陆地棉果枝节间伸长相关基因的转录组分析与鉴定

背景

合理的植株结构可以提高棉铃开口量，增加种植密度，从而提高棉花机械收获水平和棉花产量。棉花果枝节间是棉花植株结构的重要组成部分。因此，研究棉花果枝节间伸长的分子机制具有重要意义。

结果

在本研究中，我们从两个节间长度差异显著的品种中选择了三个不同阶段的棉花果枝节间。转录组测序共检测到76,331个基因。通过KEGG通路分析，我们发现DEGs在植物激素信号转导通路中显著富集。转录数据和qRT-PCR结果表明GH3与生长素信号转导有关的基因家族CKX在节间较短的品种XLZ77中，可降低ck水平的酶表达量较高。乙烯合酶相关基因(ACS)，EIN2/3而且小块土地在乙烯信号转导途径中与基因有关JAR1，COI1而且MYC2JA信号转导通路中的表达也在XLZ77中高表达。植物激素测定结果表明，XLZ77的IAA和CK含量显著低于L28, ACC(乙烯前体)和JA含量显著高于L28。氧化石墨烯富集分析显示，细胞分裂、细胞周期过程、细胞壁组织等与促进细胞伸长相关的氧化石墨烯类别显著富集，相关基因在L28中高表达。而鞘脂代谢过程和木质素生物合成过程相关基因在XLZ77中高表达，这些基因的表达会影响细胞的伸长。此外，有2067个tf存在差异表达。的WRKY，小块土地而且bHLHTF家族是两个品种中成员活跃度最高的前3个家族，且编码这些TF的大部分基因在XLZ77中表达水平上调。

结论

生长素和CK是棉花分枝节间伸长的正向调节因子。乙烯和JA可能是棉花分枝节间伸长的负调节因子。此外,WRKY，小块土地而且bHLHtf被认为是棉花节间伸长的重要抑制因子。在短节间品种XLZ77中，乙烯的大量合成和生长素的氨基酸偶联导致植株细胞伸长受到抑制，而JA含量的增加和CKs的降解导致细胞分裂速度减慢，最终导致结果枝节间相对较短的表型。本研究结果不仅为棉花植株结构的遗传改良提供了基因资源，而且为进一步认识棉花分枝节间伸长的分子机制奠定了基础。

棉(陆地棉L.)在世界各地都有种植，是一种重要的纤维作物[1］．适当提高棉花种植密度是提高棉花产量的有效方法。然而，宽松的棉株结构已成为限制棉花种植密度提高的关键因素。因此，合理的植株结构和群体结构对高产棉花的培育至关重要。

植物建筑是植物形态结构、生理生态功能等的综合表现。植物结构是光接收、光合产物生产和养分分配的关键决定因素，并在作物产量、产品质量和栽培管理中发挥重要作用[2］．在高等植物中，植物建筑的形成还包括与植物形态有关的器官，贯穿于植物的整个生长发育过程，特别是枝、叶、花的形成、形状和位置[3.］．总的来说，棉花的植株结构包括几个生长组成部分，如主茎的高度，结果枝和根的数量和长度，主茎和结果枝的节间长度，棉铃在整个植株中的分布，以及棉花的生长结构和铃的形成。植物结构对皮棉产量的影响尤其重要[4］．建筑结构可以显著影响作物冠层内的光分布和穿透，从而改变植物生长、生物量分配、铃分布和产量潜力[5］．

植物激素如生长素、赤霉素(GAs)、油菜素内酯和细胞分裂素(CKs)在植物型形成过程中发挥重要作用;具体而言，这些激素在植物矮化、茎叶角决定和分叶过程中起着重要作用，而乙烯(ET)和ABA (ABA)则起着许多抑制作用[6，7］．植物高度由几个发育因素决定;其中，茎尖分生组织(SAM)和中间分生组织的细胞分裂和扩张(EXP)导致的茎伸长起决定性作用。茎伸长受几种激素控制，包括GAs、油菜素类固醇、生长素和独脚金内酯(SLs) [8］．关于控制胚层分生组织生长的分子机制知之甚少，但这一过程是由ET触发并由GA促进的[9］．以深水水稻为例，GA通过促进细胞分裂和细胞伸长来诱导节间生长[10］．Oscen1而且Oscen2的成员顶花1（TFL1）/ CENTRORADIALIS（岑)基因家族，主要在次生分生组织中表现出不同的表达模式。过度的Oscen1而且Oscen2在转基因水稻植株中，会导致较短的节间数量增加，这表明这些基因通过刺激最顶端植体中次级分生组织的活动来调节基本结构的发育[11］．棉花中GA生物合成相关基因的下调抑制了细胞伸长，降低了株高，缩短了节间长度，说明GA对棉花植株主茎节间伸长有重要作用[1］．

