一个遍布欧亚大陆的多倍体物种复合体，涉及6x三叶草歧义, 2x T. occidentale和图4x T. repens对三叶草育种具有重要意义的种间杂交

背景

三叶草ambiguum以2形式出现x4x6x亚洲西部多倍体系。6x形式是最理想的农艺，具有强大的根状蔓延和耐旱性。如果这些性状能够转移到白三叶草(t被)是最重要的农艺三叶草品种。然而，迄今为止，6T.歧义是可用的。此前,2x T. occidentale来自西欧的科学家已经生产出了这两种基因的可育杂交品种x和图4T.歧义它们与白三叶草互育。这里我们问是否2x T. occidentale能与6T.歧义并作为白三叶草的遗传桥梁，将这些物种结合在一起，成为一个共同基因库的一部分。

结果

十验证F₁(6T.歧义x 2x T. occidentale)通过胚胎抢救获得杂交后代，并对其中7个进行了进一步研究。4个被测染色体数均为2n= 4x= 32, FISH证实了预期的21t . ambiguum和8t . occidentale染色体。杂交育性极低，但2n雌性配子与白色三叶草花粉一起产生种子。利用FISH对衍生植株进行了确认，并成功地回交到白三叶草中，产生了部分可育的繁殖群体。

结论

虽然t . occidentale和6T.歧义由于地理和生态适应的原因，它们被广泛分离，它们保持了足够的基因组亲和力，以产生部分可育的杂交后代。异体四倍体杂种的互育性t被显示,t . occidentale能提供6个基因之间的桥梁吗T.歧义白三叶草生产出的植物具有新的表型，结合了所有三个物种的特征。利用这些信息可以使6名学生具备潜在的有价值的抗压特性T.歧义首次用于白三叶草育种。

属三叶草大约有250种分布在欧洲、非洲、亚洲西部和美洲[1］．在属内，有一小部份(Trifoliastrum)已根据DNA序列系统发育学，划分出14个物种[2］．该剖面的物种范围从二倍体一年生到六倍体多年生，分别分布在欧洲和亚洲西部。在其他物种中，本节包括t . ambiguum(高加索三叶草),t . occidentale(西部三叶草)和t被(白车轴草)。白草(三叶草ambiguum)在亚洲西部大陆以高加索地区为中心的多倍体系列。多倍体系列近似于一个海拔梯度，在高海拔地区有二倍体种群，在低海拔地区有六倍体种群，在[3.］．该系列的这种变异表明，倍体形式的基因组具有适应性遗传差异。相比之下,t . occidentale是二倍体，严格意义上的海洋物种，局限于欧洲西部从葡萄牙到爱尔兰，英格兰西南部和威尔士的湾流海岸[4，5，6，7，8］．t被是天然分布广泛的四倍体，横跨欧洲和亚洲西部，是全球农业中最重要的10-15种三叶草品种[9］．

虽然白三叶草被广泛使用，但它是一种匍匐茎植物，在土壤表面移动，具有浅的须根系统，这使它容易受到干旱条件的影响。白三叶草也是一种低效的水使用者，这一事实加剧了这种脆弱性[10，11］．相比之下,t . ambiguum由于其根系深，通过根状茎在地下匍匐生长，耐旱，抗虫害和疾病，以及饲料质量高，作为牧草豆科植物具有相当大的农业价值[9］．这些属性补充了限制白三叶草在农场，特别是在干燥环境中的表现的几个缺点。

t被是杂交(异体四倍体)起源[12]，这是不寻常的，因为该属明显缺乏网状物种形成[2］．尽管自然物种交叉稀少，但该段仍有几对物种结对Trifoliastrum已人工杂交，主要是为三叶草育种种群增加新的遗传多样性[9］．这些十字包括中间的十字t被还有人工四倍体t . occidentale［13，14，15，16］．4的杂交T.歧义和图4x T. repens也取得了成功，但成功率非常低，使用胚胎/胚珠培养相当困难[17，18，19］．这些杂交种很难繁殖，尽管经过了几代的种群发展和田野选择[9，20.，21迄今为止，他们只培育出一个品种。在某种程度上，这可能是由于四倍体形式的植物的营养劣势t . ambiguum使用，这增加了寻找方法合并六倍体形式的可取性。

