葡萄风信子R2R3-MYB菌株MaMybA与MaAN2不同，能使烟草产生强烈的品红花青素色素GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

花中的主要颜料是花青素，其生物合成主要由R2R3-MOBS调节。GydF4y2BaMuscari armeniacumGydF4y2Ba是一种观赏花园植物，开深蓝色的花，花青素为基础。与花青素相关的R2R3-MYB MaAN2此前已在GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花;在这里，我们还对一种新的R2R3-MYB MaMybA进行了表征，以确定其功能，并突出MaMybA与MaAN2之间的异同。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

本研究从花青素中分离到一个新的R2R3-MYB基因GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花和功能鉴定。序列比对显示MaMybA中含有典型的与MaAN2及其同源基因保守的基序。MaMybA与MaAN2的氨基酸序列同源性为43.5%。系统发育分析表明，它们均聚在R2R3-MYB家族的AN2亚群中，但不在同一分支。我们还鉴定了一个IIIf bHLH蛋白，MabHLH1GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花。双分子荧光互补实验表明，MabHLH1与MaMybA或MaAN2在体内相互作用;双荧光素酶检测表明MaMybA单独或与MabHLH1相互作用均可调控MabHLH1的表达GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba，但Maan2要求mabhlh1这样做。过度表达时GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在GydF4y2Ba尼科尼亚塔哈瓦姆GydF4y2Ba’NC89’转基因烟草叶片、花瓣、花药和花萼的花色苷呈强烈的品红色，而OE-转基因烟草的花色苷则呈强烈的品红色GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba植物有较轻的色素沉着。但是，OE的卵巢壁和种子皮肤GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草几乎没有着色，而OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba烟草是红紫色的。此外，过表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba与OE-相比，能明显改善烟草花青素色素沉着GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba和控制植物，通过大量上调花青素的生物合成和内源性GydF4y2BaBhlh.GydF4y2Ba基因。值得注意的是GydF4y2BaNtF3的5是什么GydF4y2Ba在OE -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草可能导致飞燕草苷3-芦丁苷的额外积累，这在OE-中几乎没有检测到GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba和控制植物。我们得出结论，高浓度的花青素和新产生的DP3R导致OE的颜色较暗GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba与OE相比GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba烟草。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

新鉴定的R2R3-MYB转录因子MamyBA在花青素生物合成中的作用，但与MAAN2有一些差异;Mamyba也可用于修改观赏植物中的花色。GydF4y2Ba

令人满意的花色是观赏植物的典型特征[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba];它主要是由花青素、类胡萝卜素和甜菜碱[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．花青素是花、水果和其他植物组织中的主要色素，能赋予从红色到紫色/蓝色的各种颜色。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．它们还在花授粉中起作用，增强植物对生物和非生物胁迫的耐受性。此外，它们在食品工业中很重要，在那里它们用作安全和自然着色剂[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．花青素生物合成途径，其中花青素生物合成基因及其调节剂对生产花青素至关重要，是广泛和彻底的研究的主题[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．近年来，基因工程已被证明是一种有希望的花卉颜色修改方法[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba];在观赏植物中，主要方法是通过遗传调节进行花青素合成的分子育种[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．虽然有许多成功的例子，在各种观赏植物的花修饰工程，或通过过表达或沉默多种花青素生物合成基因，如非洲菊[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba],玫瑰[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba],康乃馨[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]和菊花[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba[调节蛋白还可以在控制花青素生物合成中具有相当大的潜力。GydF4y2Ba

花青素生物合成调节因子包括R2R3-MYB转录因子(TFs)、其配对的基本螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白和WD-repeat (WDR)蛋白;它们共同形成MYB-bHLH-WDR (MBW)复合物，其中调控花青素生物合成的R2R3-MYBs是决定植物色素沉积强度和模式的关键转录因子[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．双子叶和单子叶观赏植物中均存在R2R3-MYBs。在双子叶观赏植物中，例如AmRosea1, AmRosea2和AmvenosaGydF4y2BaAntirrhinum Majus.GydF4y2Ba已被证明可以控制花不同部位花青素的积累[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba桔梗GydF4y2Ba,过度的GydF4y2BaAmRosea1GydF4y2Ba导致花青素的水平增加和转基因植物的花瓣和萼片中的改变颜色[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．另外，表达两者GydF4y2BaAmRosea1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAmDelilaGydF4y2Ba(它编码与金鱼花花色苷色素沉着相关的bHLH蛋白)已经被证明可以在转基因番茄果实的果皮和果肉中诱导高浓度的基于飞燕草苷(Dp-)的花色苷[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．GMYB10，一种促进花青素的R2R3-MYBGydF4y2Ba非洲菊矮牵牛GydF4y2Ba，过度表达GydF4y2Ba非洲菊GydF4y2Ba栽培品种“露天素”（基于Pelargonidin的花），显然增强了花青素水平，诱导新型Cyanidin（Cy）生物合成[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．在单子叶花，GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2BaLHMYB12-LAT [GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba安杉西亚姆GydF4y2BaAaMYB2 [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaMuscari armeniacumGydF4y2BaMaAN2 [GydF4y2Ba17GydF4y2Ba已被证明能促进烟草植株中花青素的积累。在模型工厂GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba，PAP1和PAP2在过表达转基因时增加了花青素积累GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba、烟草和GydF4y2Ba罗莎矮牵牛GydF4y2Ba[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．因此，对这些花色苷调控因子的鉴定对花色苷的分子育种具有重要意义，对花色苷在食品工业中的应用具有重要意义。GydF4y2Ba

