通过全基因组关联研究和转录组分析，挖掘水稻耐铝候选基因

背景

水稻耐铝性的遗传机制十分复杂。揭示水稻耐铝性的遗传机制是提高水稻耐铝性的前提。在水稻地方品种中挖掘优良基因对提高水稻耐铝性具有重要意义。

结果

在EMMAX中对水稻耐铝性进行了全基因组关联研究(GWAS)，利用Ting的2262个包含380多万个SNPs的核心集构建了150个品种。在Ting的群体结构清晰、亲缘关系密切、链不平衡(LD)衰变率高的核心集合中，有17个与水稻耐铝相关的基因，包括克隆基因如NRAT1, ART1而且STAR1在本研究中被确定。此外，还发现了13个高LD的新候选区域和69个新的候选基因。此外，通过转录组测序，在69个新的候选基因中检测到20个在铝处理和无铝毒性之间存在显著差异。有趣的是，qRT-PCR和CDS区序列分析均表明，本研究的候选基因可能在水稻耐铝性中发挥重要作用。

结论

本研究为进一步利用Ting核心种质中的这些精英基因改良水稻耐铝性提供了重要信息。

世界上超过50%的可耕地是酸性的，全球约13%的水稻是在酸性土壤上生产的[1，2，3.］．大米(栽培稻水稻是世界上最重要的作物之一，世界上近一半的人口以水稻为生。铝(Al)是地壳中含量最丰富的金属，可溶于三价铝(Al)^{3 +})在pH值低于5.0的酸性土壤中。施用铝可显著抑制水稻根系生长，降低水稻产量^{3 +}浓度很高[4，5]而低水平则有益[6］．因此，提高耐铝性对水稻生产具有重要意义。

揭示水稻耐铝性的遗传机制是提高水稻耐铝性的前提。植物生理学家和育种家一直致力于揭示水稻耐铝的遗传机制[7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17］．Al^{3 +}在上述研究中阐明了其毒性，即称为铝的排除^{3 +}在根细胞中产生并排泄螯合化学物质[18]和Al的积累^{3 +}称为内部解毒[10，14，19，20.］．

水稻耐铝性的数量性状位点(QTL)在前人的研究中已通过不同的定位群体得到报道[9，17，21，22，23，24，25］．在此基础上，克隆了水稻耐铝相关基因。ART1［14),STAR1［10),STAR2［10),Nrat1［13),OsFRDL4［18),OsALS1［26),OsMGT1［27),ASR5［20.),ART2［28］．我们对上述QTL/基因进行了总结，发现这些QTL/基因由于作图群体或Al毒性浓度的不同，大部分都不相同。这也说明水稻耐铝的遗传机制非常复杂，今后还需要进一步研究。

链接映射有几个限制:1。在双亲杂交中，任何特定位点上只有两个等位基因可以被研究;2.高成本;3.映射分辨率差[29]，而基于链接不平衡(LD)的关联映射可以克服这些限制[30.]并使研究人员能够利用现代技术来开发自然变异[31］．据报道，一项全基因组关联研究(GWAS)利用约3.6万个snp研究了水稻对铝的耐受性[9]，我们在前期研究中对水稻耐铝性进行了关联分析，仅使用274个SSRs标记进行关联作图[17］．但在以往水稻耐铝性研究中，均未对自然群体的耐铝性进行高分辨率的GWAS研究。

廷的水稻收藏是中国最早的水稻收藏之一，包括150个品种，由7128个原始地方品种中的2262个组成[32］．Ting的核心集合已用于水稻农艺性状的关联作图[33］．此外，Ting的核心集合被报道具有广泛的Al耐受性表型变异，并被用于Al耐受性的关联作图[17］．因此，Ting的核心类群可以作为水稻耐铝GWAS的合适群体。

在本研究中，利用Ting拥有380多万个高质量SNPs的核心样本，对水稻苗期基于相对根伸长(RRE)的耐铝性进行了GWAS分析。将GWAS鉴定的候选区域与以往研究中鉴定的QTL区域以及Al敏感突变体和/或候选基因进行比较。本研究为水稻耐铝性改良的候选基因提供了重要信息。

铝耐受性表型变异的鉴定

Ting的核心收集的水稻地方品种显示了广泛的表型变异，并通过RRE鉴定了铝耐受性的正态分布(图2)。1a，附加文件5表S1)，并表现出较强的Al耐受性，平均RRE为> 0.50(附加文件1:图S1)。