到目前为止，六倍体形式是最大的农业价值。这种形式在营养上比二倍体和四倍体形式健壮得多，叶子大，习性高，地下茎和根大[3.]并已成功应用于美国中西部的牧草生产[22］．提高白三叶草抗旱性能的一个潜在策略可能是与这种有活力的高加索三叶草杂交。然而，直接杂交需要克服地理距离、不同生态适应和多倍体物种形成的潜在障碍。尽管F₁白色三叶草和6倍的杂交t . ambiguum已通过胚胎抢救获得[23]，没有肥沃的F₁杂交迄今为止已经报道，所以理想的六倍体形式还没有纳入到更广泛的基因库三叶草育种。

另一种策略可能是利用白三叶草是两种祖先形式的杂交t . pallescens而且t . occidentale［12]并且已经成功地杂交了2x和图4T.歧义用2x T. occidentale．这表明t . occidentale可以作为白三叶草和t . ambiguum［24，25］．在目前的情况下，这不仅需要产生6T.歧义而且t . occidentale以及获得这些物种与第三种物种杂交的能力，t被．如果能够实现，这种杂交不仅对该属的物种形成有意义，而且对扩大三叶草育种的基因库也有意义。

因此，我们进行了一项研究，看看6T.歧义和2x T. occidentale可以通过胚胎抢救产生。在这里，我们提供了实验证据，6T.歧义能与2x T. occidentale这是4xF₁杂交植株与白三叶草互育。这种杂交跨越了大陆尺度距离、不同的生态适应和多倍体物种形成等潜在的隔离障碍，并为最近泛欧洲-西亚物种辐射提供了证据。此外，研究结果还揭示了该产品的商业潜力t . occidentale作为一个遗传桥梁，包括6T.歧义在基因库中有利于白三叶草良种的选育。

授粉6T.歧义用2x T.occidentale在24-48小时内，母本标准花瓣颜色由白色变为粉红色。这被解释为受精发生的证据。小花发育荚果的频率很低(10-20%)，产生可检测胚的不到1%。对数百个豆荚的解剖产生了数量可观的绿色胚胎，处于早期鱼雷阶段。其中18个在琼脂板上培养成小株，然后转移到温室的盆栽混合物中。(一批不良培养基导致在培养过程中损失未知数量)。转移3个月后，16株杂交植物在温室中生长。其中10种被验证为杂交，列于表中1和他们的血统有关。其中六种生长成熟，开花，三种被更详细地研究(表1)．

早期的观察发现，杂交植物是大型植物，在营养上更接近于t . ambiguum而不是小个子t . occidentale．它们类似于t . ambiguum在叶表面纹理和开花模式。然而，它们具有来自两个亲本种的形态特征(表2)，半匍匐或半直立，具粗壮的水平茎，仅在基部节有不定根。小叶又大又尖，头状花序类似t . ambiguum。对3个杂交种盆栽成熟植株的详细测量证实，杂交种的形态在形状和大小上更接近t . ambiguum比t . occidentale(表3.，4)．杂交种的叶柄长度约为普通杂交种的两倍t . occidentale叶片被拉长，形状类似于t . ambiguum．茎粗、叶厚、单株叶数和生长点也较接近t . ambiguum而植物传播则劣于双亲。除花序(头)外，所有植株部位的干重均低于双亲对照(表2)4)．花序数和dw均远高于亲本种。开花是终了的，如在t . ambiguum，而不是腋窝，如t . occidentale，因此开花的茎是确定的，在种子成熟后死回基生节。