葡萄风信子(GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba)是一种多年生球茎单子叶植物，在中春开花，常被用作园林观赏植物。它的花是天然的深钴蓝色，含有基于dp的花青素[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]，它为单像中的蓝色花色研究提供合适的材料[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．在我们之前的研究中，我们通过功能注释在转录组中只筛选到一个与花青素相关的R2R2-MYB单基因GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba[然后将其命名为Maan2，其鉴定它可以诱导烟草中的花青素积累，并与BHLH蛋白，ATTT8相互作用，以调节花青素晚生物合成基因的表达（LBGS;即，GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba和GydF4y2BaMaANSGydF4y2Ba） [GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]。在本研究中，我们挖掘了一个新的与花青素相关的R2R3-MYB TF，命名为MaMybA，使用了典型的花青素调节剂AtPAP1GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba鲜花转录组(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，由本地BLASTP (BLAST蛋白数据库)检测。我们发现MaMybA与MaAN2不同，进一步验证了MaMybA的功能GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在烟草中异源表达的花青素生物合成中。该研究旨在确定治理着色的监管机制GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba鲜花，鉴定有价值的花青素促进调节基因，用于在观赏植物中改变花色，并确定在花青素合成中Mamyba和Maan2之间的相似性和差异。GydF4y2Ba

MaMybA菌株R2R3-MYB序列比对及系统发育分析GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba

用局部BLASTP筛选一个R2R3-MYB UNIGENE，使用来自Ahthocyanin相关的R2R3-MYB TF ATPAP1GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花转录组(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．其全长cDNA序列通过RACE-PCR获得。711 BP开放阅读框架（ORF）GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba编码237个氨基酸。将cDNA序列提交给NCBI Genbank（登录号MF663728）。GydF4y2Ba

序列对准表明，高度保守的MyB结构域（即，R2R3重复）存在于MamyBA，Maan2和其他与之相关的r2R3-Mybs的N-末端（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa).此外，一个保守motif [D/E]LXGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba[r / k] xGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaLXGydF4y2Ba_6.GydF4y2BaLXGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaR，它是MYB结构域与R样bHLH蛋白相互作用所必需的[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]，存在于MaMybA，MaAN2和其他花青素相关R2R3-MYBS（图的R3重复。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa).考虑整个氨基酸序列，MaMybA与MaAN2的同源性仅为43.5%，与EgVIR(控制种子颜色的R2R3-MYB)的同源性仅为47.3%GydF4y2BaElaeis Guineensis.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]和43.07％的共享身份与ACMYB1（R2R3-MYB调节灯泡的花青素积累）GydF4y2Ba洋葱GydF4y2Ba） [GydF4y2Ba26GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一个)。此外，Mamyba和Maan2在R2R3重复中共用三个保守的氨基酸[Arg（R），Val（V）和Ala（A）]，以及高度保守的基序[k / R] p [q / r] p [Q / R]在C末端的eybs中的eudicots和一些单焦点的亚组中的mybs（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一个)。GydF4y2Ba

系统发育分析表明MaMybA与MaAN2、AtPAP1、LhMYB6和AcMYB1聚类为AN2亚群，与AcMYB1关联最密切(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。然而，从单子宫家庭Poaceae和兰科的Mybs被分组到C1亚组中（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab).此外，的相对表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在根、鳞茎、叶和5个不同的花发育阶段(S1~S5)显示GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在有色花中主要表达。mRNA水平GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在S1的根，灯泡和舞台上的鲜花中非常低，比叶子低得多。这GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba花中转录因子逐渐增加，在S3期达到峰值，然后从S3期到S4期略有下降，在S5期呈现下降趋势(图4)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac)。GydF4y2Ba

Mamyba本地化在细胞核中并具有转录激活能力GydF4y2Ba

为了检测Mamyba的亚细胞定位，质粒35s：GFP（绿色荧光蛋白）和MamyBA-GFP与Athy5-（细长的次杆子5; AT5G11260）MCHERRY分别分别是COTRANSFORMEDGydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba叶肉原生质体。MaMybA的GFP荧光与AtHY5的mCherry荧光重叠，AtHY5是一种已知的核蛋白[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]，表明Mamyba在核中局部化GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba原生质体(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

我们在酵母中进行了反式激活测定，以评估Mamyba的转录激活能力。如附加文件所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba图S1，仅转化阳性对照(pGBKT7-53 + pGADT7-T)的酵母，pGBKT7/MaMybA质粒在添加40 μg mL的SD/-Trp培养基中能够生长GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}X-α-GAL和200ng mlGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}aureobasidin A (AbA)，呈蓝色斑块。阴性对照在SD/-Trp + 200 ng mL培养基中不能生长GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}ABA或40μgmlGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}X-α-GAL和200ng mlGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}阿坝。结果表明，Mamyba具有转录激活能力。GydF4y2Ba

MabHLH1与MaMybA或MaAN2在体内相互作用GydF4y2Ba

R2R3-MYBS已报告与IIIF的bHLH蛋白调节花青素合成[互动GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．我们从该基因的转录组中筛选到一个与花青素相关的bHLH单基因GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba使用R-like IIIf bHLH蛋白AtTT8进行局部BLASTP。获得了全长为2001 bp的cDNAGydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的花朵，并命名GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba(MF663729)。MabHLH1在n端包含一个高度保守的MYB相互作用区域，在c端包含一个bHLH DNA结合区域(附加文件)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2a)。系统发育分析显示，MabHLH1与LhbHLH1和ZmLC一起被归入类黄酮相关bHLH蛋白IIIf亚群的LC/JAF13/DEL分支(Additional file)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2b)，在不同组织中也有组构表达GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图。S2C）。亚细胞定位和转录激活能力测定结果显示MabhlH1在细胞核中定位并具有转移能力，因此意味着它是TF（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:图S3)。然后通过双分子荧光互补(BiFC)试验验证MabHLH1与MaMybA或MaAN2在体内的相互作用(图)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa). YC/MaMybA与YN/MabHLH1或YC/MabHLH1与YN/MaAN2共表达GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba叶表皮细胞核中可见黄色荧光蛋白(YFP)荧光(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).因此，MabHLH1被证明是一个与花青素相关的R2R3-MYBs相互作用的蛋白GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba，它能够在体内与Mamyba或Maan2互动。GydF4y2Ba

