真盐生植物广泛靶向代谢产物的分析碱蓬莎莎在盐渍条件下，对盐生植物的耐盐性和营养价值有了新的认识

背景

碱蓬莎莎l . (美国莎莎)是一年生真盐生植物，具有较高的耐盐性，是油料作物、中药材和蔬菜。然而，关于代谢组学的综合研究还很少美国莎莎在盐水条件下。

结果

幼苗的美国莎莎分别在0、200和500 mM NaCl中培养2 d。然后用超高效液相色谱和串联质谱检测广泛靶向的代谢物。共注释了639个代谢物。其中差异代谢物253种。盐处理增加了某些代谢产物的含量，如核苷酸及其衍生物，有机酸，氨基酸、脂类如α-亚麻酸和某些抗氧化剂如槲皮素的含量。这些物质可能与渗透耐受性、增强的抗氧化活性以及物种的医疗和营养价值有关。

结论

本研究全面分析了美国莎莎从组学的角度分析了盐度下的差异，为了解物种的耐盐性和评价物种的营养价值提供了重要的理论依据。

土壤盐渍化严重影响农业生产和粮食安全。全世界有8亿多公顷土地受到土壤盐碱化的影响，约占世界土地总面积的6%，这将导致粮食产量减少[1］．与此同时，由于城市扩张而失去的耕地越来越多，迫使农业生产转移到边缘地区[2］．盐生植物可作为食物、药物和饲料，并用于恢复盐碱化和被重金属污染的土地。

代谢物的差异与有机体的表型直接相关[3.，4］．植物中代谢物的总数约为20万[5，6］．代谢产物的种类和数量的变化可以显示生物体如何适应环境变化[7，8］．代谢组学是一种定性和定量分析生物体中所有代谢物的方法[6，9］．在非生物胁迫下，植物代谢受到干扰，植物需要调节代谢水平来维持基本代谢并达到新的稳态[10］．因此，代谢组学是研究这一过程最直接的工具[11，12］．在这一过程中，初级代谢的变化最为明显，也反映了植物对非生物胁迫反应的总体趋势。它涉及糖和糖醇、氨基酸等相容溶质的积累，以应对渗透应激[13］．而次生代谢的改变则针对不同的物种和胁迫条件，如酶蛋白的修饰和相互作用[14]，增加天冬酰胺[15]，黄酮类化合物和其他酚类物质的积累[16]，以清除ROS，并作为信号调节物质[13］．目前，代谢组学在野生水稻区域差异分析中发挥着重要作用[17]，植物对非生物胁迫的耐受性[10]，氮代谢[18的表型变异分析酿酒酵母［19］．例如，在盐胁迫下，共诱导糖酵解和蔗糖代谢以及甲基化循环的共同减少拟南芥盐胁迫下[20.］．此外，小分子有机溶质参与了植物的抗渗透胁迫玉米在高盐度条件下有显著的诱导作用，并且与根相比，这种诱导作用在嫩枝中更强[21］．在耐盐大麦芽L.，磷酸己糖、TCA循环中间体和参与细胞保护的代谢物的水平随着盐浓度的增加而增加[22］．这些研究发现了在耐盐性中起重要作用的途径和代谢物。因此，代谢组学为研究植物的盐反应提供了重要的基础。碱蓬莎莎（美国莎莎)具有较强的耐盐性，其代谢水平在盐胁迫下发生变化。具有很高的研究价值。

美国莎莎属真盐生植物，发芽时耐盐性强[23，24，25，26]、营养生长[27]和生殖阶段[28，29，30.，31］．本种被认为有潜力成为蔬菜和油籽作物[32，33]，富含蛋白质、粗纤维、类胡萝卜素和氨基酸[34］．此外，该物种具有很高的药用价值，是了解耐盐性的一个有前途的模型[34］．黄烷醇的含量美国莎莎7月份的含量要高得多(98.8 mg g⁻¹DW)均优于其他月份，且7月份提取物的体外抗氧化活性最高[34］．美国莎莎具有很强的离子稳态维持能力。例如,SsNHX1而且SsSOS1都参与了维护Na⁺体内平衡,而SsHKT1; 1参与维持K⁺而且SsCAX1参与维护Ca^{2 +}盐度作用下的稳态美国莎莎［34］．盐度升高了胆碱单加氧酶(CMO)、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和过氧化氢酶(CAT)等基因的表达水平，提高了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性美国莎莎［35］．高盐度引起代谢反应，如氨基酸、苹果酸盐、富马酸盐、胆碱和磷胆碱的减少，以及芽中甜菜碱和尿囊素的增加，以及根中葡萄糖和果糖的减少，脯氨酸、柠檬酸盐和蔗糖的增加美国莎莎［35］．一系列代谢组学研究也在美国莎莎在周围盐浓度的重金属胁迫下[36，37，38］．然而，关于代谢组学的综合研究还很少美国莎莎在控制盐度条件下，例如确定盐度如何影响物种的代谢物。基于多反应监测(MRM)的广泛靶向代谢组学，使用多离子监测(MIM)调查扫描来触发增强产物离子(EPI)获取以识别代谢物。与非靶向代谢组学相比，它是一种更灵敏、更准确的代谢物检测方法[39］．因此，广泛靶向的代谢物美国莎莎在盐胁迫下进行了研究。

