5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶基因的克隆及代谢组学特征GydF4y2BaBaphicacanthus CusiaGydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

靛蓝生物碱，如靛蓝，吲哚脲及其衍生物，已被鉴定为有效的抗病毒化合物GydF4y2BaBaphicacanthus CusiaGydF4y2Ba．证据表明，植物中的靛蓝生物碱的生物合成通过Shikimate途径发生。酶5-烯醇丙酮嘧啶 - 3-磷酸合酶（EPSPS）参与植物代谢;然而，其潜在的调节靛蓝生物碱生产的推定机制目前未知。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

从大肠杆菌中分离到1个EPSPS基因GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba．实时荧光定量PCR分析表明GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和脱落酸(ABA)处理在茎中表达量最高。亚细胞定位结果表明GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba主要表达在尚未报道的塑料和细胞溶胶中。酶测定显示出非均相表达的GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质催化5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸的生成。过度的GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在GydF4y2BaIsatis Indigotica.GydF4y2Ba毛茸茸的根源导致靛蓝生物碱积累，如靛蓝，secologanin，吲哚和insorhamnetin。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

的功能GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba这为植物代谢工程的研究提供了新的思路。我们的发现对理解GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba活性化合物的生物合成GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

Baphicacanthus Cusia（Nees）BremekGydF4y2Ba，广泛分布在福建，云南，四川和广东省在中国，是一个重要的药用植物。Indigo Naturalis（Qingdai）由叶子和茎制成，茎和茎被称为“剑青牌”，是福建省着名的区域毒品。它在临床上用于治疗白血病[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，口腔癌[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]溃疡性结肠炎[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba根被用作一种名为“南斑兰根”的名贵药物[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．到目前为止，主要化合物从GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba是吲哚生物碱[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]，萜类化合物[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]、喹啉酮生物碱[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，甾醇，黄酮类化合物[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]，木质人[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]、氨基酸、有机酸[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba植物多糖[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．吲哚生物碱是靛蓝天然的主要成分和主要活性成分GydF4y2BaB. Cusia。GydF4y2Ba

吲哚生物碱的合成GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba通常认为涉及Shikimate途径和吲哚途径[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba，这是基于微生物靛蓝合成的知识。然而，吲哚类生物碱的生物合成途径GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba仍然未知。因此，根据微生物合成途径，我们提出了体内体内吲哚生物碱的假设生物合成途径（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:图S2C)。GydF4y2Ba

5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶;EC 2.5.1.19)催化磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)烯醇丙酮酸基转移到5-羟基莽草酯-3-磷酸(S3P)(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba图S2B)，产生莽草酸和毛蕊草，进入吲哚生物碱的生物合成途径。因此，EPSPS是该生物合成途径中的第一个关键酶。最近的研究证实，草甘膦作为相对于PEP的竞争性抑制剂，并在EPSPS活性位点与邻近的S3P结合;此外，草甘膦还能维持机体的调节功能GydF4y2BaPtrEPSPSGydF4y2Ba在苯丙醇丙烷途径中GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．但是，有限的研究功能GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在代谢途径中，在过表达、纯化和动力学表征的背景下GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba本文将为解释活性化合物的生物合成途径和分子调控机理提供理论和实验基础GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

分离和表征GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba

的互补GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba含有1554个核苷酸的开放阅读框，并将其转化为518Aa的氨基酸序列，其分子量为55.33kDa。等电点（PI）是7.55，图示出了GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白略碱性，蛋白具有明显的疏水面积为−0.295，亲水面积为1(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1D）。这GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质具有稳定的结构，其不包括信号肽，并且在其二级结构中可能存在一小部分的跨膜拓扑结构（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1E，f）。主要的二级结构GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba预计蛋白质涉及42.86％的无规卷线，32.82％α螺旋，6.56％β转和17.76％的延长股。随机线圈和alpha螺旋是最丰富的结构元素，分布在大多数大多数部分GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba二级结构，而Beta转弯和延伸股线间歇地分布在蛋白质中（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1B）。它还包含两个主要结构域：EPSPS合成酶活性结构域和PLN02338保守域（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1A）。3D结构GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba采用基于序列同源性的结构模型(PDB id: 3nvc.1.A)对SWISS-MODEL和phyre2进行了预测和模拟，预测结果的一致性为57.35% (Additional fileGydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1G）显示它含有3-磷酮-1-羧乙烯基转移酶功能域。Ramachandran构造也表明了GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba具有稳定的空间结构(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1H）。通过比较，为EPSPS蛋白家族构建系统发育树GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba与其他13种植物进行系统发育分析，结果表明EPSPS在植物中存在GydF4y2BaDicliptera对GydF4y2Ba似乎在与GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。氨基酸序列的同源性比较表明GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba与几种植物共享高同源性GydF4y2BaHandroanthus impetiginosaGydF4y2Ba那GydF4y2Ba芝麻纪录GydF4y2Ba,GydF4y2BaCalystegia hederaceaGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