MaMybA激活了花青素生物合成基因启动子GydF4y2Ba

为了研究Mamyba或mabhlH1是否能够控制花青素生物合成基因的表达，对双荧光素酶测定进行GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba叶子(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).花青素早期生物合成基因(EBG)的启动子GydF4y2Ba马赫GydF4y2Ba（GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba；KY781171）和关键的LBG，GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba（GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba；AT5G42800)和GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba（GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba；KY781169)，与LUC(萤火虫荧光素酶)融合。GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba， 和GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba由35S启动子驱动。每个或两个tf与每个启动子共同渗透。结果表明，单个或两种转录因子均不能提高启动子的活性GydF4y2Ba马赫GydF4y2Ba．然而，单独的Mamyba可以激活GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba而MaAN2和MabHLH1均不能激活两者。MaMybA与MabHLH1共表达时，MabHLH1的启动子活性GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba被显著促进，由1.6和1.1倍当与单独MaMybA渗透，分别（图高于。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab). MaAN2与MabHLH1共渗时，启动子活性GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba与单独浸润MaAN2相比，分别提高了4.0倍和22.2倍。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).因此，结果表明MaMybA单独或与MabHLH1相互作用均可控制MabHLH1的转录GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba但是，Maan2要求与Mabhlh1直接互动。GydF4y2Ba

异源表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在烟草中强烈促进花青素的积累GydF4y2Ba

为了表征函数GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba那GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba由35S启动子驱动的转化为烟草（GydF4y2Ban .烟草GydF4y2Ba' NC89 ')叶盘由一个GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba介导的转换。三个TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba过度表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba(OE -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba）转基因品系，命名为OE＃1，OE＃2，和OE＃3，产生了（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba此外，TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba过度表达GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba(3个OE-中色素沉着线(即线2)最多)GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba转基因植物关于Chen等人。[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba)作为阳性对照(OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba），并且将空载体转基因植物用作阴性对照（对照）。结果表明，Mamyba强烈增加了花青素生产，并在烟草中赋予强烈的红紫色，特别是在叶子，花萼，花瓣和花药中（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa-c)，而子房壁和种皮几乎没有花青素色素沉着(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC，D）。但是，OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba烟草呈现在叶，花萼轻得多的洋红色，和花药比没有OE-GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草;然而，卵巢壁和种子皮肤都是用红色颜色的色素沉着，并且花冠深粉红色（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba模拟)。GydF4y2Ba

花的颜色与花器官内部或表面的组织形态以及花细胞中花青素色素的类型和含量有关;然而，色素是关键的决定因素[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．我们首先使用高效液相色谱法（HPLC）确定携带烟草中花青素的含量和类型。花青素浓度在叶子和三个OE的花冠GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草明显高于OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba并控制脚趾（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae, f)GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba叶子比OE高为1.25至2倍 -GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba叶子。三行的花青素水平 -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba花冠比OE高1.8至4.3倍 -GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba花冠，比对照花冠的高6.9-至16.7倍（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae，f）。在对照烟草叶中几乎不可检测到花青素（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae,无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一个，附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S4)。其次，我们在3个OE-的叶片和花冠中检测到2个主要花青素(峰1和峰2)GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba行(OE#3作为图中的代表。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一个;额外的文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S4)，而在对照和三个OE-的花冠中主要检测到一个单一的花青素(峰2)GydF4y2Ba马南GydF4y2BaChen等人提到的[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba)(图中第2行为代表。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一个，附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S4)。GydF4y2Ba

以前的研究表明，烟草中的原发性花青素是Cyanidin 3- rutinoside（Cy3R）[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba];Delphinidin 3- rutinoside（DP3R）和Cy3R标准物的保留时间非常接近峰1和2（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba),分别;和Dp (a峰)和Cy (b峰)的水解检测(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。因此，我们做了一个初步推测峰1和2分别表示Dp3R和Cy3R。此外，两个花青素是超高效液相色谱（UPLC） - 时间飞行（TOF）-Tandem质谱（MS / MS）分析证实。详细地，峰1在611.1601的质量 - 电荷比（M / Z）[M]表明典型的分子离子GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba（CGydF4y2Ba_27GydF4y2BaHGydF4y2Ba_31.GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_16GydF4y2Ba），其与DP3R的分子量一致。另外，两个产物离子，一个在M / z 465.1018和m / z 303中的产物离子表明，从一个分子的DP分子释放一个葡萄糖和鼠李酮中的一种分子（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac)。另外，代谢物也用于搜索Scifinder和Reaxys数据库。因此，峰值1和2被识别为代表DP3R和Cy3R（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:图S5)。GydF4y2Ba

此外，显微镜观察表明，在对照烟草的这些细胞类型中没有发现花青素(附加文件)GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:图S6a-d)。花青素主要积聚在栅栏薄壁组织、背面表皮细胞和毛状体中GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba和OE -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟叶(另附档案GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：图S6E-1）。花青素也散落在Adaxial表皮细胞，海绵状实质和皮下粥幼儿细胞中（附加档案GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba(图S6 g, h, k, l)GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba和OE -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba植物，根据扫描电子显微镜（附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba：图S7）。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在烟草中上调花青素途径基因的表达水平GydF4y2Ba