在花盆中生长的成熟植物的地下测量(表3.)表明，研究的三个杂交品种的粗根直径与t . ambiguum．3个杂种均有根状茎，但根状茎数量较少，2个杂种的根状茎较粗t . ambiguum．而根和根状茎的干质量显著低于t . ambiguum(表4)．

F₁混合动力车

杂交5、33、34、51和140的体细胞染色体制备结果显示2n= 4x= 32，每个都与a的推导相一致n= 3x= 21配子从6T.歧义和一个n=x= 7配子fromt . occidentale．杂化5的单元如图所示。1A，揭示了四条附属染色体，并模糊地表明染色体大小的比例为3:1。

以35S和5S rDNA为探针的FISH结果表明，杂交33和140的染色体补体与预期一致[26]这是由两个物种的正常配子融合而成的。数据2A, b为杂交33的体细胞。在对臂有1条带有5S信号的nor染色体来自t . occidentale3条缺失5S信号的nor染色体来自t . ambiguum．有3条染色体有较大的5S信号t . ambiguum一个是很小的5S信号t . occidentale．的t . occidentale-衍生NOR被观察到总是缩合，而一个或两个的t . ambiguum-衍生的nor通常(但不总是)是浓缩的。

F .的减数分裂构型₁混合动力车

对杂交5和34的中期I期减数分裂构型进行了分析5)．两种植物的结果相似，每个细胞中都有大量的单价分子，很少有二价分子和三价分子，很少有四价分子。杂交5在后期I也被观察到，它表现出频繁的滞后，只有很少的16-16分离。

F型的育性₁混合动力车

花粉的育性₁杂交株的花粉染色率极低，为3 ~ 13%(表2)6)．由于花粉育性非常低，而且人工授粉也未能获得种子，六个杂交品种的克隆副本在室外花盆中种植，并由蜜蜂进行开放授粉。周围植物基因型多样，亲本种均有二倍体和四倍体t . ambiguum还有白色三叶草。其中5个杂种通过开放授粉产生了种子。对4个杂交种进行了结实率测定，结实率从0到14粒/ 100头不等(即每100小花约0.28粒，假设平均每头50小花)6)．杂交5号、33号和229号的种子批进行了萌发和子代研究。

杂种5的OP子代植株描述

杂交5只产生1颗正常的小OP种子和5颗非常小的种子。只有正常的种子才能长成成熟的植株，命名为5OP-1。5OP-1的幼苗冬季在温室中育成，幼苗发育异常，叶片为浅绿色的单小叶，第一叶为黄色的三小叶。随后的三小叶为淡绿色，具很窄的拉长的小叶。成熟植株的小叶很窄，有双v白色斑点。植株长出多条短茎，根在基部的节上。花头是t . ambiguum-类似，但底部是白色而不是粉红色。成熟的叶子是浅绿色的，而在没有加热的温室里，某些季节产生的叶子是黄绿色的，这表明它们对凉爽的温度很敏感。

5OP-1具有中等可育性，花粉染色率为35%，体细胞染色体补体数为2n= 48(图;1b).卫星染色体数为5条(图;1B，如果白色三叶草是男性父母，这是意料之中的。

杂交33 OP后代植株的描述

杂交33经OP处理后收获16粒种子，获得12株成熟植株。从对照杂交的花粉染色性和结实率可以看出，其中几个品种开花并表现出不同程度的育性(表2)7)．有强有力的表型证据表明，为了形成这些后代中的一些，杂交33曾被白三叶草授粉(表3)7)．例如，后代植株33OP-1、3、13、16、18、19、20均为匍匐茎和节根。植物33OP-13和−16也携带白色三叶草的紫色叶标记等位基因。子代植物33OP-17具有明显的根状茎，而一些具有水平茎和仅在基部有节根的植物不能被描述为匍匐茎，可能没有白色三叶草亲本。植物33OP-1及其后代进行了进一步研究。