在茎部结构方面，SAM决定了植物的叶分生结构并影响腋生分生组织(AM)的形成。在叶片发育过程中，AM可以在腋部发育，随后产生次生芽。侧枝生长对控制梢部结构至关重要[8］．通过定位和克隆GbAF的基因(控制腋窝开花表型)海岛棉L.和GhCB的基因(控制成簇铃的表型)陆地棉L.，研究人员观察到不同的表型是由同一位点不同SNP位点的突变引起的，与自清除（SP)在番茄中;此外,沉默GoSP在海岛棉l .,陆地棉L.改变了植物的结构，使植物的生长受到限制[12］．上述研究主要集中在主茎和零型果枝节间伸长上。目前还没有研究棉花不定结果枝节间伸长的生理和转录调控机制。

本研究利用两个果枝长度差异显著但高度差异不显著的棉花品种，通过RNA测序(RNA- seq)技术，对参与节间伸长的基因及其相关代谢途径进行了鉴定和分析。通过内源激素含量及转录因子(TFs)和相关基因的分析，揭示了棉花果枝节间伸长的分子机制。这些结果为进一步鉴定棉花节间伸长相关基因提供了有价值的资源。

果枝节间长度在基因型间的差异

两个品种在植物结构上的差异非常显著(图2)。1a). L28品种果枝节间较长，植株结构松散;结果枝节间较短，植株结构紧凑。但两品种株高差异不显著。我们测量了两个品种的每个分枝的第一个节间的长度。1b);L28节间逐渐延长至第6支，此后长度基本稳定在约14 cm。另一方面，XLZ77在第四分支的节间长度稳定在3 cm左右。为了解释果枝节间长度的差异，我们从顶部选择了第一、第二和第三枝的第一个节间进行转录组测序(图2)。1c)。

RNA-Seq分析和基因注释

约1.05 × 10⁹通过RNA-Seq从18个样本中获得150 bp的配对末端原始reads。经过0.42%的适配器缺失、1.30%的低质量读过滤和0.001%的含n读过滤后，> 98.27%的序列被确认为干净的reads。获取的读取的详细信息列在附加文件中1．通过将清洁reads固定在棉花参考基因组上，我们获得了18个样本中76,331个基因的表达数据(附加文件)2)．然后使用BLAST算法进行识别拟南芥抄本确定棉花中的功能标注。

差异表达基因(DEGs)的筛选与鉴定。

为了识别两种基因型之间的deg, edgeR包(http://www.rproject.org/)。在比较中，我们发现基因fold change (FC)≥2，其错误发现率(FDR) < 0.05为显著差异表达。每对比较组间的deg数量见附加文件3.．同一品种的不同节间比较，L-1与L-2、L-1与L-3中上调和下调的deg数量几乎相同。在X-1与X-2的比较中，DEGs最少，但在X-1与X-3的比较中，X-1中上调的DEGs数量是下调的DEGs的1.8倍。但是，当不同品种的相同节间进行比较时，X-1中上调的DEGs数量是X-1和L-1中下调的DEGs数量的3.5倍。在X-2和L-2的比较中，X-1中上调的DEGs数量是下调的DEGs的3.1倍。

京都基因与基因组百科(KEGG)富集分析表明，植物激素在棉花果枝节间伸长中起重要作用

为了了解DEGs的功能，KEGG通路富集分析按照ap-由FDR调整的0.05作为截止值。分析结果见附加文件4．在X-1与L-1、X-3与L-3、L-1与L-2、L-1与L-3比较中，植物激素信号转导途径显著富集，表明植物激素信号转导途径可能在棉花结果枝节间伸长中发挥重要作用。

为了确定激素介导的转录调控对棉花果枝节间伸长的贡献，我们在拟南芥激素数据库中将DEG转录本与8个激素相关通路进行了映射;1009个与激素稳态各方面相关的基因被富集(附加文件)5)．表达差异最大的基因为生长素、ET、CK和茉莉酸(JA)相关基因。