基因组重测序和snp获取

采用全基因组重测序法对Ting的核心集合进行重测序。高质量的snp(附加文件7:表S3)各染色体沿位置分布见附加文件2:图S2总共产生了3,808,730个SNPs，而在CDS区域发现了386,562个SNPs(附加文件7:表S3)。

种群结构和LD估计

对所有snp进行主成分分析，以确定Ting的核心集合的群体结构，观察到两个亚群体(图2)。1b).此外，我们通过r²为Ting的核心集合使用SNP数据。我们发现，在12条染色体上，LD在100~350 kb处下降到最大值的一半(图2)。1c)。

GWAS

使用GLM和MLM，总共有3,808,730个SNPs被应用到铝耐受性GWAS中。我们使用P= 1.07 × 10⁻⁵而且P= 2.63 × 10⁻⁷为我们研究中传销和GLM中RRE的显著阈值(图。1d和附加文件3.:图S3)。在GLM和MLM中分别鉴定出5个和38个分布在12条染色体上的Al耐受性显著位点1)．各染色体上的最高显著信号见表1GLM和传销。我们的结果表明，假阳性在本研究中得到了很好的控制(附加文件4:图S4)。

在我们的研究中，我们确定了17个与水稻耐铝性相关的基因，这些基因在之前的研究中已经报道过(图2)。1D)具有适度显著性阈值(P< 0.001)。此外，在本研究中首次利用传粉法鉴定了13个高LD的新候选区域和69个新的铝耐受性候选基因(附加文件8:表S4)。新的显著关联区域与较小P铝容限的MLM检测值和较高的连续峰值如图所示。1d.这些新的基于基因的关联信号的详细分布在附加文件中9:表S5。

等位基因变异的影响

对13个高显著性SNPs进行等位基因分析，Ting的核心集合中存在的等位基因频率高于参考文献(表2)2)．此外，在基于基因的位置上选择前5个显著的snp来检测等位基因变异对铝耐受性的影响(表2)．具有5个以上SNPs替代等位基因的品种的RRE并不比Ting核心集中具有参考(Nipponbare)等位基因的品种大(图2)。2a).此外，Al毒性处理后，携带等位基因C的耐Al株系Nipponbare (Al- resistant品种)在1号染色体10953,291处的苏木精染色量比携带等位基因T的铝敏感株系优占(Al- sensitive品种)轻(图)。2B和c)。

转录组分析

铝胁迫下(T)和无(CK)铝胁迫下，耐铝品种上调6948个基因，耐铝敏感品种上调1063个基因，耐铝敏感品种共上调796个基因(图5)。3.a).铝耐受性基因下调4910个，铝敏感基因下调544个，铝敏感基因下调322个。3.b).在通过GWAS鉴定的69个候选基因中，通过转录组测序也检测到20个基因在有铝毒性和没有铝毒性的处理之间存在显著差异(附加文件)10:表S6)。

CDS区qRT-PCR及序列分析

通过转录组测序发现，上述8个候选基因在Nipponbare (Al耐受性)和Kasalath (Al敏感性)的根尖表达差异显著(图2)。4)．同时，在CDS区选择了20个候选基因进行测序分析，发现耐铝品种和铝敏感品种在CDS区发现了7个基因的替换、缺失和插入等序列变异，导致氨基酸的变异(表2)3.)．

铝毒性是水稻生产的最大限制之一。基于分离群体的QTL定位是目前铝耐受性研究的主要方法。利用典型铝耐受性和敏感性品种构建了连锁图谱。然而，在连锁作图中，任何给定位点上只能研究两个等位基因。在本研究中，Ting的核心收藏由水稻地方品种组成，代表了野生品种和优秀品种之间驯化的中间阶段[34]用于Al公差的关联作图。在Ting的核心类群中，Al耐受性的表型变异范围广泛，且呈正态分布。因此，Ting的核心集合可以作为Al公差上的GWAS。

利用低分辨率GWAS对水稻耐铝性进行了两次研究[9，17］．在本研究中，超过380万个snp被应用于Al耐受性的GWAS，其分辨率远高于上述两项研究。在100~350 kb范围内，LD下降到最大值的一半(图2)。1C)与之前的测量结果一致[35，36，37］．