我们首先进行定量实时聚合酶链反应（QRT-PCR）测定以测试GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba转基因烟草中的转录物，发现GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在三种转基因系（OE＃1，OE＃2和OE＃3）的叶子和花冠中表达，但不在阴性对照植物中（即，控制，图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa, d).此外，GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba也表达在阳性对照烟草（即，OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa, d)。接下来，我们对对照OE-的叶片和花冠中的花青素生物合成和TF基因进行了qRT-PCR检测GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba和OE -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草。结果表明，所有的花青素结构基因，包括GydF4y2Ba如果说GydF4y2Ba那GydF4y2BaNtCHIGydF4y2Ba那GydF4y2Bantf3h.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5是什么,NtDFR NtF3'H, NtF3”GydF4y2Ba那GydF4y2BaNTANS.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaNtUFGTGydF4y2Ba，在叶片和转基因植物的花冠被上调，特别是在OE＃2和OE＃3（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, e).两个内源性bHLH TF基因GydF4y2BaNtAn1aGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtAn1bGydF4y2Ba，它调节烟草中类黄酮的合成[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]，也在OE的叶子和花冠上上调 -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac, f).然而，抄本GydF4y2BaNTAN2.GydF4y2Ba在烟草的所有基因型的叶子几乎检测不到，而那些在OE-的花冠GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba和OE -GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba结果表明，与对照相比，对照植株的生长速率较低。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC，F）。GydF4y2Ba

花青素是花的主要色素。花青素生物合成由R2R3-MYB TFs或MBW复合物调控[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．在各种观赏植物中发现了涉及花色的R2R3-MYB TFS，包括GydF4y2Ba非洲菊矮牵牛GydF4y2Ba那GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba花烛属植物GydF4y2Ba[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．在葡萄葫芦术中，先前的研究表明，烟草中的花青素相关的R2R3-myb，诱导烟草中的Cyanidin生物合成的明显增量，并依赖于ATTT8或MabhlH1以激活LBG表达[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).在本研究中，我们分离到一种新的R2R3-MYB, MaMybA，它不同于MaAN2。异源表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba使烟草中的花青素发生强烈的深色色素沉着，并产生一种新的花青素Dp3R。本研究明确了MaMybA和MaAN2在花青素生物合成中的功能差异，进一步揭示了MaMybA和MaAN2在花青素生物合成中的调控机制GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花。GydF4y2Ba

MaMybA是R2R3-MYB家族AN2子群中的一个R2R3-MYB TFGydF4y2Ba

促花青素R2R3-MYB转录因子具有特定的结构和典型的基元。在GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba，我们表征了类似于MAAN2的R2R3-MYB MAMYBA，其在N末端区域的高度保守的R2R3结构域中含有三个保守的氨基酸（ARG，VAL和ALA）和典型的基序[K / R] P [Q./ r]在C末端区域中p [q / r]。这些保守的氨基酸和典型的基序也据报道，如在Dicots的AN2亚组的AN2亚组的促进R2R3-MYBS中存在[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba还有一些单像[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba值得注意的是，单子叶植物MaMybA和MaAN2在禾草科和兰科植物科R2R3-MYBs的C1亚群中未发现基序KAX[K/R]C[S/T](图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa，b）。另外，图案[d / e] lxGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba[r / k] xGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaLXGydF4y2Ba_6.GydF4y2BaLXGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba在MaMybA和MaAN2的R3重复序列中的R。GydF4y2Ba1AGydF4y2Ba）表示Mamyba和Maan2可以与BHLH TFS互动。Mamyba被鉴定为TF，因为它局部化在细胞核中，并且具有转录激活能力（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S1）。GydF4y2Ba

据我们所知，所有花青素相关的DiCot r2R3-MYB TFS已被分组为R2R3-MYB系列的AN2子组。在单焦点中，只有那些痘痘和兰科的MYBS被聚集到C1子组中[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba];其他单子叶myb被置于AN2亚群中[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．因此，为了确定双子叶和单子叶间的聚类规律，需要挖掘更多与花青素相关的r2r3 - myb。GydF4y2Ba

系统发育分析表明MaMybA的进化关系比MaAN2更接近AcMYB1。MaMybA和MaAN2在整个氨基酸序列上的同源性仅为43.5%。的相对表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在不同的组织中表明，它主要在色素花中表达(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac).它的表达与的协调，虽然稍早于的GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba，以及花发育过程中色素的积累[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

大家族R2R3-MYB的是MYB蛋白的主要家族。R2R3-MYBS都具有在N-末端，其决定调控特异性，并提供了MYB核定位信号的高度保守的结构域R2R3，而C-末端区域通常具有反式激活或DNA-抑制基序[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，根据c端重复出现的氨基酸基序，r2r3 - myb被分为22个亚群[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．具体来说，AN2亚群(即亚群6)的R2R3-MYBs，由c端区域的保守基序([K/R]P[Q/R]P[Q/R])组成，在诱导花青素生物合成中起作用[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba];亚组4的R2R3-MYBS在C-Termini功能中含有保守的耳动图案（LXLXL），在还原花青素生物合成中的作用中[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．之前的研究也表明，r2r3 - myb中含有高度保守的基序和外显子长度，具有相似的功能GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Bavitis.GydF4y2Ba，虽然所有R2R3-MYB蛋白的c端序列同源性较低。因此，尽管发生了变异，高度保守的区域仍然可以保持特定的功能，而c端区域的变异可以促进新的或合作功能的获得[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在Planta中，存在许多实例，其中两个或更多个R2R3-MYB基因在花青素生物合成中的功能，在单一植物物种（例如ATPAP1和ATPAP2）中发现GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．然而，在同一植物中发现的一些R2R3-MYB花青素调控因子通过在不同组织或器官中的花青素色素沉着发挥作用而表现出多样性;例如,GydF4y2Ba矮牵牛GydF4y2BaAN2主要负责花枝色素沉着，AN4主要调节花药花色苷的积累[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba];在GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba中，两个不同的R2R3 MYB，SlANT1和SlAN2，都可以诱导花青素合成，但仅在合成花青素后者功能在高光或低温条件[营养组织GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．在葡萄胺中，四种有关的三孔素相关的R2R3 MyBS具有不同的C-Termini的氨基酸长度。特别是，VVMYBA2具有两个C末端重复，而VVMYBA1具有一个，VVMYBA3缺少该基序。此外，MYBA1和MYBA2功能果实着色，但MYBA3损失了累积花青素的功能。这些差异可能导致新颖或合作职能[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．在本研究中，MaMybA和MaAN2的c端都只包含一个保守基序(KPQPQ)。MaMybA和MaAN2的c端结构域均未过早终止(MaMybA和MaAN2的氨基酸长度分别为237和240)，两种myb均可在烟草花青素生物合成中完成完整的功能。因此，MaAN2可能是MaMybA在进化过程中通过基因复制的类似物，其c端变异表明其在葡萄风信子中可能具有冗余、重叠或合作功能。因此，基于此，MaMybA和MaAN2之间可变c端功能的实验证据是我们未来工作的方向。GydF4y2Ba