的表达和诱导模式GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba

分析表达式模式GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba，从根，茎和叶子中分离出总RNAGydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba进行qPCR检测。结果表明，本构表达式为GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在不同的组织中，茎中的最大表达，然后是叶片和根中最低表达（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种）。QRT-PCR结果表明GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba被MeJA、SA和ABA上调表达，且表达水平与时间和激素有关出现明显变化(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB，C，D）。对于Meja治疗，表达水平GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在4 h时迅速达到最大值，增加5.79倍后下降。SA处理后GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba达到6小时（10.65倍）的最高级别，其次是短期下降，略微增加，直到12小时，然后跌至初始水平。响应ABA治疗，表达水平GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba4 h达到峰值，为对照的7.96倍;4 ~ 8 h时，表达量先下降后回升，36 h时低于初始水平。GydF4y2Ba

亚细胞定位GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba

进一步验证的表达特征GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba，我们检查了亚细胞本地化GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在树叶中GydF4y2BaN.tabacumGydF4y2Ba，控制包含空的控件GydF4y2BapCAMBIAGydF4y2Ba1301-GFP载体（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），有趣的是，GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-GFP融合蛋白在质体和胞质中均有定位(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba模拟)。相比之下,GydF4y2BapCAMBIAGydF4y2Ba1301-GFP载体在整个细胞中显示荧光（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba情况)。GydF4y2Ba

重组的表达和鉴定GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质GydF4y2Ba

测试…的功能GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba,GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba通过原核表达纯化重组蛋白质和GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在体外测定酶活性。分子量GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba和His-tag分别为~ 55 kDa和~ 15 kDa，融合蛋白GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-如预期的，他的产量约为70 kDa。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。数字GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa显示融合蛋白GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-HIS诱导IPTG（1毫米），纯化GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-HIS蛋白在泳道4中显示出单个不同的带4.使用Bradford方法测定蛋白质浓度。标准曲线方程为Y = 0.8726x + 0.0623，RGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 0.9981，纯化的重组蛋白浓度GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-HIS蛋白质计算为7.96mg / ml。Western Blotting的结果表明纯化的重组GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-他的蛋白质表现出抗his抗体免疫反应性(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

纯化的动力学性质GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba

纯化GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在各种条件下进行酶活性测定。如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，进行Pi标准曲线(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。然后，我们测量了速度GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在1.0mm的S3P常数下催化反应和PEP的常数增加，其中GydF4y2Ba公里GydF4y2Ba_{（PEP）GydF4y2Ba}为21.267 μM, Vmax为10.259 U/mg。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。去测试GydF4y2BaKiGydF4y2Ba_{(草甘膦)GydF4y2Ba}， S3P常数为1.0 mM，草甘膦浓度为递增常数。这表明,GydF4y2BaKiGydF4y2Ba_{(草甘膦)GydF4y2Ba}为0.046μm（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba对IC c)。GydF4y2Ba_50.GydF4y2Ba测定不同浓度PEP(0.05、0.067、0.1、0.2 mM)下的流速，草甘膦浓度设为10GydF4y2Ba^{- 5GydF4y2Ba}10.GydF4y2Ba^{- 4.GydF4y2Ba}10.GydF4y2Ba^{- 3.GydF4y2Ba}10.GydF4y2Ba^{- 2GydF4y2Ba}10.GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}， 1和10毫米。数字GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad显示了ICGydF4y2Ba_50.GydF4y2Ba是6.37μm，这表明了GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质是I型，对草甘膦敏感。而且，动力学性质GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质的含量见表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