数据质量评估

在分析过程中，将混合样品提取物制备的质量控制(QC)样品插入每10个测试样品中，以监测分析过程的可重复性。利用质谱总离子电流(TIC)叠加显示分析可以确定代谢物检测的准确性和重复性。TIC是将质谱中所有离子在每个时间点的强度连续相加得到的谱。多物质萃取离子色谱(XIC)可以在多反应监测模式(MRM)下测定每种萃取物质的离子通量谱。每种颜色的质谱峰代表检测到的不同代谢物。峰面积表示相应物质的相对含量。使用MultiaQuant软件(v 3.0.3)对峰进行积分和校准。

定性和定量的代谢物

基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库、MetWare数据库(MWDB)和多重反应监测(MRM)对样品中代谢物进行质谱定性和定量分析。基于广谱靶向代谢产物代谢分析技术，共检测到639种代谢物，其中氨基酸29种，氨基酸衍生物60种，苯甲酸衍生物15种，吡啶衍生物3种，醇及多元醇9种，胆碱5种，儿茶素衍生物8种，酚酰胺16种，核苷酸及其衍生物53种，花青素15种，黄酮52种，黄酮醇32种，黄酮木脂素1种，黄酮c -糖苷29种，黄酮18种，异黄酮9种，17种quites及其衍生物、32种羟基肉桂基衍生物、6种色胺衍生物、4种生物碱、19种碳水化合物、2种萜类化合物、16种维生素、17种香豆素、5种烟酸衍生物、8种吲哚衍生物、63种有机酸、63种脂类和33种其他代谢物(附加文件)1:表S1)。

主成分分析(PCA)

质量控制和处理的主成分分析表明，各处理样品的变异性较小。样品具有相似的代谢特征，检测结果稳定，重复性好。此外，处理间的分离趋势明显，说明盐处理间代谢差异显著(图。1a).这三种处理的代谢在第一个成分(PC1)中明显分离，盐处理对代谢的影响美国莎莎是明显的(图;1B c d)。

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

OPLS-DA通过正交信号校正(OSC)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)将X矩阵信息分解为Y相关和不相关[40］．通过剔除不相关的差异来过滤差异变量。与PCA相比，PLS-DA可以最大限度地区分不同处理，更有利于发现差异代谢物。R²Y和Q²在200 mM NaCl对CK、500 mM NaCl对CK、500 mM NaCl对200 mM NaCl的处理中，得分均大于0.99(图5)。2A, b和c)，表明盐处理的结果导致了代谢的差异美国莎莎是正确的。

通过200次对准实验对OPLS-DA模型进行了验证。水平线与R相对应²和问²而红点和蓝点代表R²'和Q²后分别替换。这些结果表明模型是有意义的，在后续的分析中根据VIP值分析可以筛选出差异代谢物(图。2D e和f)。

层次聚类分析(HCA)与火山图

HCA可以评估导致代谢产物积累的盐处理特征的差异，包括处理内的同质性和处理间的变异性。随着NaCl浓度的增加，代谢物表达的差异增大(图2)。3.a).火山图中的点代表代谢物，横坐标和纵坐标分别代表两个样本中代谢物定量差异的对数值和VIP值。选择折叠变化≥2、折叠变化≤0.5、VIP≥1的代谢物。在上述条件下筛选的代谢物有显著差异。大多数代谢物的表达无差异，差异表达代谢物增加的数量接近减少的数量(图。3.B c d)。