MaMybA单独或与MabHLH1互作均能激活花青素生物合成基因启动子GydF4y2Ba

花青素的生物合成是由MYB-bHLH复合物调控的，在几乎所有的植物物种[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．在本研究中，得到的mabhlH1在C末端区域的N-末端和BHLH DNA结合结构域上含有MyB相互作用区域，以及参与黄酮类生物合成的其他IIIf BHLH蛋白[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2a)。系统发育分析表明，MabHLH1被归入IIIf bHLH TF家族的LC/JAF13/DEL分支[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S2B）。这些发现表明Mabhlh1可能在花青素生物合成中发挥作用GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba．然而,GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba在不同的组织中组成型表达，并不伴随着花卉发育的色素沉着（附加档案GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S2c中），其也已在苹果[发现GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba)、葡萄(GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba蝴蝶兰属GydF4y2Ba[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

mabhlh1在体内与mamyba或maan2相互作用;这是通过BIFC测定证实的（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).在双荧光素酶检测中，我们发现启动子活性GydF4y2Ba马赫GydF4y2Ba(EBG)在本实验中没有被所有的TFs(每一个或两个MYB-bHLH复合物)诱导，这与结果一致GydF4y2BaMRCH.GydF4y2Ba启动子对MRMYB1或MRBHLH1或MRMYB1-MRBHLH1的启动子没有响应GydF4y2BaMyrica Rubra.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]．单独的Mamyba能够规范表达GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba（LBG），而相比之下，MaAN2，这依赖于MabHLH1到控制GydF4y2BaMadfr.GydF4y2Ba表达（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。在玉米中，单独的ZMP可以激活类黄酮生物合成基因，但ZMC1需要与BHLH蛋白R / B的直接相互作用进行[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba];在GydF4y2Ba蝴蝶兰属GydF4y2Ba，Pemyb11依赖于PEBHLH1，而PemyB2和Pemyb12则独立于PEBHLH1在调节方面GydF4y2BaPedfr.GydF4y2Ba表达 [GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．ZMP，PemyB2和PemyB12的调节模式与Mamyba的调节模式一致。但是，在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba， AtPAP1与AtTT8或AtGL3相互作用调控GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba表达 [GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]．Phan2还需要BHLH Cofactor phan1或phjaf13来增强启动子活动GydF4y2Ba佩妮PhDFRGydF4y2Ba[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba];MdMYB10-MdbHLH3和MdMYB10-MdbHLH33复合物均可激活的表达GydF4y2BaMdDFRGydF4y2Ba在苹果GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．这些调节模式与MAAN2高度一致。GydF4y2Ba

OE之间的表型差异GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba和OE -GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba烟草可以归因于高浓度的花青素和新产生的DP3R在OE-GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba

模型植物中基因的异位表达迅速促进其功能鉴定，可见的花青素色素沉着可以直接证明其在花青素生物合成中的功能[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]．许多研究表明，过表达的花青素相关的R2R3-MYB基因可以通过基因促进烟草中的花青素产生GydF4y2BaAtPAP1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaAamyb2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．在本研究中，过度表达GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在烟草中诱导叶，花瓣，花药和花萼中的高水平花青素生产，所有含有桑树色素沉着料（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba子房壁和种皮几乎没有色素(图a-c)。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC，D）。但是，OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba叶、花萼、花药呈品红色，花冠呈深粉色，颜色较OE-淡GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa - c);OE-的子房壁和种皮GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba烟草表现出一种红颜色，与OE的不同之处不同GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC，D）。OE-的显微观察GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草叶片表明，花青素主要存在于栅栏薄壁组织、毛状体和下表皮，部分色素分布于上表皮和海绵状叶肉;色素沉着较OE-明显加深GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba转基因植物(附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:图S6)。在OE -GydF4y2BaAtPAP1GydF4y2Ba烟草，色素沉着细胞在毛状体和下表皮[进行了初步发现GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．因此，不同的R 2R 3-MYBS对不同组织或细胞的分粒素积累影响到各种范围，并且花青素的分布可能影响植物颜色。GydF4y2Ba

已有研究表明，烟草花冠中的初级花青素为Cy3R [GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]．在本研究中，新产生的花青素，Dp3R，在OE-的叶子和花冠发现GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba在烟草中，除Cy3R外，初级花青素(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）;这与OE不同GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba其中，叶片和花冠中的初级花青素为Cy3R(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).另外，在三个OE-中，叶片和花冠的花青素水平GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba转基因株系均大于2.0 mg gGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}鲜重(FW)，而OE-GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba植物均均低2.0mg / l fw（图。GydF4y2Ba4e，fGydF4y2Ba）.先前的研究表明，两种花青素调节基因(GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaR2R3 MYB基因GydF4y2BaMPAP1GydF4y2Ba和GydF4y2BaZea Mays.GydF4y2BaBHLH型基因GydF4y2BaB-PERU.GydF4y2Ba）过表达GydF4y2Ban .烟草GydF4y2BaL.，提高花青素含量，并在转基因烟草花枝中产生一种新型色素Dp3R，呈暗红色[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]．本研究采用水解液法从OE-的叶片和花冠中提取花青素GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba结果表明，Cy是主要的花青素，其次是Dp。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab);这与OE-的花青素水解结果相似GydF4y2BaAtPAP1GydF4y2Ba烟草(GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba先前的研究表明，葡萄风信子的红紫色花朵(GydF4y2BaM.吊兰GydF4y2Ba'plumosum'）含有两种主要的花青素（DP和Cy），有助于其颜色[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．因此，我们认为红色的cy基衍生物与蓝色的dp基衍生物以及较高的花青素浓度是导致OE-呈深紫红色的原因GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草。此外，在模式植物中过表达不同的R2R3-MYB基因时，所产生的植物表型在花青素定位、类型和含量上都不同，这可能是因为不同的R2R3-MYB转录因子调控不同的靶基因，在不同的组织中诱导出不同的花青素。GydF4y2Ba