33OP-1植株粗壮，匍匐茎多，叶片细长，顶端钝而非尖。叶片上有两道白色V纹，质地较6叶片薄且不硬T.歧义还有混合33。第一个春天开出的花散发着强烈的椰子油香味。花药小，可能不开裂，虽然花粉不丰富，它显示中等的可染色性(表5)．在开放授粉和自花授粉时，该植物也具有部分雌性可育性，产生1-4颗种子/花序。

流式细胞仪检测结果显示，该植株接近6x，使人联想到近4的并集x(即未还原的)杂交33和2的雌性配子x= 16个雄配子。体细胞制备证实33OP-1染色体补体为2n= 51。FISH使用35S和5S rDNA作为探针(图;2c, d)表明，杂交33除了上述全部标记染色体外，该植株在对臂上还有一条带有5S信号的nor染色体，以及一条中等5S信号的染色体，如果白三叶草是2的提供者，这与预期一致x= 16个雄性配子[26］．此外，还有第四个，t . ambiguum-衍生，染色体携带较大的5S信号。

杂交31、34和229的种子和子代

OP种子从这3个杂交种中均获得并保存。杂交229的19株OP子代植株在温室盆栽中生长。只有少数植物生长旺盛，生育力普遍较低。少数有节状根的匍匐茎和圆形的叶子，与白色三叶草作为雄性亲本一致。

对照杂交5OP-1的后代

5OP-1自花授粉产生3-4粒/头种子，与两种不同白三叶草授粉产生2-3粒/头种子。一个白色三叶草头用5OP-1授粉，结果得到14粒种子。

5OP-1与白三叶草(BRI x will -1)-902传粉后萌发3粒种子，均为显性传粉R_l杂合子形式的紫叶颜色等位基因。3个后代均表现出白色三叶草的特征，匍匐茎，节根，腋生花序，1个后代叶片呈紫色，证实了白色三叶草的亲缘关系。5OP-1与另一株白三叶草授粉后又获得了5株后代植株，其中4株为匍匐茎节根，再次表明白三叶草受精成功。白三叶草杂交得到的8株植物在相互间开放授粉时均有部分可育性，但结实率低，最好的两株平均约为10粒和14粒/头。这些种子大部分被储存起来，但只有少数(公元前₁F₂)植物被种植，并进一步回交到白色三叶草，以产生推定的BC₂种子也被储存起来了。

杂交种33的OP植株对照杂交后代

植物33OP-1、11、14、15、16和20自花授粉后产生少量种子7)．植株33OP-1、14和16与白三叶草互育，33OP-14授粉后结实率为6T.歧义．进一步研究了33OP-1的子代。

33OP-1自花授粉约2粒/头(表2)7)．20颗自我种子发芽，其中9株成熟，其余的有重大异常，不茁壮成长。所有的幸存者都表示t . ambiguum性状(拉长的小叶，半直立的茎)，但也有基部节根，at被/t . occidentale特征。6株为粗壮植株，顶生花序，花粉染色低(13-36%)。

一种白三叶草杂合子对33OP-1进行人工授粉，获得红色和弥漫红色的叶片斑纹(R_l/R_ld)产生的种子会产生经过验证的带有其中一种叶子标记的后代。大多数后代都有浅绿色或杂色的黄/绿色小叶，特别是在幼苗早期阶段，只有约三分之一的后代存活到成熟(25颗种子产生22棵幼苗，其中8棵长成成熟并开花)。成熟植株粗壮，有粗密分枝的水平茎，缺乏或只有基生节根。流式细胞仪检测结果接近5x．其中两人的染色体计数为2n= 42和41-42。这些植物中的后者，携带白色V标记和扩散红叶等位基因被用作花粉亲本在一个无标记白三叶草植物。从播种的10粒种子中获得了9个经过验证的子代(其中一株是白三叶草母株上的自生)。所有9个后代都是强壮的，匍匐茎多，类似白色三叶草的植物。除了一个没有开花的，它们都是中等肥沃的，平均花粉染色率为43%(29-69%)，没有一个显示出上一代特有的淡绿色叶区。流式细胞术估计平均为2n= 4.7，范围为4.5-5.0。这些植物是至少两种(可能是三种)与白三叶草杂交的产物。为了进一步研究，生产了高级代子代。