Famoso等(2011)的研究是第一个关于水稻耐铝性的GWAS研究[9］．在本研究中，GWAS鉴定了48个与铝耐受性相关的区域。Famoso et al.(2011)和目前的研究共检测到三个区域/位点。在我们之前的研究中，Ting的核心收集使用274个SSR标记进行GWAS [17]，并发现了23个显著的特征标记关联。然而，在我们之前的研究和目前的研究中都没有发现相同的区域/位点。有三个原因可以解释这一点:1。两项研究采用不同分辨率的标记;2.两项研究使用的显著阈值不相同。在我们之前的研究中，P以< 0.05为显著区域/位点。在目前的研究中，可能没有检测到显著的特征标记关联;3.本研究中缺失了18个品种的RRE，而本研究中仅缺失了3个品种。

在本研究中，我们发现在先前报道的基因或区域中没有具有强显著阈值的信号。这可能是因为:1。在之前的研究中使用了不同的材料;2.在之前的研究中没有使用相同的统计模型;3.在以往的研究中，大多数QTL被鉴定为突变;4.Al耐受性受众多等位基因影响，但影响较小，因此本研究无法检测到之前的QTL/基因。因此，一个适度的显著阈值(P< 0.001)，与Huang et al.(2015)的研究相同[38］．我们鉴定出17个基因(P< 0.001)与水稻耐铝性有关，这在以前的研究中报道过(图。1d).接近的显著关联信号OsCDT3在染色体1上[39),Alt_丹1．2在染色体1上[9),OsFRDL4在染色体1上[15),NRAT1在2号染色体上[13),ASR1在2号染色体上[7),LOC_Os02g49790在2号染色体上(水稻基因组注释计划，RGAP)LOC_Os03g55290在3号染色体上(RGAP)LOC_Os04g41750在4号染色体(RGAP)上，STAR2在第5染色体上[10),LOC_Os06g22600在6号染色体(RGAP)上，STAR1在6号染色体上[10),Alt_它有9.1在9号染色体上[9),LOC_Os10g42780在10号染色体(RGAP)上，ASR5在11号染色体上[20.),LOC_Os11g29680在11号染色体(RGAP)上，ART1在12号染色体上[14),Alt_丹12.2在12号染色体上[9]在我们的研究中被发现。有必要注意-log . log₁₀（P)在我们的研究和第一个也是唯一一个GWAS研究中这些重要信号的价值[9]对铝的耐受性与其他水稻性状的GWAS研究相比，差异不大。我们认为，这可能与水稻耐铝机制的复杂性有关。

在我们看来，那些连续位点的峰值低于显著阈值(−log10(P) = 4.97)也有深入分析的价值，因为报道的Al耐受性基因均低于4.97，因此我们设-log10(P) = 3.0为上述峰值的阈值。13个新的高LD候选区域和69个新的候选基因(附加文件)8:表S4)为Al耐蚀性，在我们的研究中首先使用MLM进行识别。在69个Al耐受性候选基因中，有48个基因无法通过注释预测其Al解毒性能，其余21个基因可以通过注释信息和既往研究推测其Al解毒机制(附加文件)8:表S4)。例如,LOC_Os01g09370.1编码一个含锚蛋白重复结构域的蛋白28，有报道称其可能参与应激反应共享的抗氧化代谢调控[40］．因此,LOC_Os01g09370.1可能是一个与铝胁迫有关的基因。LOC_Os01g57350.1，LOC_Os01g57360.1，LOC_Os01g57420.1而且LOC_Os07g29220.1分别编码植物脂代谢所必需的二酰基甘油激酶、酰基转移酶、二酰基甘油激酶和环丙烷-脂肪酰基-磷脂合酶[41］．此外，有报道称脂质可能参与水稻Al的解毒[42，43］．有趣的是，很少有科学家关注水稻耐铝性的脂质研究。含有蛋白质编码的五肽重复结构域LOC_Os01g57410.1发现该蛋白是非生物应激的调节因子[44］．LOC_Os01g25090.1，LOC_Os01g74160.1而且LOC_Os03g30080.1编码转座子蛋白，假定，cata, En/Spm亚类[45]，羧基末端肽酶[46]以及转座子蛋白，假定，cata, En/Spm亚类[44]与金属积累有关。LOC_Os09g33559.1编码一种富含脯氨酸的家族蛋白，而据报道脯氨酸与铝代谢有关[47］．