差异代谢物的统计分析

在所有639种代谢物中，有253种不同含量的代谢物(附加文件1:表S1)。它们被分为10类:氨基酸及其衍生物、酚酰胺和酚酸、核苷酸及其衍生物、类黄酮、脂类、碳水化合物、维生素、吲哚衍生物、有机酸和其他(表2)1)．与对照组相比，200 mM NaCl处理有101种差异代谢物，其中61种代谢物减少，40种代谢物增加。此外，500 mM NaCl处理有199种代谢物，其中104种代谢物减少，95种代谢物增加。此外，与200 mM NaCl处理相比，500 mM NaCl处理有107种差异代谢物，其中46种代谢物减少，61种代谢物增加(表2)1和附加文件2:表S2)。

与对照组相比，低盐和高盐处理中共有68种代谢物存在差异，其中45种代谢物减少，22种代谢物增加。而在200 mM和500 mM NaCl处理中，4-(氨基甲基)-5-(羟甲基)-2-甲基吡啶-3-醇和二氢杨梅素几乎没有检测到。减少最多的物质是橘皮素、l -抗坏血酸、3-羟基-3-甲基戊烷-1和5-二酸(LogFC <−2.5)，而增加最多的物质是2 ' -羟基genistein (LogFC > 2.8)。此外，在200 mM NaCl处理后，咪唑-4-乙酸盐含量增加，而在500 mM NaCl处理后，咪唑-4-乙酸盐含量降低(附加文件)3.:表S3)。

差异代谢物的功能注释与富集分析

这些差异显著代谢物注释的结果根据KEGG数据库中的通路类型进行分类(http://www.genome.jp/kegg/)．差异代谢物主要参与次生代谢物的代谢途径和生物合成，如类黄酮、酚类及酚酸、氨基酸及其衍生物、脂类、有机酸等小分子(图2)。4a, b和c，附加文件4:表S4)。这些代谢物含量的变化可能在细胞膜结构保护、维持细胞渗透电位、抵抗活性氧(ROS)破坏等方面发挥重要作用(图。5)．

的种子美国莎莎含油量高，且富含不饱和脂肪酸，尤其是亚油酸。因此，这可以用作高品质食用油的来源[32，33］．从幼苗和种子中提取的脂肪酸甲酯，特别是9,12 -十八烷基二烯酸甲酯和γ-亚麻酸甲酯，能抑制炎症因子的形成，具有明显的抗炎作用[34］．此外,美国莎莎可富集土壤中Cu、Zn、Pb、as等重金属，以恢复污染土地，作为了解植物耐盐性的模式具有较高的价值[34］．然而，综合代谢反应美国莎莎在盐水条件下还没有调查过。

真盐生植物通过小分子和无机离子积累有机物质来抵抗外部渗透胁迫，从而降低其水势[34，41，42，43，44］．可溶性糖和有机酸在降低渗透胁迫下植物的水势中起重要作用[45］．在本研究中，与对照组相比，盐度诱导了某些种类的可溶性糖和有机酸的增加(表1)．曹等(2004)的研究表明，在渗透胁迫下，玉米中脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)和丙氨酸(Ala)等游离氨基酸含量显著增加[46］．在本研究中，与低盐度(200 mM)相比，高盐度(500 mM)诱导氨基酸的增加(表2)1)．这意味着美国莎莎在高盐度条件下可以积累更多的氨基酸，以及可溶性糖和有机酸，这可以降低渗透势，帮助物种应对渗透胁迫。此外，这些氨基酸还可以增加蔬菜等物种的营养价值。研究表明，3-甲基crotonyl甘氨酸是一种酰基甘氨酸，已在动物中研究过，但在植物中未见报道[47］．有趣的是，3-甲基巴豆酰甘氨酸在美国莎莎在200 mM NaCl下，但在对照组和500 mM NaCl下几乎检测不到(附加文件)1:表S1)。由此可见，该物质在代谢中的生理作用和分子机制美国莎莎可以进一步调查。