杂交种229的OP对照杂交后代

杂种229 (229 OP-2)的1株OP子代与白色三叶草杂交，2个花序共结9粒种子。在公开授粉后，培育出9株后代植株，其中8株产生了一些种子。这些植株在水平茎上的节生根表现出不同程度的变化，从无根到所有节都有强生根。

这项研究表明，6T.歧义可以和2交叉吗x T. occidentale产部分肥沃的x杂种间可育性为4x白三叶草(t被)．这些结果对白三叶草的物种进化和潜在的渐渗育种具有重要意义。白三叶草的出现，意味着有可能将这两个物种的农艺特征结合成新的杂交群体，可能导致6的渐渗T.歧义遗传成白三叶草。

以往的研究[24，25的研究结果表明，两者都很重要x和图4T.歧义能和2杂化吗x T. occidentale而F₁S与白三叶草互育。这表明这四个类群都来自于一个共同的祖先，是现在覆盖整个欧洲和亚洲西部部分地区的物种辐射的一部分。这种辐射涉及多倍体化，并导致在非常广阔的地理区域内极其不同的形态和生态适应。对于2x和图4T.歧义而且t . occidentale很明显，在没有强大的杂交障碍和潜在的基因流动的情况下，出现了极其不同的物种的进化。这项研究表明，6T.歧义也显示了这些性质，尽管进一步多倍体化和适应分歧。

数个F₁S给出2n= 4x= 32，确认预期数字。FISH采用5S和35S rDNA探针，对F₁S也证实了比率为3t . ambiguum一个t . occidentale亚基因组，基于亲本的特征[26］．

观察结果表明，当6T.歧义授粉的是t . occidentale．受精后，可挽救胚胎的频率很低，但绿色鱼雷胚胎也不罕见，因此解剖几百个胚珠是有益的。大多数被解剖的胚胎长成大而粗壮的植物，更像植物t . ambiguum在叶片形状和有根状茎，但他们也弱表达基部节生根，反映t . occidentale血统。总的来说，F₁植物符合3:1的比例t . ambiguum来t . occidentalesub-genomes。然而，明显的例外是植物扩散，它比亲本中的任何一个都差，以及花序发育，这是积极的越界。

尽管令人印象深刻的植物和花卉活力的F₁S，雄性育性(花粉染色)和雌性育性(结实率)均极低。6个杂交种中，5个花粉染色率低于10%。花粉染色极低(< 3%)₁2之间的杂交T.歧义和2x T.occidentale［24]同样，在一个3中，它约为9%xF₁4之间T.歧义和2x T. occidentale［25］．而6组的雌性育性(OP结实率)明显较低T.歧义x 2x T. occidentaleF₁S大于2的杂化x和图4T.歧义．一个2x杂交种每头产出近1粒(0.8)OP种子[24，而3 .x杂交种产出1-2粒OP种子/粒[25］．相比之下，在本研究中获得的种子集范围为0.0014 - 0.14粒/头(表4)．在这些亲本亚基因组数量不均匀的植物中，极低的育性与减数分裂后基因组平衡配子的预期低频率相一致。

两种F₁S为低生育率提供了一个可能的解释。杂交5和34(都产生子代)的数据显示减数分裂功能异常，平均每个细胞有超过一半的染色体，要么不配对(单价)，要么参与三价(表2)5)．正如观察到的那样，这些不平等的分离很可能导致染色体组成不平衡的减少配子的优势。然而，平均每两个细胞就有一个四价，这表明发生了一些A-O配对，可能导致基因组重组。