MBW复合物的R2R3-MYB蛋白在花青素积累中起核心作用，MBW复合物可能诱导整个花青素生物合成途径[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．在本研究中，几乎所有花青素生物合成基因(GydF4y2Ba如果说GydF4y2Ba那GydF4y2BaNtCHIGydF4y2Ba那GydF4y2Bantf3h.GydF4y2Ba那GydF4y2Bantf3'h.GydF4y2Ba那GydF4y2Banntdfr.GydF4y2Ba那GydF4y2BaNTANS.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaNtUFGTGydF4y2Ba）和内源性的BHLH TF基因（GydF4y2BaNtAn1aGydF4y2Ba和GydF4y2BaNtAn1bGydF4y2Ba)在3种OE-的叶片和花冠中表达上调GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba转基因线（特别是在OE＃2和OE＃3中;图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）;这是与结果OE-的叶子一致GydF4y2BaAamyb2.GydF4y2Ba和OE -GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba烟草(GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, c).然而，抄本GydF4y2BaNTAN2.GydF4y2Ba在所有检测到的烟草的叶子中未检测到（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac)，因为NtAN2是花组织特异性花青素相关的R2R3-MYBGydF4y2Ban .烟草GydF4y2Ba[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．的表达水平GydF4y2BaNTAN2.GydF4y2Ba在转基因植物的甘蓝中低于对照（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaF）;这是类似的过表达的结果GydF4y2BaB-peruGydF4y2Ba和GydF4y2BaMPAP1GydF4y2Ba在烟草中，表明过量的花青素色素沉着可以通过反馈调节抑制内源基因的表达[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]．值得注意的是,GydF4y2BaNtF3的5是什么GydF4y2BaOE的叶片和花冠的转录物GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba与对照和OE-相比，e -含量显著升高GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, e).这些结果表明MaMybA通过上调花青素合成途径中的生物合成基因来促进花青素的积累。这些上调的花青素生物合成基因导致代谢物的增加，这些代谢物形成了后续催化反应的底物，从而使花青素的浓度得以积累。此外，高表达GydF4y2BaNtF3的5是什么GydF4y2Ba负责催化Dp3R的产物，该产物在之前的研究中也在转基因烟草的花枝中发现[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在本研究中，一种新的R2R3-MYB TF，MamyBA，其从花转录组中鉴定GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba，被发现在花青素色素沉着中起作用。通过外源基因表达，我们确定了MaMybA在烟草花青素生物合成中的作用，并确定了OE-的深红紫色花青素着色GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba烟草可归因于高浓度的花青素和新产生的DP3R。结果表明GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba这可能是修饰花卉颜色的候选基因，并有可能在高水平的花青素工程。此外，我们还确定了MaMybA和MaAN2在花青素合成方面的异同:它们都可以与bHLH蛋白相互作用，但前者是独立的，而后者依赖bHLH调节lbg。MaMybA与MaAN2在诱导烟草花青素和着色组织的含量和组成方面存在差异，这表明MaMybA在葡萄风信子中的作用有待进一步研究。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

葡萄风信子(GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba）植物在试验田在中国西北农林科技大学，杨凌区，陕西省，种植。（S1〜S5）主要是根据花瓣的色素沉着的程度被片分为五个阶段：S1所示无色素沉着;S2表明色素沉着在基部可见;S3指示开始变成蓝色颜料;S4表示为，花朵或全蓝，但没有打开;和S5表示的花朵完全打开时，根据Chen等人的方法。[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba然后，然后将和储存并储存，与营养组织（根，灯泡和叶子）一起收集并储存，直至使用直至使用。无菌烟草（GydF4y2Ban .烟草GydF4y2Ba'NC89'）幼苗用于四叶阶段的遗传转化。T.GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba代转基因烟草植物从无菌培养室到温室转移。这mature, fully expanded tobacco leaves and fully opened flower limbs were picked and stored at − 80 °C in readiness for the next test.拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba（col-0）和GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba在16小时光/ 8小时的暗循环下在光培养箱中生长植物，直至实现四到六叶阶段，以克隆GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba启动子和GydF4y2BaAtHY5GydF4y2Ba基因，双荧光素酶分析。GydF4y2Ba

定量实时PCR测定GydF4y2Ba

来自不同组织的总RNA提取GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba使用Chen等人描述的方案进行了烟草，cDNA合成和QRT-PCR测定。[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．qRT-PCR引物列于附加文件GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。GydF4y2BaMaactin.GydF4y2Ba和GydF4y2Banttuba1.GydF4y2Ba被用作GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba和烟草分别。使用三个样品进行分析，三个复制。GydF4y2Ba

基因克隆GydF4y2Ba

本地BLASTP软件用于筛选一种含有的花青素相关的R2R3-MYB和一种与过孔素相关的BHLH UNIGENE，使用来自转录组的ATPAP1和ATTT8GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花(GydF4y2Ba23GydF4y2Ba];unigenes被指定GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba和GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba,分别。然而，R2R3-MYB单基因缺乏5 ' -和3 ' -非翻译区域。因此，我们采用5 ' -RACE和3 ' -RACE方法获得了该基因的全长cDNA序列GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba从GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba花。获得全长cDNA的详细协议GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba遵循Chen等人描述的方法[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]和huang等人。[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba]．的全长cDNAGydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba被克隆GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba使用rt - pcr的花朵;用于基因克隆的引物列在附加文件中GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。获得的cDNA序列提交到NCBI GenBank数据库，登录号为MF663728 (GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba)及MF663729 (GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