脂质介导了一些重要的应对盐胁迫的机制，如参与细胞代谢和维持细胞骨架稳定的过程[48，49，50，51］．在本研究中，与对照组和200 mM NaCl相比，500 mM NaCl诱导了脂质代谢产物的显著差异表达，并且增加了更多的不饱和脂肪酸(表2)1)．单甘油酯(MAG)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)、十八四烯酸衍生物、α-亚麻酸(ALA)和辣辛酸是有益人体健康的不饱和脂肪酸，尤其是ALA [52］．ALA的主要作用可能是长链n-3 PUFAs的前体，如EPA和DHA [53］．ALA可能具有预防心脏病和心源性猝死的功能[54，55］．α-亚麻酸含量的增加在调节细胞内脂肪酸不饱和以抵抗盐胁迫中起重要作用[56］．在本研究中，500 mM NaCl提高了α-亚麻酸的含量，与代谢途径相关的产物也显著增加(附加文件2:表S2)。因此，ALA含量的增加可能在耐盐性中起作用。同时，这意味着种植美国莎莎在高盐度下应增加其作为食用蔬菜的营养价值。

多酚一般分为两类:类黄酮(如黄酮、黄酮、黄酮醇和儿茶素)和酚酸(如羟基苯甲酸、羟基肉桂酸和奎宁酸)[57，58，59］．多酚具有较高的抗氧化活性，可预防心血管疾病和癌症[60，61］．因此，它们已被应用于功能食品、化妆品和医药[62］．在本研究中，在盐处理下检测了60种黄酮类化合物和28种酚酸的不同含量(附加文件2:表S2)。5- o -对香豆素酰奎宁酸、N-乙酰色胺、2 ' -羟基染料木素、辣素、2,4-二羟基苯甲酸、N '， N″，N″' -对香豆素-肉桂酰咖啡基亚精胺、布丁、槲皮素、异鼠李素、同碘二醇、橘皮素、柚皮素、原儿茶醛和根皮素含量随盐度的增加而显著增加。其中，某些物质具有特殊的功能。例如，槲皮素是一种广泛分布于植物中的抗氧化类黄酮，是一种很有前途的防癌剂[63，64，65，66］．然而，在本研究中，更多的抗氧化剂，如类黄酮和多酚，因盐度而降低(表1)．在美国莎莎Mn-SOD活性和Fe-SOD、CuZn-SOD几种异构体活性在盐度作用下增加[67］．的过度表达Ss.sAPX(a基因的基质APX美国莎莎)提高了转基因植物的耐盐性拟南芥处于萌芽和营养生长阶段的植物[68］．美国莎莎耐盐性强，与10 mM NaCl相比，在400 mM NaCl下生长良好[69］．耐盐性:真盐植物耐盐的独特特性，如美国莎莎，是维持离子稳态，包括Na⁺在液泡内的积累[70),钠⁺和Cl⁻通过根的排异[70，71]和K⁺［72]和Ca^{2 +}［73体内平衡。清除活性氧可能是盐耐受性的后续机制，只有在离子稳态被破坏的情况下美国莎莎．此外,美国莎莎可以清除活性氧，主要依赖于酶的成分，而不是非酶的成分。酶性和非酶性成分在清除活性氧中的作用有待进一步研究。基于目前的研究结果，本研究证明了代谢稳态的重建美国莎莎盐胁迫包括:1)初级代谢产物(如氨基酸、可溶性糖、有机酸、脂类)的积累对渗透胁迫产生抗性，维持细胞的渗透势和代谢;2)次生代谢产物可能作为抗氧化剂和调节物质发挥重要作用，包括槲皮素、2,4-二羟基苯甲酸、异鼠李素、2 ' -羟基染料木素等代谢产物被盐显著抑制或诱导。这些代谢产物具有特殊的营养和药用价值，也大大增加了其应用价值美国莎莎(无花果。6)．

本研究采用基于UPLC-MS/MS检测平台的广泛靶向代谢物，分析其代谢差异美国莎莎在不同NaCl浓度下。本研究全面分析了美国莎莎从组学角度研究盐胁迫下植物的耐盐性，为了解植物的耐盐性和评价植物的营养价值提供了重要的理论依据美国莎莎．

样品

的种子美国莎莎数据来源于中国东营农业科学研究院。干燥的种子在使用前存放在低于4°C的冰箱中。

在2018年3月下旬，棕色的种子美国莎莎种植在每个塑料花盆里，花盆里有2公斤漂洗过的河沙。这些幼苗是在温室里自然光下培养的。温室内白天温度24±4℃，夜间温度18±4℃。每天用1 mM的NO浇灌幼苗_3.⁻-N营养液[70］．用KOH和H将溶液pH调至6.2±0.1₂所以₄．