杂交5和33的三个OP子代(5OP-1, 33OP-1, 14)检查了染色体数量，在所有情况下，它们都是通过未减少的杂交雌性配子的功能获得的。在两种情况下(5OP-1 2n= 42,33 op -1 2n= 51)雄性配子来自白三叶草，可可靠地产生16条染色体的配子。因此，雌性配子分别有32条和35条染色体，都接近未减少的32条染色体的预期数量。尽管5OP-1的配子可能是完全平衡的2n配子，考虑到减数分裂的异常，它也可能是不平衡的，而且是巧合n= 32。非整倍体n杂交33的配子有一条额外的5S rDNA染色体t . ambiguum．这个配子可以是4x+ 3体质，但也可能存在其他染色体失衡。第三种情况(33op - 14,2 .n= ~ 56)也与一个near-2的推导相一致n杂交雌性配子。这些发现表明2n配子是由这些AAAO杂交种产生的主要(也许是唯一的)功能性配子。结实率很低(杂交33，每1000小花结实率为0.8 ~ 1.0粒)。假设每朵小花有1-3个胚珠，那么只有2个n配子受精，这将产生一个成功的频率范围2n雌性配子0.03-0.10%。因为有些2n卵子可能没有受精，这可能低估了2的频率n配子，但它仍然在已知的2个范围内n雌性配子的产生和杂交的低端[27］．因此，结果与未还原配子是AAAO杂种中主要或唯一一类可育配子是一致的。未还原配子也被观察到在2的子代中起作用T.歧义x 2x T. occidentale(AO) F₁混合动力汽车(24］．

6个F₁研究了杂种的育性，其中5个被证明是部分可育的，并产生了OP后代(表4)．培育出的三个子代家族也具有生育力，并从进一步的杂交中产生子代。在一个病例(33OP-1)中，FISH证实其父系白色三叶草。这种植物被证明与白三叶草可互育，从而建立了一个涉及6T.歧义, 2x T. occidentale和图4x T. repens．虽然最初是非整倍体，但这一谱系在后代中保留了生育力。杂交5和229的后代也与白三叶草互育，建立了三种谱系。

这些血统的含义是双重的。首先，他们确定了这三个类群，一个2x，一个4x还有一个6x形成一个由最近的、可能是二倍体的共同祖先演化而来的相互关联的群体。其次，从三叶草育种的角度来看，他们证明了这一点t . occidentale可作为一个遗传桥梁，试图通过引入6T.歧义，通常被认为是这个物种最适合农艺的形式。

物种形成包括多倍体化以及显著的表型和适应性分化。t . occidentale是匍匐茎和适应盐碱，沿海生境和6T.歧义是根状的，并适应于高海拔大陆生境。t被异体四倍体是高山间杂交的衍生物吗t . pallescens和沿海t . occidentale它的适应范围跨越了整个种群的栖息地范围。以往工作[24，252 .答案解析:x和图4x形式的t . ambiguum形成可育杂交t . occidentale，也经过胚胎抢救。这些互育性表明，物种分化可能不是由于互育性的遗传变化积累而产生的，而是在祖先种群分离和独立发展之后才发生的[24，25］．

然而，遗传障碍杂交6T.歧义与t . occidentale而且t被，虽然不完整，但似乎相当发达。与t . occidentale胚胎很少，只发育到早期的绿色鱼雷阶段，必须抢救。虽然大部分F₁杂交种很健壮，繁殖力极低。只有未还原的配子对白三叶草具有功能，三种子代植株接近6x生育率也普遍较低。根据这个小样本，似乎多倍体化过程导致了6T.歧义伴随累积的遗传变化，这些变化降低了，但并没有消除与姐妹类群的互育性。

从三叶草育种的观点来看，这一组，包括其他品种，被称为“白三叶草群”[28]，是一群三叶草在系统发育上与白三叶草最接近的种(t被)．这个复合体是通过在section中的存在来定义的Trifoliastrum［2以及与群体中至少一个其他物种交叉杂交的能力。威廉姆斯(18]根据与白三叶草杂交的容易程度进一步细分了该物种。4T.歧义落入第三基因库(需要抢救胚胎)，2x和6T.歧义置于第四系基因库中(需要过桥和胚胎抢救)。6T.歧义而且t被据报道[23］．如果这些杂交后代后来被证明是部分可育的，那么6T.歧义可以转移到第三基因库。