生长素流入载体(AUX1)是高亲和度吲哚-3-乙酸(IAA)进口商。在本研究中，共有18个AUX1相关基因在两个品种中均有差异表达。这些基因中的11个在L28中高表达(图28)。2一个)。GH3是生长素信号转导的负调控因子。两个品种间共有49个deg被标注为GH3，其中20个在XLZ77中高表达(图;2b);排除了FPKM < 1的29个基因。

在ET信号转导通路中，品种间共有7个deg被注释为乙烯不敏感蛋白(EIN2)， 20个deg注释为EIN335个deg标记为乙烯响应因子(小块土地）1／2．所有的EIN2相关的和14的EIN3在XLZ77中表达量较高，而在XLZ77中表达量较少ERF1/2相关基因在XLZ77中也有高表达(图;2c).此外，ACC合酶(ACS)是ET合成途径中最重要的酶。有26个deg与ACS除未表达基因外，XLZ77中有12个基因高表达(图2)。2d).以上结果表明，在XLZ77中，ET合成和信号转导相关基因均有高表达。

Jasmonate合成酶（JAR1）冠状廷、茉莉酸SCF-COI1受体复合物不敏感突变体（COI1),MYC2都是JA信号转导通路的正调控因子。在我们的结果中，品种间共有8个deg被注释为JAR1， 10个deg注释为COI113个deg注释为MYC2．这些基因大多在XLZ77中高表达(图2)。2e)，排除了FPKM < 1的基因和新标注的基因。

GK植物激素的降解由细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKX)的酶。在本研究中，27个deg与CKX在两个品种间均显著富集，其中大部分在XLZ77中高表达(图2)。2f)。

两种基因型内源激素含量。

为比较内源激素在棉花果枝不同节间间伸长中的作用，测定了IAA、玉米素(ZT)和JA的含量。从顶部的第一、第二和第三分支的第一个节间采集的独立样本用于内源激素测量。如图所示。3.2个品种间IAA含量在倒1和倒3节间差异显著。XLZ77倒3节间JA含量显著高于L28，达到107.75 ng/g。与XLZ77相比，L28倒1节和倒3节中ZT含量分别增加0.64 ng/g和1.26 ng/g;这些差异是显著的。此外，我们测定了ET前体ACC的含量，在XLZ77的三个节间均高于L28，且在倒2节间差异显著。

植物激素信号转导相关基因的qRT-PCR验证

为了进一步验证RNA-Seq分析结果的正确性，我们选取了12个表达量相对较高的基因进行实时定量PCR (qRT-PCR)。这些基因的qRT-PCR结果与RNA-Seq数据高度一致(图2)。4)．短节间品种XLZ77除AUX1外，其余基因均高表达。在这里，我们只显示了九张图片，其他三张图片显示在附加文件中7．验证实验支持RNA-Seq分析提供的相对值的准确性。

基因本体(GO)富集分析

使用从每个比较中识别的deg进行GO类别富集分析。在这里，我们的分析只包括大多数与生物过程相关的GO术语(附加文件)8)．

相对于X-1和L-1对照组，DEGs在核小体组装、染色质组装和核小体组织的GO类别中显著富集。相对于X-2和L-2对照组，在核小体组装、磷脂代谢过程和膜脂代谢过程的GO类别中，DEGs明显富集。在X-3 vs L-3对照组中，DEGs在有丝分裂细胞周期过程、细胞周期、细胞分裂、次生代谢过程和细胞壁组织等GO类别中均显著富集。相对于L-1 vs L-2对照组，DEGs在木葡聚糖代谢过程、细胞壁组织、细胞壁组织或生物发生和细胞壁多糖代谢过程GO类别中均显著富集。相对于L-1和L-3对照组，在细胞壁组织或生物发生、木聚糖生物合成过程、木聚糖代谢过程和植物型细胞壁松动等GO类别中，DEGs也显著富集。相对于X-1和X-2对照组，DEGs在植物型细胞壁组织或生物发生、木葡聚糖代谢过程、细胞壁修饰和植物型细胞壁松动等GO类别中显著富集。此外，这些GO类相关基因大多在X-2中高表达。但相对于X-1和X-3对照组，DEGs在细胞周期、细胞周期调控、细胞分裂、细胞壁生物发生和次生代谢过程等GO类中均显著富集。

deg聚类分析和各模块GO类别富集分析

根据至少一个样本FPKM≥10的条件，我们从X-1 vs L-1、X-2 vs L-2、X-3 vs L-3等组中筛选出7330个deg进行聚类分析(图2)。5)．根据聚类热图中表达趋势的差异，将7330个deg分为10个模块，每个模块有唯一的表达趋势。对各模块中的deg进行GO类别富集分析。根据富集分析和基因注释结果，我们确定了每个模块的重要GO术语。各模块的基因数量和所选重要GO术语的信息见表1，各模块的基因表达情况见附加文件9．在这里，我们只分析了基于生物过程的大部分GO术语(附加文件)10)．

