platform (HiSeq 2000, SanDiego, CA, USA) for high-throughput sequencing using a paired-end read protocol with 100 bp of data collected per run.

从头序列组装，集群和同源性搜索

测序后，使用Illumina提供的Casava程序包将原始图像数据转换为序列数据，并保存为FASTQ格式的原始读取，然后用Trimmomatic（V0.30）处理以获得清洁读取。通过短读组装程序 - 三位一体进行转录组De Novo组件（R2013-02-25）[88]. 通过TGICL将每个样本组装的单基因进一步进行序列剪接和冗余去除，以获得尽可能长的非冗余单基因[89］.

功能注释

Blastx alignment (E-value < 0.00001) between unigenes and protein databases like Nr (NCBI non-redundant database), KEGG (Kyoto Encyclopedia Of Genes and Genomes,www.genome.jp/kegg/)和COG(同源组蛋白簇，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/)按所述执行[90］.上午十时正注释后，Blast2GO程序来获得GO注释的个Unigenes。WEGO软件用来做GO功能分类的所有个Unigenes和了解基因功能在宏观层面上的物种分布[91]. KEGG路径注释在KEGG自动注释服务器（KAAS）上使用双向最佳命中方法（BBH）进行。

分析差异表达基因（DEGS），GO和KEGG途径富集

阅读耐旱而敏感毛虫使用PEG / MS治疗的含量使用RSEM映射回我们的DE Novo组装结果[92］.为了评估基因的表达，计算唯一匹配reads的数量，然后将其归一化为FPKM(每千碱基的转录本片段/百万映射reads)，然后在| log的限制条件下计算单基因表达量₂比例|≥1.0和fdr≤0.05。使用BLAST2GO进行这些DEG的富集分析P.- 使用Q值≤1，使用Q值≤1使用路径发现器软件进行≤1和途径富集分析。

qRT-PCR验证差异表达基因

为了确认RNA-SEQ结果，选择一些转录标签用于定量RT-PCR（QRT-PCR）分析。根据Bioer（杭州，中国）制造商说明书和相对基因表达水平的三重药物进行三次QRT-PCRS由2^-ΔΔct方法[93］.在附加文件中列出的寄生9.由GenScript(南京)有限公司设计合成，用于qRT-PCR。

本研究中生成和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

阿巴：

脱落酸

aqp:

水通道蛋白

BBH：

双向最佳点击方法

bHLH:

基本的螺旋 - 环 - 螺旋

CAMTA：

Calmodulin-binding转录激活

齿轮:

直际蛋白质群体

CRKs:

Cysteine-rich受体激酶

度数：

差异表达基因

DS：

干旱敏感

DT：

耐旱

ERD：

早期脱水反应

ERF：

Ethylene-responsive转录因子

FDR：

错误发现率

FPKM:

每千克的碎片数百万映射读数

走：

基因本体论

高尔:

半乳糖醇合成酶

IL：

离子泄漏

是:

茉莉酸

KAAS：

Kegg自动注释服务器

KEGG:

京都百科全书的基因和基因组

MDA:

丙二醛

多发性硬化症：

的Murashige-斯库格

ngs：

下一代测序

NR：

NCBI非冗余数据库

opda：

12- obophytodienoate.

PEG：

聚乙二醇

Q-RT-PCR：

定量RT-PCR

ROS：

反应性氧气

由于GENEWIZ在中国苏州，与转录分析进行帮助。

（; 2017YFD0101701 2016YFD0100202-23）在这项研究中资料的收集和耐旱性评价是财政由中国国家重点研究发展计划的支持;转录组测序和数据分析是由中国国家自然科学基金（31771829）的支持。

隶属关系

1. 湖北大学生命科学学院生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北武汉430062

   黄邦莲，李萱，刘沛，马兰，吴文华，黄邦权

2. 江苏微生物生物环境工程有限公司，无锡，214122

   Bang-Lian黄

3. 农业部武汉，430062，中国生物学重点实验室和油料作物的遗传改良，油料作物研究所，中国农业科学院的，

   雪坤张

4. 作物遗传改良，植物科学技术学院，华中农业大学学院，武汉，430070，中国国家重点实验室

   Zaiyun Li.

贡献

HB，LZ和ZX构思的实验以及是否完成了纸，HB-L进行大多数实验和制备的手稿，LX，LP，ML和WW帮助与材料制备，RNA分离，定量RT-PCR和数据分析。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于Bangquan Huang.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商说明

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