序列对准和系统发育分析GydF4y2Ba

推导的氨基酸序列GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba和GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba，以及从GenBank数据库中检索到的其他与花青素相关的r2r3 - myb和bHLH蛋白，分别进行序列比对和系统发育分析。多序列比对采用DNAMAN软件8.0 (Lynnon Biosoft, CA, USA)进行分析。系统发育树首先使用CLUSTALW软件进行分析，然后使用MEGA软件6.0版本构建[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]，使用最大似然方法。引导程序设置为1000复制。不同蛋白质类型的登录号在图2中列出。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:分别为图S2。GydF4y2Ba

亚细胞定位和转录激活能力测定GydF4y2Ba

对于亚细胞定位试验，两者的ORFGydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba或GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba如果没有终止密码子，使用无缝克隆和装配套件（NoveProtein，Shanghai，China）插入PCAMBIA2300（PC2300）-GFP中，以产生PC2300-MAMYBA-GFP（MAMYBA-GFP）或PC2300-MABHLH1-GFP（MABHLH1-GFP）分别。另外，全长cDNA序列GydF4y2BaAtHY5GydF4y2Ba(AT5G11260)编码核定位标记蛋白GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba(Col-0)，插入pBI221-mCherry，生成pBI221-AtHY5-mCherry (AtHY5-mCherry)。引物在附加文件中列出GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。pC2300-GFP（35S：GFP）用作阳性对照。各种质粒共转化GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba叶片原生质体使用Yoo等人描述的协议。[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba]．转化原生质体培养16 h后，用激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP8, Wetzlar, Germany)观察。GydF4y2Ba

为了构建检测MaMybA和MabHLH1转录激活能力的酵母表达载体，将两个ORF PCR产物分别融合到pGBKT7中。引物在附加文件中列出GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。pGBKT7-53与pGADT7- t共转化为阳性对照，pGADT7为阴性对照。酵母转化和自动激活试验均按照Chen等人的描述进行[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

双分子荧光互补测定GydF4y2Ba

为了验证bHLH蛋白与R2R3-MYBs之间的相互作用GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba，进行了BiFC测定GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba确认mabhlh1与mamyba或maan2之间的相互作用（花青素相关的R2R3-MYBGydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba；KY781168）[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．的ORF序列GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba单独插入pspyne（r）173（yn）中以分别产生Yn / mabhlH1和Yn / Maan2。另外，ORF序列没有任何一个GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba或GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba将终止密码子插入pspyce（m）（Yc）中以分别产生Yc / mamyba和Yc / mabhlH1。引物在附加文件中列出GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。通过电穿孔将重组和空载体质粒转化为GV3101，以及各种转化的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba培养物被共浸入GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba叶子。在光培养箱中培养3d后，用激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP8, Wetzlar, Germany)观察并拍照。GydF4y2Ba

双荧光素酶检测GydF4y2Ba

双荧光素酶检测，全长cDNA序列GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba， 和GydF4y2Bamabhlh1.GydF4y2Ba每个都克隆到pgreenii 62-sk中。EBG的启动子GydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba（GydF4y2Ba马赫GydF4y2Ba，KY781171）和关键的LBGGydF4y2Bam . armeniacumGydF4y2Ba（GydF4y2BaMaDFR,GydF4y2BaKY781169)和GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba（GydF4y2BaAtDFRGydF4y2Ba分别插入pGreenII 0800-LUC。引物在附加文件中列出GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。所有重组质粒均电孔至GV3101。浸润，瞬时表达分析，酶活性测定的LUC和GydF4y2BaRenillaGydF4y2Ba荧光素酶(REN)是根据之前引用的协议进行的[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba]．使用四种生物重复进行双荧光素酶测定的统计分析。GydF4y2Ba

稳定的烟草改造GydF4y2Ba

以验证的功能GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba，ORF序列没有终止密码子GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba插入pCambia1304。引物列在附加文件中GydF4y2Ba8.GydF4y2BaS1:表。因此,GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba由35S启动子促进。通过电穿孔将重组质粒或空质粒导入GV3101。根据Horsch等人描述的协议进行烟叶盘转化[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．用25mg L筛选转化烟草植株GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}潮霉素抗生素，用作植物选择性标志物。下一个分析阶段使用GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba产生过表达转基因植株GydF4y2BaMamyba.GydF4y2Ba(OEGydF4y2Ba-mamyba.GydF4y2Ba叶和花的颜色发生了明显的变化。得到T的方法GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba产生过表达转基因烟草GydF4y2Ba马南GydF4y2Ba按照我们之前研究的议定书[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

HPLC分析GydF4y2Ba

从不同转基因烟草基因型的新鲜、成熟、完全展开的烟叶和完全张开的花枝中提取花青素的方法如Chen等人所述[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．此外，将300 μL等量6 M盐酸煮沸1 h，释放花青素苷元，得到花青素水解液。提取液经0.22 μm滤膜过滤后进行反相高效液相色谱分析。HPLC实验条件、仪器和方案均按照Chen等人的方法进行[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．首先参考商业标准鉴定花青素提取物（所提到的所有标准列在图1中。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba；σ,美国)。根据Cy3R标准曲线测定花青素含量。采用3个生物重复对烟草样品中的花青素含量进行了分析。GydF4y2Ba

UPLC-Triple-Tof-MS / MS条件GydF4y2Ba

对UPLC实验进行了与C18柱（1.8μm，100mm×4.6mm; Agilent Zorbax-SB，CA，USA）的Acquity™UPLC系统（Waters，MA，USA）进行了UPLC实验。柱温保持在30°C;检测波长为530nm。洗脱液由水溶液（0.1％甲酸中）和有机溶剂B（乙腈中0.1％甲酸）的流速组成，流速为0.8mL minGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}．梯度洗脱程序为:0~2 min, 5% B;25分钟，50% B;35分钟，95% B;37分钟，95% B;38min, 5% b，注射量为5 μL。GydF4y2Ba