在模块1中，XLZ77的基因表达量高于L28。在脂质代谢过程GO类中，DEGs显著富集。的基因Gh_A03G0871而且Gh_D02G1254被映射到AT1G14290，可编码鞘状细胞碱羟化酶2 (SBH2)，参与鞘脂三羟基长链碱(4-羟基鞘氨酸)的生物合成。

在模块2中，XLZ77 X-2和X-3的基因表达量高于L28。DEGs在细胞蛋白复合物分解、蛋白复合物分解、细胞壁生物发生和鞘脂代谢过程等GO类别中均显著富集。的基因Gh_D09G0602在上述GO类别中均显著富集，表达量高于其他基因，其映射到AT3G16630，编码KINESIN-13A．鞘脂类代谢过程中有两个重要基因:Gh_D02G1253而且Gh_A11G3137．的基因Gh_D02G1253被映射到AT1G14290，它编码鞘氨醇羟化酶SBH2．的基因Gh_A11G3137被映射到AT5G10480，它编码蛋白质酪氨酸磷酸酶PAS2．

在模块3中，X-3的基因表达量最高。第一个富集的GO类是木质素生物合成途径，包括14个基因:Gh_D11G2151而且Gh_D12G0788被映射到AT2G22420，其编码过氧化物酶超家族蛋白(痘）;Gh_D10G2466而且XLOC_076267被映射到AT2G38080，可编码漆酶/二酚氧化酶家族蛋白质(LAC4）;Gh_A10G1518而且Gh_D10G1769与几丁质酶样蛋白2 (CTL2）;Gh_A04G1032被映射到AT4G34050，其编码s -腺苷- l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶超家族蛋白(CCOAOMT1）;Gh_A05G1579被映射到AT4G39330，其编码肉桂醇脱氢酶9 (计算机辅助设计）;而且Gh_A11G1648，Gh_D11G1805而且Gh_Sca004990G01被映射到AT4G36220，其编码阿魏酸5-羟化酶1 (F5H)．上述所有蛋白质(酶)在木质素的生物合成中都很重要。

模组4中，L-3的基因表达量最高。第一个富集的氧化石墨烯类别是苯丙烷分解代谢过程，这与模块3获得的氧化石墨烯类别结果形成对比。该模块共富集了13个基因，且这些基因均与虫胶：LAC2，LAC4，LAC5而且LAC17．结果表明:L28的木质素降解率高于XLZ77;但后者的分解和代谢程度较低。这一发现解释了节间长度的差异。

在模块5中，大部分基因在X-3中高表达。在et激活信号通路GO类中，DEGs显著富集。该模块共富集了76个基因;这些基因大多与小块土地．此外，还对该通路中的8个基因进行了定位AT3G51550，编码aFERONIA蛋白质，受体样蛋白激酶家族的一员。

模块6中，L28三个节点间的基因表达量高于XLZ77。此外，在同一品种中，这些基因的表达随着果枝节间的延长而降低。在核小体组装GO类中，deg显著富集。该模块共富集28个基因;其中19个基因被定位到AT5G65360它编码组蛋白超家族蛋白。此外，模块6中大部分GO类别与核小体组装、染色质组装、DNA复制、有丝分裂等有关。由此可以推断，这些基因主要富集在细胞分裂通路中。

模块7中，L28三个节点间的基因表达量高于XLZ77。此外，L28中这些基因的表达随着果枝节间的拉长而增加。第一个富集的GO类别是细胞壁组织，包括51个基因，其中9个基因被映射到经验值编码扩张蛋白的相关基因。在我们的样本中，是107经验值从所有deg中筛选出相关基因，L28中大部分基因的表达量高于XLZ77。此外，3个基因被定位到AT1G75500基因，编码墙很薄1（WAT1)基因。