育种计划纳入6T.歧义到t被养殖池使用t . occidentale作为桥接物种，如图所示。3.．举个例子，杂交33是F₁(AAAO)，一个接近6x与授粉产生的子代植物t被[P^rP^rO^rO^r2n= 51)。这是由near-4推导出来的x（n= 35)雌性配子和一个正常的(n= 2x=白色三叶草配子。进一步回交到t被导致倍性逐渐降低至接近4x T. repens这些将携带染色体的增加，删除和替换从6T.歧义而且t . occidentale．四对手体在F₁杂交表明6T.歧义而且t . occidentale染色体，如先前报道的涉及2x和图4T.歧义而且t . occidentale［24，25］．在目前的情况下，是否有任何种间染色体配对，然后在任何减数分裂的繁殖过程中重组t . occidentale可能起到基因桥梁的作用，可能导致从6T.歧义成t被回交的家庭。

这一育种计划表明，显著水平的非整倍性和混合、不平衡的亚基因组将导致中间代不可预测的基因组构成。在实践中，33 OP-1的早期回交衍生物虽然是非整倍体，但具有中等育性的健壮植株。更先进的世代产生了良好的数量，并将调查从6增加，取代或渐渗的证据T.歧义变成白色三叶草。成功将意味着6 .的可取特征T.歧义在白三叶草主基因库中缺失的基因将可用于未来的育种和选择，并有可能提高白三叶草群体在边缘，特别是干燥环境中的表现。

二倍体t . occidentale和六倍体t . ambiguum保持了足够的基因组亲和性，以产生部分可育的杂交，尽管地理分布和生态适应存在很大差异。异体四倍体杂种的互育性t被显示,t . occidentale能提供6个基因之间的桥梁吗T.歧义和白三叶草产生新的表型植物结合所有三个类群的特征。利用这些信息可以使6名学生具备潜在的有价值的抗压特性T.歧义用于白三叶草育种。

植物材料

本研究中使用的所有活植物均来自新西兰帕默斯顿北部农业研究草地研究中心Margot Forde牧草种质中心长期保存的品种和种质。5个六倍体(6x）t . ambiguum由商业上可买到的单株植物自花授粉而获得的植物。Endura (PGG-Wrightson Seeds，基督城，新西兰)被用作女性父母(Endura自我指定为10、12、13、16、18)。t . occidentale种子(登录代码OCD)仅用于研究目的，最初是根据批准的《植物遗传资源材料获取协议》从西班牙北部海平面遗址收集的。五种衍生植物被用作雄性亲本:植物44-16(编号OCD 1157 Praia de Lorenzo)，植物48-17(编号OCD 1162 Faro de Cabo Villano)，植物49 - 4,49 - 11(编号OCD 1163 Camarinas)和植物59-16(编号OCD 1172 Playa de San Antolin)。物种鉴定由资深作者进行验证。

杂交和胚胎抢救

这些植物在无虫温室中开花，温度为15-28°C，光周期为16小时。杂交是用手将花粉从t . occidentale的暴露的柱头t . ambiguum采用威廉斯的方法[29］．8-10天后，从胚珠中取出早期鱼雷胚，置于CR7培养基上，无菌条件下[30.]在培养皿中。大约4周后，将幼苗转移到CR5(根生根培养基)[30.］．在进一步的8-12周后，植物被盆栽到温室的泥炭/沙子介质中。用同工酶SDH和PGI证实杂种性[31]，核ITS和叶绿体TrnL内含子区DNA测序[2]和通过荧光原位杂交(FISH) [26］．