质谱(MS)在TOF质谱仪(三重TOF™5600+系统)上进行，双喷雾™源在正负电喷雾电离模式下工作(AB SCIEX, CA, USA)。优化后的MS/MS检测器工作参数为:离子喷雾电压，−4.5 kV(负)，5.5 kV(正);离子源加热器，550°C(负)和600°C(正);帘气、离子源气1、离子源气2分别设置为35、50、50 psi;实验采用100~1000 m/z扫描。MS实验中，聚束势和碰撞能级分别设置为100 V和10 V;MS/MS数据采集采用TOF MS- product Ion-IDA (information-dependent acquisition)模式;碰撞诱导解离能级分别设为−20、−40和−60 V。此外，采用自动标定传递系统同时对MS和MS/MS实验进行标定，将质量轴误差减小到2 × 10以内GydF4y2Ba^{- 6GydF4y2Ba}．GydF4y2Ba

花青素的组织定位及扫描电镜观察GydF4y2Ba

使用细小钳子从叶片上剥离表皮。使用剃刀刀片手工制作新鲜叶组织的横截面。将样品立即转移到具有水滴的玻璃载玻片上，并在显微镜下观察（尼康Eclipse 50i，东京，日本）。GydF4y2Ba

根据QI等人描述的先前公布的协议进行扫描电子显微镜。[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba]．具体地，转基因烟草的着色叶片和甘蓝首先固定在4％戊二醛中，然后在醇系列中脱水。接下来，样品是临界点干燥和用铂涂覆涂覆。最后，在扫描电子显微镜（JEOLJSM-6360LV，日本）下观察到所有样品。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

统计分析使用SPSS 20.0软件（SPSS公司，Chicago，USA）进行。数据表示为平均值GydF4y2Ba±GydF4y2Ba标准偏差（SD）。统计学显着性的水平由GydF4y2Ba最小显著性差异GydF4y2Ba（GydF4y2Ba迷幻药GydF4y2Ba)分析:GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05。GydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。GydF4y2Ba

阿巴：GydF4y2Ba

Aureobasidin A.GydF4y2Ba

ANS：GydF4y2Ba

花青素合成酶GydF4y2Ba

bHLH:GydF4y2Ba

基本螺旋循环螺旋GydF4y2Ba

BIFC：GydF4y2Ba

双分子荧光互补GydF4y2Ba

气:GydF4y2Ba

查耳酮异构酶GydF4y2Ba

CHS：GydF4y2Ba

Chalcone合成酶GydF4y2Ba

CY：GydF4y2Ba

Cyanidin.GydF4y2Ba

Cy3R:GydF4y2Ba

Cyanidin 3- rutinosideGydF4y2Ba

DFR：GydF4y2Ba

二氢烷醇4-还原酶GydF4y2Ba

DP：GydF4y2Ba

Delphinidin.GydF4y2Ba

Dp3R:GydF4y2Ba

飞燕草色素-3-芸香糖甙GydF4y2Ba

EBG:GydF4y2Ba

早期的生物合成的基因GydF4y2Ba

F3'H：GydF4y2Ba

黄酮类化合物3'-羟化酶GydF4y2Ba

F3'5'H：GydF4y2Ba

类黄酮3 ' 5 '羟化酶GydF4y2Ba

F3h：GydF4y2Ba

黄烷酮3-羟化酶GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

HPLC：GydF4y2Ba

高效液相色谱法GydF4y2Ba

LBG：GydF4y2Ba

晚期生物合成的基因GydF4y2Ba

LUC：GydF4y2Ba

萤火虫荧光素酶GydF4y2Ba

m / z：GydF4y2Ba

质荷比GydF4y2Ba

多发性硬化症：GydF4y2Ba

质谱GydF4y2Ba

女士/小姐:GydF4y2Ba

串联质谱GydF4y2Ba

OE:GydF4y2Ba

OverexpressingGydF4y2Ba

子:GydF4y2Ba

开放阅读框GydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应GydF4y2Ba

仁：GydF4y2Ba

RenillaGydF4y2Ba荧光素酶GydF4y2Ba

rt - pcr:GydF4y2Ba

逆转录 - 聚合酶链反应GydF4y2Ba

TF：GydF4y2Ba

转录因子GydF4y2Ba

到F：GydF4y2Ba

飞行时间GydF4y2Ba

UFGT：GydF4y2Ba

尿苷二磷酸 - 糖：黄酮糖基糖基转移酶GydF4y2Ba

UPLC:GydF4y2Ba

超高效液相色谱GydF4y2Ba

沃尔：GydF4y2Ba

WD-REPEAT.GydF4y2Ba

yfp：GydF4y2Ba

黄色荧光蛋白GydF4y2Ba

我们感谢姚文孔对显微分析的支持，也感谢爱思唯尔的WebShop编辑服务对语言的编辑。GydF4y2Ba

基金资助:国家自然科学基金项目(no . 31471905);国家自然科学基金项目(no . 31170652);陕西省自然科学基础研究计划项目(no . 2017JQ3019)。资助机构在设计、收集、分析、解释数据或撰写手稿方面没有作用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 西北农林科技大学园林艺术学院，陕西杨凌712100GydF4y2Ba

   Kaili Chen，Lingjuan du，Hongli Liu＆Yali LiuGydF4y2Ba

2. 中国西北部园艺植物生物学与种质创新重点实验室，杨凌，712100，中华人民共和国陕西712100GydF4y2Ba

   Kaili Chen，Lingjuan du，Hongli Liu＆Yali LiuGydF4y2Ba

3. 西北农林科技大学干旱地区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100GydF4y2Ba

   Kaili Chen，Lingjuan du，Hongli Liu＆Yali LiuGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

yl构思了这项研究。KC和LD进行了实验。HL参与了实验的部分。KC分析了数据并写了稿件。所有作者都阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaYali Liu.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

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