模块10中，L28三个节间的基因表达量均高于XLZ77。这些基因大多在L-1中表达较高。在半纤维素代谢过程氧化石墨烯类中，DEGs显著富集。共有10个基因在这一类中富集;其中8个基因被定位到木葡聚糖内转葡萄糖酶/水解酶(XTH) -相关基因。三个基因映射到AT4G03210，编码XTH9．由此可以推断，高表达的XTHL28基因导致细胞扩张和伸长。

棉花结果枝节间伸长的重要基因及其预测功能见表2．这些基因可用于棉花节间长度的遗传改良。

差异表达tf的聚类分析

转录因子是调控基因表达的关键调控蛋白。两个品种间2067个tf的表达差异显著(附加文件)11)．的WRKY，小块土地而且bHLH家庭是tf的前三大家庭。如表所示3.， 224个基因WRKY家族中有256个基因bHLH家族和399个基因小块土地在这两个品种之间，家族丰富;大部分在XLZ77中上调。这些TF家族在XLZ77的高表达可能是导致结果枝节间较短的主要原因。

植物激素的调控与棉花结果枝节间伸长的关系

高等植物通过调节顶端分生组织和侧面分生组织的活动来发展其植物结构。分生组织的活动受环境信号、发育阶段和遗传因素的调控。这些因素的综合调控使植物具有发育可塑性和对环境的适应性。植物激素是控制许多调控信号的网络系统的中心。这些激素在植物结构形成中起着重要作用[26］．具体而言，植物激素生长素和CK可促进细胞的扩张和分裂，而ET和JA则通过影响细胞的扩张来抑制器官的生长[27］．

植物激素IAA在植物的整个生命周期中控制着生长和发育反应;具体而言，IAA参与细胞的扩张和分裂、组织分化、器官发育和各种生理反应[28］．生长素的含量和分布在植物形态发生中起着重要作用[29］．生长素是一种弱酸，在细胞外的低ph环境中质子化，通过输入载体的浸润或介导进入细胞。在生长素进入细胞后，细胞质pH值的增加导致生长素以离子状态留在细胞内，而生长素则根据特定的输出载体运输出细胞。的AUX1基因编码一个生长素流入载体的组成部分，并在其中发生突变AUX1选择性地削弱需要载体介导摄取的生长素的作用[30.］．根尖生长素的积累明显减少AUX1是突变的[31］．的格雷琴Hagen-3（GH3)基因家族编码一类荧光素酶[32]在体外结合IAA和氨基酸分子，可催化生长素非活性形式的形成[33];该荧光素酶是生长素信号转导的负调控因子。过度的GH3.2，GH3.5或GH3.6可导致植株矮小、幼苗下胚轴伸长受到抑制、侧根减少、根尖优势丧失和内源性生长素缺乏[34］．我们的RNA-Seq和qRT-PCR结果表明IAA信号转导相关的关键基因的表达水平，包括AUX1的表达水平显著上调GH3家族蛋白基因在XLZ77中显著上调。这些结果表明，生长素信号转导在L28中被正调控，而在XLZ77中被负调控。L28的IAA含量高于XLZ77。综上所述，生长素促进了棉花果实分枝的伸长。因此，我们预测，当IAA维持在一定水平并经历信号上调时，可能是节点间伸长的激素触发因素。

植物激素ET在植物整个生命周期的各种生理过程中发挥作用[35］．乙烯利对株高影响极显著[36]，耳高[37，38]和节间长度[39］．株高降低可能是由于施用乙烯利导致节间长度减少[40］．此外，组织ET浓度升高会抑制细胞纵向延伸，从而抑制干细胞生长[41，42］．ET通过抑制细胞纵向伸长来抑制玉米节间伸长[43］．ET信号转导被认为遵循一条“线性”途径，开始是膜结合受体，中间是多个正、负调控因子，链的末端是tf [44］．EIN2是通路的正向调节因子，在ET反应中起主要作用[45］．委员会成员EIN3家族参与了一个级联调控，并刺激其他tf的转录，如ERF1［46]，是小块土地tf系列[47］．这些tf已被证明可作为其他下游et响应基因的激活剂或阻遏剂[48］．我们的RNA-Seq和qRT-PCR结果表明，基因与EIN2，EIN3而且ERF1/2在XLZ77中显著高表达。这一发现表明，ET信号转导在XLZ77中被正调控。此外，XLZ77中ET前体ACC的含量高于L28。综上所述，这些数据表明ET可能是棉花结果枝节间伸长的负调节因子。