通过过表达改善靛蓝生物碱含量GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba

BcEPSPSGydF4y2Ba在过表达载体PHB-flag中引入双CaMV 35S启动子GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba生成GydF4y2BaOVX-BcEPSPSGydF4y2Ba毛茸茸的根文化GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2BaC58C1。矢量phb-flag和GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2BaC58C1单独转移到GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba产生对照培养物和野生型培养物。GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba致毛根诱导和培养不同的时期（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab). PCR分析表明，外源GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba基因被整合到转基因株系中，其中含有GydF4y2Barolb.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba罗克GydF4y2Ba和潮霉素抵抗（GydF4y2BahyGydF4y2Ba）基因（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac).毛状根线的生长速率如图所示。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba天。这GydF4y2BaOVX-BcEPSPSGydF4y2Ba毛状根系的生长速度比Con和CK强。GydF4y2Ba

采用QRT-PCR检测内源性基因的转录水平GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在积极的行。与对照的WT表达水平相比，GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在GydF4y2BaOVX-BcEPSPSGydF4y2Ba单株显著增强37.87倍(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一种）。代谢物分析表明，与WT线和CK线和CK线相比，在转基因素中的不同程度上改善了靛蓝，Secologanin，Indole，Isorhamnetin，indolis，insorhamnetin，胆酸，术，insorhamnetin，胆酸，粒子苷和吲哚啉酮的含量。具有14个化合物的相应保留时间的色谱图在附加文件中示出GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S3，信号的检测和分离程度明显直观。靛蓝和皂甙在GydF4y2BaOVX-BcEPSPSGydF4y2Ba株系均显著高于对照(5.83 ~ 5.09倍)。此外，吲哚、异鼠李黄素、strictosidine和吲哚β - d -葡萄糖苷的含量分别高出4.82-、3.61-、2.79-和2.78倍GydF4y2BaOVX-BcEPSPSGydF4y2Ba线比WT和CK线（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab）。WT和CK线之间没有显着差异（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

目前已知EPSP合成酶在微生物和植物中的莽草酸途径中具有催化莽草酸-3-磷酸生成5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸的单一功能[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．在植物中，莽草酸途径是吲哚途径的上游，为吲哚生物碱化合物的生物合成提供chorismic酸[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．本研究证实EPSP合酶在吲哚类生物碱和萜类生物碱的积累中起重要调控作用GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

在该研究中，分离出5-烯丙基吡喃吡咯三胞胎3-磷酸合酶基因并从数据的数据中鉴定GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba通过生物信息软件预测CDNA序列的特征。组织特异性表达结果表明GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba基因在茎组织的最高水平上表达，与最近的研究一致，其中表达水平GydF4y2BaBCSK.GydF4y2Ba基因GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba在MeJA处理下，随着时间的增加而增加[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．qPCR结果表明GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2BaMeja，SA和ABA等级上调，诱导时间和表达水平的变化。我们的亚细胞本地化结果表明了GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质没有积聚在塑体中，但确实在细胞溶胶中积聚，发现先前未报道的发现。此外，最近关于PTRepsp-TF蛋白的研究GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba，显示其在细胞核中的表达[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．虽然观察到的细胞质存在的直接机制仍有待确定，一种解释是GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质可能与转录因子相互作用。我们的酶活性测定结果表明，异位表达和纯化GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质在体外具有催化活性。此外，GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba对草甘膦敏感，这表明了GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质是一类蛋白质。由于已鉴定出多个I类EPSPS抗草甘膦突变体，且大多数I类EPSPS突变体表现出较高的草甘膦抗性[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]，它是有用的创造一个草甘膦抗性突变体GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba使用定向演变策略的EPSP [GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

生物碱是含有氮的渗透合物化合物，是具有重要生物活性的中草药的重要，有效的组分[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．吲哚生物碱是一类生物碱，由吲哚的一个结构部分识别出来[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］．吲哚生物碱的含量GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba高于其他植物中的那些GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba那GydF4y2Ba蓼属植物tinctoriumGydF4y2Ba和GydF4y2BaIndigofera tinctoriaGydF4y2Ba，吲哚酚- d -糖苷、靛蓝、靛玉红含量在不同器官间存在明显差异[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．基因过表达载体为毛状根而建造，并被转移GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2BaC58C1。代谢物分析表明，与对照相比，改善了靛蓝，Secologanin，Isorhamnetin和术中的活性化合物如靛蓝，Secologanin，Isorhamnetin和术中的水平。最后，分子催化特征GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在吲哚生物碱生物合成中GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba这里报道将为Shikimate途径的功能研究提供独特的视角。GydF4y2Ba