植物繁殖，育性评估和子代发育

成熟植株通过扦插进行无性繁殖。开花植物被放置在室外，经过一个完整的季节周期，在亲本种和白三叶草的存在下，由蜜蜂进行开放授粉(OP)。

通过花粉染色来估计雄性生育能力(表1)，通过提取成熟花粉，用1%乙胭脂胺染色，在200倍放大倍率下计算至少300个完全染色颗粒的百分比来确定。通过自花或异花授粉后的结实数(每头种子的数量)来评估雌性的生育能力。

表型的描述

鉴定了3个种间杂交种，6T.歧义(“Endura”)和2x T. occidentale(OCD 1168-14)在北帕默斯顿草原研究中心的温室里进行了盆栽实验。实验的设计、操作和分析如前所述[25］．插枝于2008年7月种植，并在第二年春天(2008年10月)植物开花时进行非破坏性测量，然后在第二年夏天(2009年1月)进行破坏性测量。所做的定性比较见表2所记录的数量性状见表3.(弹簧)和桌子4(夏天)。

DNA分析，细胞学和分子细胞遗传学

总DNA制备、ITS区及cpDNA区PCR扩增及DNA测序均如前文所述[2］．流式细胞术估计倍体的方法已在[24］．用酒精盐酸胭脂红处理花蕾的pmc，对其进行常规减数分裂分析[32］．体细胞染色体制备采用火焰干燥技术[26]活跃生长的根尖被蛋白水解酶浸泡过。这些制剂用吉姆萨染色进行常规有丝分裂分析，也用于FISH。减数分裂FISH制剂是在花蕾的酶浸后制备的。用于鉴定5S rDNA和35S rDNA序列染色体位置的DNA探针和程序已在[25］．杂交和杂交后的程序描述如下[26］．

本研究的数据集可从通讯作者处获得。

2n配子:

未还原的配子

2x：

二倍体

4x：

四倍体

6x：

六倍体

答:

的完整亚基因组(8条染色体)t . ambiguum

一个₄：

的一部分亚基因组(4条染色体)t . ambiguum

公元前:

回交

DAPI:

4, 6-diamidino-2-phenylindole

F₁F₂：

第一代和第二代杂交

鱼:

荧光原位杂交

其:

内部转录间隔

也没有:

核仁组织区

O:

的完整亚基因组(8条染色体)t . occidentale

O₄：

的一部分亚基因组(4条染色体)t . occidentale

人事处:

开放授粉

O^r：

一个祖先t . occidentale亚基因组来源于t被

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

PMC:

花粉母细胞

P^r：

一个祖先t . pallescens亚基因组来源于t被

rDNA:

核糖体DNA

我们感谢Michelle Williamson的同工酶分析和Helen van den Ende的实验室和托儿所的协助。国际大学感谢巴基斯坦农业研究委员会提供的海外学习假期。

农业研究有限公司根据9957/2和9957/3号拨款提供资助，并提供研究设施。新西兰研究、科学和技术基金会根据合同C10X0711为新西兰政府提供资金。国际大学获得巴基斯坦高等教育委员会的财政援助。资助机构对研究的设计、数据的收集、分析和解释或手稿写作没有影响。

从属关系

1. 农业研究草原研究中心，Tennent Drive, Palmerston North, 4442，新西兰

   Warren M. Williams, Isabelle M. Verry, Helal A. Ansari, S. Wajid Hussain, Ihsan Ullah和Nicholas W. Ellison

2. 梅西大学科学学院，坦南特路，帕默斯顿北，4442，新西兰

   Warren M. Williams & Ihsan Ullah

贡献

所有作者都参与了这项工作的计划。NWE进行了DNA分析并支持分子细胞遗传学。IU进行了表型实验并进行了分析。SWH进行减数分裂分析，HAA进行所有分子细胞遗传学实验并解释结果。IMV构想了该项目，进行了杂交，进行了胚胎抢救，确定了生育力并产生了繁殖群体。WMW制作并分析了植物种群，并撰写了这篇论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到沃伦·m·威廉姆斯．

伦理批准并同意参与

不适用

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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