植物激素JA在植物生长发育中起重要作用[49］．茉莉酸甲酯(MeJA)抑制某些植物的根生长。高浓度JA (25 μmol/L)对植物生长也有抑制作用[50］．JA抑制细胞周期相关蛋白的表达，从而抑制细胞分裂[51］．JA抑制植物主根的生长拟南芥通过抑制根分生组织的细胞分裂活性[52］．我们的RNA-Seq和qRT-PCR结果显示，JA信号转导的正向调控因子包括JAR1，COI1而且MYC2，在XLZ77中均显著上调。这说明JA信号转导在XLZ77中被正调控，而在L28中被负调控。此外，XLZ77的JA含量高于L28。综上所述，JA对棉花结果枝节间伸长有抑制作用。

CKs影响植物的许多过程，其中最重要的可能是SAM中的细胞分裂和增殖，这些过程负责所有地上器官的产生[53，54］．在植物发育过程中，CK植物激素在分生组织(干细胞中心)中起着关键的调节作用，通常通过刺激细胞分裂正向调节SAM [55］．催化CK氧化分解CKX是调节CK含量动态平衡的重要机制[56］．我们的RNA-Seq和qRT-PCR结果表明CKX相关基因(CK失活基因)在XLZ77中高于L28。由于低水平的CKs, XLZ77细胞分裂过程受到抑制。L28中ZT含量高于XLZ77。综上所述，这些数据表明CK可能在棉花结果枝的节间伸长中起正向调节作用。

总之，我们提出了一个假设模型来解释植物激素在棉花果枝节间伸长中的作用(图2)。6)．在XLZ77中，上调ET和JA可以抑制细胞的伸长和分裂，导致细胞数量减少，大小增长缓慢，从而导致果枝节间长度相对较短。但生长素和CK的含量和信号转导均下调，导致细胞伸长、膨胀和分裂减慢;因此，细胞的数量和体积缓慢增加，最终抑制了棉花果枝的节间伸长。

TFs在棉花果枝节间伸长中的调控作用

tf是一种可激活或抑制生物体内多个靶基因转录的调控蛋白，tf介导的基因表达调控网络在植物生长发育中发挥着重要作用。植物的生长发育可以通过调控一系列的转录因子来调控。在本研究中，2067个tf在两种基因型之间的所有基因中显著富集。在不同的助教中，助教WRKY，小块土地而且bHLH构成了活跃在这两种基因型之间的前三个最大的家族。此外，大部分转录因子在XLZ77中均显著上调。

WRKY蛋白质是转录调控因子的一个大超家族，主要参与植物的各种生理过程。委员会成员WRKYTF家族在植物根、茎、叶的形成和发育中起着不可或缺的作用。OsWRKY78可调节茎伸长和种子发育[57］．同样的,AtWRKY71调节分支的发展拟南芥［58］．GhWRKY15不仅改变了植物对病毒和真菌感染的防御抗性，而且影响了植物的生长发育，特别是茎的伸长[59］．我们的结果显示，224WRKY相关基因在XLZ77中上调。这些发现表明WRKYTFs可能对棉花分枝的节间伸长起负调控作用。

ET的典型生物学效应是既抑制茎根的伸长和生长，又促进茎根的侧向生长。的小块土地TFs家族，仅存在于植物王国，其特征是存在高度保守的dna结合域[60]，可以正向调节ET的信号转导通路小块土地已被报道在调节节间伸长中发挥作用[61］．另一个小块土地的基因,SUB1A，在山洪暴发期间限制植物在苗期伸长[62］．大米AP2 /小块土地蛋白质OsEATB通过下调GA生物合成基因抑制节间伸长[63］．我们的数据显示399个基因与小块土地tf基因富集，其中约2/3在XLZ77中高表达。因此,小块土地TFs可能对棉花结果枝的节间伸长起负向作用。

bHLHtf在植物基因组中组成了一个大家族。这些转录因子在植物生长发育、养分吸收、生物合成、信号转导等方面发挥着重要作用。64］．ILI1而且PRE1与bHLH蛋白质IBH1（ILI1绑定bHLH)，该基因的过表达导致水稻叶片直立和水稻矮化拟南芥［65］．的宽松的（OsHLH164)基因在SAM与新分生组织形成区域的边界处表达;宽松的基因已被确定为水稻腋生分生组织形成的主要调节因子[66］．我们的研究结果显示256个基因与bHLH这些基因中约有3/4在XLZ77中高表达。这些发现表明bHLHTFs可能对棉花果枝节间伸长起负调控作用。