功能基因组学技术和遗传转化技术的发展极大地促进了生物碱生物合成的研究[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．另外，下一代测序为药用植物提供了一种快速，高通量的方法，其中当前遗传信息受到限制，并且用于获得批量序列。这些数据将提供对分子研究的新视角GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba其主要活性物质为吲哚生物碱，有利于植物种质资源的保护GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba通过排序和揭示功能基因。GydF4y2Ba

酶5-烯醇戊嘧啶微嘧啶-3-磷酸合酶参与催化吲哚生物碱生物合成。GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba首先从GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba转录组的功能和特点GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在体外得到进一步验证。在毛状根培养中产生了高浓度的吲哚生物碱GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba过度表达。有人建议，通过监管GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba，可以提高有效部件的累积。GydF4y2Ba

总之，在本研究中建立了一种具有高浓度吲哚积累的毛状根过度表达培养系统，预计将减轻高质量资源的过度开发和短缺GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba在将来。GydF4y2Ba

植物材料和治疗GydF4y2Ba

样本GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba是从莆田市仙友县的实验领域获得的。物种核查是由福建省农业和林业大学（FAFU）生命科学学院的Daozhi Wei教授进行。将这些样品保存在FAFU（No.004512-ML）的药用植物资源实验室中。GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba中国上海上海第二军医大学（SMMU）的实验领域培养了植物。物种核查由SMMU学校的雷张教授进行。这些样品在SMMU的药用植物资源实验室中保存（No.S1011078）。灭菌的幼苗GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba在以0.6%琼脂凝固的Murashige和Skoog (MS)培养基上培养。使用器官特异性系列样本(根、茎和叶，6个月大)进行RNA提取。叶子的GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba用0.1mM茉莉甲酸甲（MEJA），水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）喷雾，用于应力处理[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]，分别于处理后0、2、4、6、8、12、24和36 h采收叶片。每组进行3个独立的生物学重复。MeJA、SA、ABA购自Sigma-Aldrich (USA)。所有样品立即在液态氮中冷冻GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba并保存在−80°C，以供进一步研究。GydF4y2Ba

总RNA的分离和cDNA第一链的合成GydF4y2Ba

总RNAGydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba植物提取使用TransZol Up Plus RNA Kit (TransGen Biotech)。用1微克的RNA，用TransGen Biotech公司的TransScript first - strand cDNA Synthesis Super Mix制备第一链cDNA。RNA和第一链cDNA样品的浓度和质量通过NanoDrop 2000C分光光度计(Thermo)分析和琼脂糖凝胶电泳与溴化乙酯。GydF4y2Ba

分离和表征GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba

这GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba从转录组数据库中分离基因序列GydF4y2Bab . cusiaGydF4y2Ba，具有基因特异性引物EPSPS-F和EPSPS-R（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba： 桌子。S1）。全长编码区GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba用KD + DNA聚合酶(TransGen Biotech)进行PCR克隆(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:图S4)。PCR的条件为:94℃变性5 min, 94℃变性30 s, 55℃变性30 s, 68℃变性2 min, 35个循环，最后68℃延伸10 min。凝胶电泳检测后，PCR产物纯化，克隆到pBlunt-Zero载体(TransGen Biotech)中，转化到Trans1-T1细胞(TransGen Biotech)中进行测序。GydF4y2Ba