幼苗预培养50天后，每盆留15株，分别用0(作为对照，图中用CK表示)、200和500 mM NaCl处理(每种NaCl浓度3盆)，1 mM NO配制_3.⁻-N营养液[70］．为了避免渗透休克，每天添加50 mM NaCl。在获得最高盐度浓度2天后，在相同位置收获成熟的新鲜叶片，并在液氮中冷冻。然后，样本被储存在干冰中，并邮寄到MetWare进行代谢物测试。对于不同浓度的NaCl，分别从每个盆栽中收获成熟的新鲜叶片进行代谢物测试。即每个NaCl处理设置3个重复。

样品提取工艺

叶片首先被冷冻干燥，然后使用研磨机(MM 400;Retsch，德国)以30赫兹持续1.5分钟。然后将0.1 g粉末放入1ml 70%甲醇水溶液中，4℃过夜，期间漩涡三次，以提高萃取效率。提取液在10000 g下离心10 min，上清液经微孔膜(孔径为0.22 μm)过滤后进行LC-MS /MS分析。

用超高效液相色谱和串联质谱分析代谢物

超高效液相色谱(UPLC) (shimo -pack UFLC SHIMADZU CBM30A，http://www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(MS/MS) (Applied Biosystems 6500 QTRAP)条件如下:色谱柱，waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm, 2.1 × 100 mm;流动相，水相为超纯水(0.04%乙酸)，有机相为乙腈(0.04%乙酸);水/乙腈梯度，95:5 V/V为0分钟，5:95 V/V为11.0分钟，5:95 V/V为12.0分钟，95:5 V/V为12.1分钟，95:5 V/V为15.0分钟;流速0.4 ml/min;柱温40℃;注量为2 μl。电喷雾电离(ESI)温度为500℃，质谱电压为5500 V，幕气(CUR)为25 psi，碰撞诱导解离(CAD)参数设置为高。在三重四极子(QQQ)中，基于优化的减压势(DP)和碰撞能(CE)对每个离子对进行扫描检测[39］．

代谢物的定性和定量测定

基于公共代谢物数据库(如MassBank或KNApSAcK)和自建数据库MetWare数据库(MWDB)，通过二次光谱信息对材料进行定性，同时在分析过程中去除同位素信号和重复信号。

使用三重四极杆质谱多重反应监测(MRM)对代谢物进行定量。排除其他分子量物质对应的离子，筛选目标物质的前体离子。同时，在碰撞池中，前体离子被电离破碎形成片段离子，并通过三重四极杆过滤筛选出特征片段离子。这使得定量结果更加准确和可重复。对得到的代谢物质谱峰进行峰面积积分，对不同样品中代谢物的质谱峰进行积分[74］．

统计分析

采用多元统计分析方法，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。主成分分析是通过正交变换将原变量重新组合成新的相互独立的变量，通过几个主成分揭示多个变量的内部结构[75］．基于OPLS-DA的结果，可以在OPLS-DA模型中进行项目变量重要性的多元分析(VIP)，初步筛选有差异的代谢物。与此同时，结合实验可以进一步筛选差异代谢物P-值或单变量分析中的折叠变化。最后，对差异代谢物进行了精确的挖掘。采用R软件对不同样品间代谢物的积累模式进行层次聚类分析(HCA)www.r-project.org/)．使用KEGG数据库注释差异代谢物[76］．

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

MRM:

多重反应监测

女士/小姐:

串联质谱法

调:

三重四极

UPLC:

超高效液相色谱法

贵宾:

项目中的可变重要性

不适用。

国家自然科学研究基金(U1803233, 31570392 to JS)和中国科学院新疆生态与地理研究所沙漠与绿洲生态国家重点实验室(G2019-02-04 to JS)资助。上述资金用于研究设计和撰写手稿时的数据收集、分析和解释。

从属关系

1. 山东省植物胁迫重点实验室，山东师范大学生命科学学院，济南市文华东路88号，250014

   李强，宋洁

贡献

QL和JS构思并设计了实验方案。QL参与了样品采集和实验，并撰写了手稿。JS修改了手稿。两位作者都已阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到杰的歌．

伦理批准并同意参与

本文的研究得到了山东省植物胁迫研究重点实验室研究组长的批准，是国家自然科学研究基金(No. 1)的课题之一。U1803233, 31570392)。所有实验均符合中国相关法律规定。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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