为了进一步检测我们研究中发现的候选基因的阳性能力，我们选择了两个品种(Al耐受性和敏感性)进行转录组测序。在通过GWAS鉴定的69个候选基因中，通过转录组测序也检测到20个基因在有铝毒性和没有铝毒性的处理之间存在显著差异(附加文件)10:表S6)。有三个候选基因(即:LOC_Os01g57350.1，LOC_Os01g57420.1而且LOC_Os07g29220.1在组脂代谢的候选基因中，Al耐受性基因(T相对于CK)明显上调，而Al敏感型基因在组脂代谢的候选基因中差异不显著。LOC_Os01g57360.1)在Al敏感品种中上调。这两个LOC_Os01g57450.1而且LOC_Os01g57480.1耐铝品种在非生物胁迫应答组中均有上调，而铝敏感品种差异不显著。在群膜蛋白中，两者都有LOC_Os01g74180.1而且LOC_Os06g14030.1耐铝品种上调，而铝敏感品种差异不显著。候选基因表达LOC_Os09g33559.1在耐铝品种中下调，而在铝敏感品种中无显著差异。另外，其余11个未知组候选基因在两个品种中表达上调或下调。此外，CDS区域的qRT-PCR和序列分析也为我们的候选基因提供了更多的支持。

另外，经过GWAS实验，我们一致认为利用Ting核心藏品中具有极值的品种进行进一步研究是更好的方法。本研究在对GWAS进行转录组分析后，通过组织学观察、CDS和qRT-PCR的序列比较来支持GWAS的结果。进行组织学观察，以确定GWAS中显著snp的等位基因变异的影响。转录组分析是试图找到一些与GWAS相同的基因。CDS和qRT-PCR的序列比较都是为了支持GWAS和转录组鉴定的候选基因。我们选择不同的材料进行进一步研究，因为本研究的候选基因应该得到不同的材料支持。我们试图证明，Ting核心种质中自然变异的GWAS候选基因会对水稻在其他材料中的耐铝性产生影响。

本研究通过GWAS鉴定了69个新的铝耐受性候选基因，并通过转录组测序、qRT-PCR和CDS序列变异检测检测了部分候选基因。值得对其进行更深入的研究。

植物材料

丁氏核心珍藏150种本地水稻[48]在本研究中使用。150个地方种族的信息在附加文件中5:表S1。

Al耐受性表型

亭的核心系列种子是2016年晚季(5 - 10月)在中国水稻研究所杭州(30°3 N, 120°2E)农场收获的。相对根伸长(RRE)用于评价所有品种的铝耐受性，详情请参阅我们之前的研究[17］．在处理前后(24 h) 1个重复中，用直尺测定各品种10株幼苗平行生长的RRE，共重复6次。Fu et al.(2010)引用RRE≥0.5作为寻找耐铝品种的标准[49］．

在有铝和无铝条件下培养24 h的水稻幼苗根尖(1~ 2cm)在0.5 mmol l中轻轻摇动⁻¹CaCl₂(pH = 4.0)溶液10分钟。根尖浸泡在苏木精溶液(0.2%苏木精和0.02%碘化钾)中。根尖在去离子水中浸泡45min，直至根尖颜色不清。然后用立体显微镜和光学显微镜对根尖进行拍照。我们选择有展作为与Nipponbare(参考等位基因)具有不同等位基因(替代等位基因)的品种之一，用苏木精溶液对部分snp进行染色。

基因组重测序和SNP呼叫

来自单一植物的基因组DNA被用于测序。采用Illumina HiSeq 4000进行重测序，覆盖6~7倍基因组。我们使用bwamem和BWA软件的-M选项对水稻参考基因组(IRGSP-1.0)进行了150 bp reads的定位[50]，使用GATK中的RealignerTargetCreator对映射的读进行重新对齐[51］．snp用GATK中unifiedgenetyper的−glm BOTH选项进行标记。在筛选低小等位基因频率(5%)的SNPs后，我们的GWAS共保留了3,808,730个SNPs。详情请参阅我们以前的研究[52］．

基因分析

在我们之前的研究之后进行基因分析[52］．基于所有snp对Ting的核心集合进行主成分分析(PCA)和LD衰减分析。采用SPSS 17.0进行PCA分析。使用皮尔逊相关系数平方(r²)用−计算r²PLINK软件命令[53］．利用admix Version 1.22求得各品种隶属度概率的q矩阵。采用软件SPAGeDi计算亲属矩阵，采用Loiselle算法[54］．