生物信息学分析GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba

的开放式阅读框架GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba已在NCBI ORF Finder (GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nibi.gov/gorf/gorf.htmLGydF4y2Ba)．的组成和理化性质GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba用Protparam (GydF4y2Bahttp://www.expasy.ch/tools/protparam.html.GydF4y2Ba)．疏水性/亲水性GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba用ProtScale预测氨基酸序列（GydF4y2Bahttp://www.expasy.ch/tools/protscale.htmLGydF4y2Ba)．信号肽和前导肽GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白在信号3.0 (GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/signal/GydF4y2Ba）和目标1.1（GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/GydF4y2Ba） 分别。预测跨膜结构域和卷绕线圈的预测GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba用tmpred完成蛋白质（GydF4y2Bahttp://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htmLGydF4y2Ba）和线圈（GydF4y2Bahttp://www.ch.embnet.org/software/coils_form.html.GydF4y2Ba） 分别。二级结构和功能域GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白检测SOPMA (GydF4y2Bahttp://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl/page=/npsa/npsa_sopma.html.GydF4y2Ba), Pfam24.0 (GydF4y2Bahttp://www.Pfam.sanger.ac.uk/searchGydF4y2Ba）和爆炸（GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nibi.gov/structure/cdd/wlpsb.cgi.GydF4y2Ba)．三维结构和Ramachandran构象模型在Swiss-Model上完成(http://GydF4y2Bawww.expasy.ch swissmod / SWISS-MODEL.htmLGydF4y2Ba)和PyMOL。利用MEGA5.0软件进行同源性比较和系统发育树分析。GydF4y2Ba

定量实时PCR（QPCR）GydF4y2Ba

进行QPCR分析以确定表达特征GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba并在热循环仪骰子实时PCR机（Takara，Japan）上进行，根据制造商的说明，使用转型顶部绿色QPCR SuperMix套件（Transgen Biotech）。这First strand cDNA was generated by the TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech), by adding Oligo (dT) primer, gRemover, E-mix, and R-mix to 1 μg of total RNA and the manufacturer’s protocol was followed. qPCR was performed by using the 2-^{ΔδGydF4y2Ba}Ct方法在以下条件下进行:94°C变性30 s，然后94°C变性5 s, 60°C变性30 s, 45个循环，最后分离阶段。表达水平与18S管家基因归一化[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．QPCR的引物列于附加文件中GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。GydF4y2Ba

细胞中的亚细胞定位GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba树叶GydF4y2Ba

以确定其亚细胞定位GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba的编码区域GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba被克隆到了GydF4y2BaPCAMBIA1301-GFP.GydF4y2Ba向量(附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:图S5)。附加文件中列出了构造vector的引物GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。vectors.GydF4y2BaBcEPSPS-GFPGydF4y2Ba和GFP瞬时表达于GydF4y2BaN.tabacumGydF4y2Ba(20天)观察亚细胞定位。在黑暗中培养植株24小时，使用共聚焦激光扫描显微镜(日本尼康)观察叶片切片[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

纯化及活性测定GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba蛋白质GydF4y2Ba

编码区域GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba克隆到pET-32a (Novagen)(附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:图S6)，表示为GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba应变BL21。用于构建载体和测序的引物列在附加文件中GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。细胞在含75 μg/L氨苄青霉素的200 mL Luria-Bertani培养液中37℃培养过夜，OD600为0.6，然后用1 mM异丙基硫代b-半乳糖在16℃下诱导细胞24 h。超声裂解和离心后，用镍螯合亲和层析(Bio-Rad Laboratories, USA)在4°C下纯化含有粗提取酶的提取缓冲液上清。用Bradford protein Assay Kit (Sangon)测定蛋白浓度。将含有纯化酶的提取缓冲液加到甘油中至10% (w/v)，置于−80℃保存。Western blotting检测His标记EPSPS与抗兔单抗His抗体(Cell Signaling Technology)和二抗(anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody)的诱导表达。GydF4y2Ba