总之，我们可以假设WRKY，bHLH而且小块土地TFs主要抑制棉花果枝节间伸长。这些转录因子在XLZ77中的上调可能是该品种节间相对较短的主要原因。内源性激素含量的差异可能是由tf的突变引起的。未来，我们将尝试通过图谱克隆来定位这些突变位点，以进一步探索节点间伸长的机制。

在本研究中，我们选择了两个果枝节间长度有显著差异的棉花品种在三个不同时期的果枝节间。转录组测序共检测到76,331个基因。通过GO分类和KEGG途径分析、qRT-PCR验证和激素含量测定，鉴定并分析了一系列参与棉花节间伸长的DEGs的潜在作用。我们发现生长素和CK是棉花分枝节间伸长的正向调节因子。相反，ET和JA可能是棉花分枝节间伸长的负调节因子。此外,WRKY，小块土地而且bHLHTFs是棉花节间伸长的重要抑制因子。在短节间品种XLZ77中，ET的大量合成和生长素的氨基酸偶联导致植株细胞伸长受到抑制，而JA含量的增加和CKs的降解导致细胞分裂速度减慢，最终导致结果枝节间相对较短的表型。本研究结果不仅为棉花植株结构的遗传改良提供了基因资源，而且为进一步认识棉花分枝节间伸长的分子机制奠定了基础。

植物材料和取样

本研究以短节间品种新鲁中77 (XLZ77)和长节间品种卢绵研28 (L28)为研究对象。这两种基因型于2017年4月20日在中国农业科学院安阳市棉花研究所试验站种植，之后进行常规田间管理。在棉芽期(2017年7月6日)采集植株顶部的第1、2、3支第1节间。棉花取样位置示意图见附加文件12．设3个生物重复;每个生物重复的样本来自10个植物，这些植物是随机选择的，以避免田间位置的任何潜在影响。将三个生物重复混合在一起，然后分为两组;一组用于Illumina测序和qRT-PCR分析RNA分离，另一组用于内源性激素测定。样品立即在液氮中冷冻，然后在−80°C保存，直到使用。

RNA分离、文库构建及RNA- seq

根据制造商的协议，使用植物RNA试剂盒(Omega Bio-Tek, USA)提取总RNA。RNA的完整性和数量通过RNase-free琼脂糖凝胶电泳和2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)进行验证。后续实验采用合格的RNA样本进行。

根据制造商的建议，使用NEBNext1 Ultra™Directional RNA library Prep Kit for Illumina (NEB, USA)构建测序文库。简而言之，总mRNA是用寡核苷酸(dT)珠分离的。通过添加片段缓冲，将所有mRNA切割成短片段(200 nt)。使用随机六聚体引物反转录生成第一链cDNA。用DNA聚合酶I和RNase h合成第二链cDNA，纯化合成的cDNA片段，进行末端配对，添加单个“a”碱基，用Illumina适配器连接。随后用琼脂糖凝胶电泳对结扎产物进行切片，切片后进行PCR扩增。扩增片段使用Gene Denovo Co.(中国广州)的Illumina HiSeq™4000测序。

测序分析和差异表达分析

测序后，删除带有适配器序列的reads。然后从每个数据集中去除N碱基超过10%的Reads和碱基超过50%的低质量(Q≤20)Reads，以获得更可靠的结果。使用对齐软件TopHat2 (v2.1.1)将读取数据映射到陆地棉l．基因组(67］．然后统计每个基因映射的干净reads的数量，归一化为reads per kilobase per million reads (RPKM)，用于计算基因表达。比较两组时，使用edgeR分析DEGs以校正多重检验，并计算FDR以调整的阈值p价值。表达差异小于2倍、|log2FC|≥1、FDR≤0.05的基因被认为是DEGs。

GO分类采用WEGO (http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)，将GO分类结果分别表示为分子功能、生物过程和细胞成分3个独立的层次。对于每个KEGG通路，通过超几何测试将deg的数量与整个参比基因集进行比较，以确定差异调控基因富集的通路。的p使用Bonferroni校正调整GO和KEGG富集分析的-值，并选择校正后的p值≤0.05作为确定显著富集GO项的阈值。在KEGG富集分析中，FDR值≤0.05的通路被认为富集。

实时PCR验证

选择12个RNA-Seq显示不同表达模式的基因进行qRT-PCR验证。从用于测序的相同样本中提取总RNA。第一链cDNA使用Primer Script RT Reagent Kit (Takara Bio Inc.， Shiga, Japan)合成。引物序列使用primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA)设计，由生工生物技术(上海)有限公司合成。所选基因和内控基因的特异性引物(UBQ)列在附加文件中13．qRT-PCR在7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems, StepOnePlus, USA)上使用BCS®Wiz Universal SYBR Green qPCR Master Mix (Transgen Biotech，北京，中国)进行。棉花UBQ以基因为内标，基于比较周期阈值计算相对叠度差异(2^——ΔΔCt)值[68］．然后,ddH₂O被用作非模板控件。qRT-PCR方法为:将1/8稀释的cDNA提取2 μL₂10 μL SYBR Green PCR Master Mix中加入O;引物各0.4 μL, H 7.2 μL₂然后加入O，使最终体积达到20 μL。qPCR程序为:50°C 2 min;95°C 10分钟;在96孔光学反应板中分别在95°C 30 s、56°C 30 s和72°C 30 s的温度下循环40次。每次实时PCR均进行3次。

各种激素的测量

为了分析内源激素含量，分别采集XLZ77和L28的独立样品，立即在液氮中冷冻，然后在−80°C保存以进一步测定。每个样品一式三份。采用超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)系统测定内源性IAA、ZT、JA和ACC含量[69］．

统计分析

在Excel软件中，使用单因素方差分析和Tukey检验在α = 0.01的显著性水平上确定值之间的显著差异。所有的表达分析进行了3个生物重复。所有报告值均为三个重复的算术平均值，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。

阿坝:

脱落酸

AUX1：

生长素流入载体

bHLH：

基本helix-loop-helix

计算机辅助设计：

肉桂醇脱氢酶

CCOAOMT1：

s -腺苷- l-蛋氨酸依赖性甲基转移酶超家族蛋白

CK:

细胞分裂素

CKX：

细胞分裂素氧化酶/脱氢酶

COI1：

一种冠状廷、茉莉酸SCF-COI1受体复合物的不敏感突变体

CTL2：

几丁质酶样蛋白2

CTR1：

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

度:

差异表达基因

EIN2/3：

ethylene-insensitive蛋白质

小块土地：

乙烯响应因子

等:

乙烯

ETR：

乙烯受体

经验值：

扩张

F5H：

阿魏酸5-羟化酶

罗斯福:

错误发现率

遗传算法:

赤霉素

GH3：

gretchenhagen-3

走:

基因本体论

国际宇航科学院:

indole-3-acetic酸

是:

茉莉酸

JAR1：

jasmonate合成酶

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

虫胶：

漆酶/二酚氧化酶家族蛋白

LOF:

功能丧失

MAPKKK：

丝裂原活化蛋白激酶

NCBI:

国家生物技术信息中心

RNA-Seq:

RNA序列

RPKM:

每千碱基每百万次读取

山姆:

茎顶分生组织

SBH2：

鞘藻碱羟化酶2

TF:

转录因子

WAT1：

墙很薄

XTH：

木葡聚糖内转糖酶/水解酶

结汇：

ZIM结构域蛋白

ZT型:

玉米素

我们感谢Gene Denovo公司(中国广州)在测序和原始数据处理方面的帮助。国家重点研发计划项目(2018YFD0100406)资助。

国家重点研发计划项目(2018YFD0100406)资助。创始机构在研究、收集、分析和解释数据的设计以及撰写手稿方面没有任何作用。

作者指出

1. 鞠飞燕和刘少东对这项工作同样有贡献。

从属关系

1. 河北农业大学农学院/棉花生物学国家重点实验室(河北基地)，河北保定071001

   鞠飞燕，张永江

2. 中国农业科学院棉花研究所，棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455112

   鞠飞燕，刘少东，张四平，马慧娟，陈静，葛长伟，沈倩，张晓萌，赵新华，庞朝友

贡献

CP、YZ和XZ设计并监督了这项研究。FJ和SL进行了研究。FJ和CP对结果进行了分析并撰写了手稿。XZ和YZ在数据分析中提供了有益的建议。SZ, JC和QS在文章写作过程中提供了建议。HM为棉花田管理提供了帮助。CG和XZ在qRT-PCR中提供了有益的建议。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

赵新华或张永江或庞朝友的通信。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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