GWAS

GWAS共使用了3,808,730个snp。采用TASSEL软件(www.maizegenetics.net/tassel)．P≤2.63 × 10⁻⁷（P= 1 / n;n =总的标记，这是一个粗略的Bonferroni校正，对应于-log₁₀（P) = 6.58)应定义为建议阈值，该阈值与我们先前研究的阈值相同[52]，但无法根据这一阈值识别显著位点。因此，计算另一个显著性阈值，即最小贝叶斯因子(mBF)。mBF的计算公式为:mBF =−e_＊P_＊ln (P) [55]，因此，本研究的显著性阈值为-log10(P) = 4.97。

转录组分析

Ting核心藏品中的一个耐铝品种Bashizi (RRE = 0.65)和一个铝敏感品种Heikedanuo (RRE = 0.34)(附加文件)5:表S1)进行转录组分析。1天后根尖总RNA低于100 μmol⁻¹间变性大细胞淋巴瘤引起_3.使用miRNeasy试剂盒(QIAGEN, USA)提取。RNA样品在琼脂糖凝胶上进行评估，在分光光度计中定量，并保存在−80°C。RNA测序采用Illumina NextSeq 500进行2 × 125-bp对端测序。分别采集铝中毒处理3次和不含铝中毒1次的样品进行RNA测序[56］．

实时的存在

选择耐铝品种Nipponbare (RRE = 0.85)和铝敏感品种Kasalath (RRE = 0.30)进行实时qRT-PCR分析。在无100 μmol和低于100 μmol条件下1 d后根尖总RNA⁻¹间变性大细胞淋巴瘤引起_3.使用miRNeasy试剂盒(QIAGEN, USA)提取。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover (TOYOBO)制造商提供的协议将RNA转换为cDNA。使用THUNDERBIRD™SYBR®qPCR Mix不含ROX (TOYOBO)， Roche Light Cycler®480II检测表达。qRT-PCR引物序列在附加文件中列出6:表S2。泛素被用作内部对照。用2计算相对表达量^——ΔΔCt方法。每个处理分别进行3个独立的生物重复。qRT-PCR反应体系体积为10 μl: SYBR Premix Ex Taq II, 2x, 5 μl;PCR引物(正向+反向，10uM)， 2 μl;cDNA, 2 μl;ddH₂O, 1 μl。PCR程序的剖面为:95°C 3 min;45个循环，95°C为10 s, 58°C为15 s, 72°C为25 s;95°C 10 s;65℃1 min;40°C 1分钟。

候选基因CDS序列变异分析

日本bare，一个著名的耐铝品种。选择两个铝敏感品种Kasalath和IR64 (RRE = 0.29)进行序列变异分析。采用改良SDS法提取基因组DNA。设计引物对每个基因进行CDS测序。PCR扩增CDS, PCR反应体系体积为10 μl。PCR程序概要:94°C 5min;94°C 1 min, 52-58°C 1 min, 72°C 1 - 2 min, 31个循环;最后在72°C下延长5分钟。扩增产物经1% agrose凝胶电泳分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN, Germantown, MD, USA)进行纯化。PCR产物测序后，组装相同CDS序列，并使用BioEdit软件对Nipponbare、Kasalath和IR64的CDS序列进行比对。

本研究中使用的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

cd:

编码序列

背景:

脱氧核糖核酸

“帝无限”:

加速了高效的混合模型关联

IRGSP:

国际水稻基因组测序计划

存在:

定量逆转录pcr

QTL:

数量性状位点

SDS:

十二烷基硫酸钠

单核苷酸多态性:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

感谢马普植物育种研究所的李金泉博士和华南农业大学的刘向东博士。

国家自然科学基金项目31701401，浙江省公益性技术应用研究项目(LGN19C130005)，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室(SKLCUSA-b201713)资助。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有发挥任何作用。

作者指出

1. 张鹏和钟开真对这项工作同样有贡献。

从属关系

1. 中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，杭州310006

   张鹏，钟开珍，钟正正，佟汉华

贡献

构想和设计实验:PZ。进行实验:PZ和KZ。分析数据:PZ, KZ, ZZ。贡献试剂/材料/分析工具:PZ, HT。撰写论文:PZ和KZ。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到彭张．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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