酶活性分析GydF4y2Ba

BcEPSPSGydF4y2Ba用孔雀石绿染料测定法测定各反应中无机磷酸盐的释放量[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．在100μl50mMHEPES/ NaOH（pH7.0），1mM，1mM S3P和0.75μg纯化的酶中，在100μl50mMHepes / NaOH（pH 7.0）中测定反应。在30℃温育3分钟后，加入800μL孔雀石绿/铵钼酸铵比色溶液。一分钟后，通过加入800μL（34％）柠檬酸钠溶液终止颜色反应。在室温下孵育0.5小时后测量660nm的吸光度[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在含有不同浓度PEP或草甘膦的反应缓冲液中进行动力学表征。利用SigmaPlot程序(SPSS Science, Chicago, 1 L)将动力学数据拟合到适当的方程中。这GydF4y2Ba公里GydF4y2Ba将数据拟合为V = Vmax [S]/(GydF4y2Ba公里GydF4y2Ba + [S]), where V is the velocity of the reaction (U/mg), Vmax is the maximum velocity,公里GydF4y2Ba为米氏常数，[S]为底物浓度。这GydF4y2BaKiGydF4y2Ba通过先前描述的方法确定值[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．S3P浓度固定在1 mM，草甘膦浓度固定在0、0.05、0.1和0.2 μM。的集成电路GydF4y2Ba_50.GydF4y2Ba通过将数据拟合到酶活性来确定酶活性GydF4y2BaV.GydF4y2Ba=GydF4y2Bavmin.GydF4y2Ba+ (GydF4y2Bavmax.GydF4y2Ba-GydF4y2Bavmin.GydF4y2Ba) /(1 +([我]/ ICGydF4y2Ba_50.GydF4y2Ba）S），其中[i]是草甘膦的浓度，S是IC曲线的斜率GydF4y2Ba_50.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaV.GydF4y2Ba在1 mM PEP和S3P下测定，草甘膦浓度从0.00001 mM到10 mM不等。GydF4y2Ba

生成和分析GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba毛茸茸的根部过度表达GydF4y2Ba

编码区域GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba被克隆到二元载体phb-flag中，用作具有两个CAMV 35S启动子的过表达载体[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa）（附加文件GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba:图S7)。附加文件中列出了构造vector的引物GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。诱发GydF4y2Ba即indigoticaGydF4y2Ba多毛的根,GydF4y2Ba农杆菌肿瘤术GydF4y2Ba菌株C58C1(含aGydF4y2BaTI.GydF4y2Ba质粒含有质粒GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-PHB和PHB(对照检查，CK)侵染无菌叶片[GydF4y2Ba40.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．将染病叶片置于添加500 mg·mL的1/ 2ms固体培养基上GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}头孢噻肟。2周后，转基因毛状根衍生自约2-3厘米长的无菌叶。然后在补充500mg·ml的1/2 ms固体培养基上切除并培养毛状根部GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}头孢噻肟和10毫克·mlGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}潮霉素。每2周更换1/ 2ms固体培养基，加入浓度逐渐降低的头孢噻肟(300、200、100 0 mg·mL)GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba})．GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-phb线被标记为GydF4y2BaOVX-EPSPS.GydF4y2Ba并且空白的C58C1线标记为野生型（WT）。在含有200ml新鲜液体1/2 ms培养基的250ml Erlenmeyer烧瓶中培养大约100mg转基因毛状根和WT线，其补充有10mg mlGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}在黑暗中，将湿霉素放在轨道振动筛上，保持转速110转，温度25℃。GydF4y2Ba

每9天传代一次，45天采收毛状根进行DNA和RNA提取及代谢产物分析。记录0、9、18、27和45 d毛状根的鲜重，测定生物量生长率。GydF4y2Ba

分析GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba-PHB表示毛状根GydF4y2Ba

利用植物基因组DNA试剂盒(TransGen Biotech)提取转基因阳性毛状根基因组DNA，检测引物列于附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。底漆GydF4y2BaRBCSR.GydF4y2Ba用于检测GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba,而引物GydF4y2Ba成GydF4y2Ba那GydF4y2Barolb.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba罗克GydF4y2Ba用于检测湿霉素耐药性和质粒GydF4y2Bari.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

进行QRT-PCR以分析表达GydF4y2BaBcEPSPSGydF4y2Ba在阳性转基因长发根中。表达水平归一化GydF4y2Ba施GydF4y2Ba家政基因[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

靛蓝生物碱的提取和测定GydF4y2Ba

收集转基因阳性毛状根，40℃干燥2天，研磨成细粉。用5 mL甲醇和三氯甲烷(1:1)超声提取1 h干功率200毫克，转移上清液，用5 mL试剂再次提取粉末。上清经0.22 μm有机膜过滤。提取液蒸发干燥5毫升，用200 μl甲醇重新溶解。GydF4y2Ba

HPLC分析在Agilent Technologies 1260 infinity (Agilent, USA)上进行[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．流动相为0.1%甲酸溶液(A相)和0.1%甲酸甲醇溶液(B相)(HPLC级)。溶剂梯度程序为:0 ~ 15 min, 40% A, 60% B;15-20分钟，60% A, 40% B;HPLC监测模式为Diamonsil C-18 (4.6 μm × 250 mm, 5 μm)，流速为1.0 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 μL。所有标准均购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

实验进行了3个重复，所有结果均表示为平均值±SEM。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。一个学生的t检验被用来比较两组。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Dunnett事后检验对对照组进行多重比较(GraphPad软件)。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05和GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.01为差异有统计学意义的标准。GydF4y2Ba

在当前研究中使用和/或分析的数据集包括在本文及其附加文件中。GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱盐酸GydF4y2Ba

作为：GydF4y2Ba

邻氨基苯甲酸盐合成酶GydF4y2Ba

CS:GydF4y2Ba

经酸性合成酶GydF4y2Ba

CYP450：GydF4y2Ba

细胞色素P450单氧酶GydF4y2Ba

DAHPS：GydF4y2Ba

3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate合酶GydF4y2Ba

DW：GydF4y2Ba

干重GydF4y2Ba

dx:GydF4y2Ba

脱氧-D-木糖糖 - 5-磷酸合酶GydF4y2Ba

epsps：GydF4y2Ba

5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate合酶GydF4y2Ba

FAFU:GydF4y2Ba

福建农业与林业大学GydF4y2Ba

弗兰克-威廉姆斯:GydF4y2Ba

鲜重GydF4y2Ba

HDS:GydF4y2Ba

羟甲基丁烯基-4-二磷酸合成酶GydF4y2Ba

嗯：GydF4y2Ba

1-羟基-2-甲基-2（d）丁烯基-4-二磷酸酯GydF4y2Ba

IPK:GydF4y2Ba

Isopentenyl焦磷酸激酶GydF4y2Ba

IPP：GydF4y2Ba

异戊烯基焦磷酸酯GydF4y2Ba

MDC：GydF4y2Ba

甲戊二醇酯二磷酸脱羧酶GydF4y2Ba

Meja：GydF4y2Ba

甲基jasmonateGydF4y2Ba

MPK：GydF4y2Ba

甲戊二醇酯磷酸激酶GydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应GydF4y2Ba

山:GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

“非典”:GydF4y2Ba

严重急性呼吸综合征GydF4y2Ba

SMMU：GydF4y2Ba

第二军医大学GydF4y2Ba

str：GydF4y2Ba

strectosidine合成酶GydF4y2Ba

UGT：GydF4y2Ba

UDP-糖依赖性糖基转移酶GydF4y2Ba

我们感谢陈万生(第二军医大学)提出的有益评论。感谢黄炳儒(Rutgers University)、Paul Fouronjian (Rutgers University)、Chao Bian (Rutgers University)和Qiujie Liu (Rutgers University)对本文的修改。GydF4y2Ba

来自中国国家自然科学基金的资金支持这项工作（授予No.81573517,31670292和U1405215）。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 福建农业与林业大学生命科学学院，福州，350002，中华人民共和国GydF4y2Ba

   建宇，齐烨，佩明龚，小玉马和道智威GydF4y2Ba

2. 福建省农业生态加工与安全监测重点实验室，福州，350002GydF4y2Ba

   建宇，齐烨，佩明龚，小玉马和道智威GydF4y2Ba

3. 作者：陈莹，福州，福州，350002GydF4y2Ba

   建宇，齐烨，佩明龚，小玉马和道智威GydF4y2Ba

4. 第二军医大学药学院药用植物系，上海，200433GydF4y2Ba

   剑玉，六角谭，瑞兵陈，qitao bu，瑞张＆雷张GydF4y2Ba

5. 华东师范大学生命科学学院，上海，200433，中华人民共和国GydF4y2Ba

   剑玉GydF4y2Ba

6. 第二军医大学长征医院药科，上海，200433GydF4y2Ba

   y汉张GydF4y2Ba

7. 福建农林大学作物科学学院，福州，350002GydF4y2Ba

   舒州宁GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

WDZ和ZL构思和设计了实验。YJ，Zyh和NSJ进行了实验。YJ，YQ和THX分析了实验数据。YJ，CRB和BQT写了稿件。Zr，GPM和MXL有贡献的试剂，材料和生物信息学分析。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaLei张GydF4y2Ba或GydF4y2BaDaozhi魏GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba