遗传和环境变化的影响玉米的柱头表面上的表皮烃代谢

背景

简单的非异戊二烯类碳氢化合物积聚在生物圈的离散区域，包括作为碳和/或能量存储的细菌和藻类，以及植物和昆虫的角质层，在那里它们可以保护免受环境压力。玉米柱头丝的细胞外角质层富含线状碳氢化合物，因此为研究这些独特代谢物的生物学来源和功能提供了一个方便的系统。

结果

为了检验遗传和环境影响丝表面碳氢化合物积累的假设，并检查不同种质的代谢组组成的广度，对32个遗传多样性玉米自交系的壳包裹丝和壳叶形成的丝进行了角质层碳氢化合物分析。其中大部分通常用于遗传学实验。总油气积累量在自交系之间的差异可达10倍，在羽化丝和壳包丝之间的差异可达5倍。烯烃占总烃代谢组的5-60%，烯烃以单烯为主，在烷基链的第7或第9个碳原子上有双键。基因型和壳壳状态对总油气成藏有相似程度的影响，而基因型主要影响烯烃组成。在进入外部环境3天和6天的蚕丝上，只观察到代谢组的微小差异。进一步研究了环境对代谢物组的影响，通过2年的自交系生长，其中一个自交系更温暖、更湿润。在干旱年份生长的自交系积累了2倍多的碳氢化合物，烯烃相对丰度高22%。综上所述，蚕丝表面烃类代谢组主要受基因型和壳壳状况的控制，环境和基因型与环境交互作用的影响较小。

结论

这项研究表明，在丝的表皮烃代谢的组合物是通过遗传因素显著影响，并使用定量遗传方法因此适合于清扫。这样的研究将澄清负责这些代谢产物堆积的遗传机制，使绸面脂类对环境压力的多样化和复杂化的保护作用的详细功能调查。

植物角质层是植物大部分气生部分与外部环境之间最外层的物理屏障。角质层是由表皮细胞产生和分泌的，由聚酯角质层基质组成，它被一种独特的、易于提取的、非极性的细胞外角质层表面脂质的复杂混合物所包围和覆盖[1，2]．这些表面脂质代谢物，通常也被称为表皮蜡或表皮脂质，包括20个碳或以上的极长链脂肪酸(VLCFAs)以及这些极长链脂肪酸的衍生物，包括脂肪醛、伯和仲醇、蜡酯和碳氢化合物。这些脂类的存在和相对组成因生物而异，也因植物组织和个别组织和器官的发育阶段而异[2，3.]．在功能上，表皮表面脂质提供了一个疏水屏障，限制蒸腾水分的流失，并保护免受非生物和生物胁迫，如干旱、霜冻、紫外线辐射、害虫和病原体[1，4，5，6，7]．

简单，直链烃是昆虫的表皮[中主要成分8和许多植物表皮表面的脂质[9，10.，11.，12.，13.，14.]．烃包括在植物的特定组织，如叶，花和拟南芥的长角果表面脂质成分的50％以上;苜蓿茎;亚麻荠花;和油菜和西红柿[叶2]．在玉米中，虽然碳氢化合物是幼叶表面脂质的次要成分(1%)[15.]和玉米粒(6%)[16.]，它们在成年叶子上的含量更高(17%)[16.花粉（15-50％）[17.]．丝绸富含烃类，包括丝表面的脂质代谢的40-90％在特定自交系[18.，19.，20.]．

玉米丝是雌花的柱头部分，提供花粉受精的管道。在授粉的关键时期，从壳叶中生长出来的丝类在非生物和生物胁迫下特别脆弱，表皮表面脂质被认为是第一道防线。玉米丝表面脂质积累已经从农学上重要的自交系B73和Mo17中得到了分析[18.，19.]，以及筛选对生物胁迫具有抗性或敏感性的种质(如玉米耳虫和致病真菌)[20.，21.]．在支撑表面的脂质代谢物的保护性作用，烃积聚到2至5倍相比，属于丝的部分上已经从包围苞叶出现到外部环境中的丝的部分更高的水平由保护苞叶的自交系少数已检查[包裹18.，19.，21.]．此外，表皮表面的碳氢化合物积累已经被证明受到丝绸暴露于外部环境的时间长度的影响[18.，19.，21.]．例如，B73蚕丝的碳氢化合物含量在出丝后第1至第7天从蚕丝干重的0.2增加到1.2%，在出丝后2至3天急剧增加[19.]．

虽然植物表皮中碳氢化合物的防护能力尚未完全阐明，有证据表明对玉米和其他生物生物和非生物胁迫的作用。是建议对玉米穗丝表皮烃为与减少昆虫取食相关联;特别是，由丝玉米穗虫摄食（美洲棉铃虫[Boddie]）。具体而言，含有含有从特定玉米基因型的丝绸的有机提取的有机切割脂质的饮食抑制玉米耳蠕虫幼虫生长[20.]．同样，角质层碳氢化合物已经被证明影响欧洲玉米螟在成年玉米叶片上的产卵行为(产卵)[22.]证据还表明，碳氢化合物提供了角质层的水和蒸汽屏障，特别是在干旱条件下。例如，水分亏缺导致大豆表皮碳氢化合物增加，特别是烷烃积累[23.),芝麻24.]， 棉布 [25.和拟南芥[26.]．在拟南芥中，水分亏缺诱导了碳氢化合物生物合成基因的表达，ECERIFERUM（CER1），并在烷烃浓度随之增加以及减少水损失率（即表皮渗透性）[26.]．

玉米遗传多样性的广度尚未被用于丝表面脂质代谢组的研究。为了验证遗传和环境显著影响玉米丝表面碳氢化合物积累的假设，我们评估了32个遗传多样性玉米自交系的代谢物组成宽度，包括巢式关联图(NAM)群体的创始人[27.，这为未来在NAM或其他遗传图谱框架中从遗传学角度分析这些性状提供了能力。我们分析了来自这些自交系的出壳丝和壳包丝上的烃代谢物，以评估基因型和壳叶出丝对表面烃代谢物组成的影响。此外，在3天和6天的PSE(15个自交系)和2个生长期(7个自交系)中对该小组的子组进行了调查，以评估增加的环境暴露对该代谢组的影响，并调查基因型和环境(即基因型和环境)之间的相互作用。GXE相互作用）。

在这项研究中，我们调查了32个遗传多样性的玉米自交系的蚕丝表皮表面的碳氢化合物积累，其中包括9个自交系，这些自交系是从之前确定的具有高全基因组多样性的玉米自交系群体中选择的[28.]，四个“过期植物品种保护”（EX-PVP）商业自交系，以及19名玉米NAM人口的遗传多样的创始人自交系中[27.)(表1）.为了评估遗传和环境对表面烃代谢组的影响，我们评估了1)暴露在不同微环境下的羽化丝与壳包丝的表面烃组成;2)使用3天和6天的PSE收集的丝在外部环境中暴露时间不同的丝;(3)自交系连续两年生长的丝绸，以评估生长年份和生长年份之间环境差异的影响GXE相互作用。对于3天PSE期间进行的研究，2010年数据集包括22个自交系，其中大多数是NAM创始人，可能是最广泛的兴趣，随后是2009年数据集，其中包括16个自交系。气相色谱-质谱（GC-MS）碳氢化合物提取物的代谢物图谱显示了一组28种饱和和不饱和碳氢化合物（即分别为烷烃和烯烃），酰基链长度为21到31个碳原子（表1）2）.额外的文件1表S1报告了各组分浓度(μmol /g丝干重)，其总积累量和相对组成因基因型和环境参数而异。

基因型和蚕丝微环境决定了蚕丝表面烃类的丰度

上总烃积累两个壳包封的和出现在3天PSE在两个年的研究基本上改变收获穗丝（即不同的微环境中）的部分。一个Cross the 22 inbred lines evaluated in 2010, total hydrocarbon accumulation varied ~ 11-fold (0.81 to 9.14 μmole/g dry weight) on emerged silks and ~ 9-fold (0.37 to 3.51 μmole/g dry weight) on husk-encased silks (Fig.1）.2009年评价的16个自交系的变异范围略窄，出壳丝的总烃积累量变异约为9倍(1.30 ~ 11.87 μmol /g干重)，壳丝的总烃积累量变异约为6倍(0.80 ~ 4.55 μmol /g干重)2:图S1)。在任何一个自交系中，总烃积累量的变化是一致的，而且往往是显著的，这取决于丝的包裹状态(即出现的相对于壳包裹的丝)。在2010年评估的22个自交系中，有19个显示出的碳氢化合物水平比壳丝高1.4- 2.8倍(图1)。1)，而在2009年观察到更大的变异幅度，16个自交系中有14个表现出1.4- 4.8倍的积累量，比壳包丝高(附加文件2:图S1)。

方差分析（ANOVA）分析表明，基因型，丝包套状态，以及这些因素的相互作用解释所观察到的方差的84％，2010年（附加文件3.表S2)，基因型(部分)R.² = 0.46）具有比丝绸包装状态（部分）更大的影响R.²= 0.23)。相比之下，丝绸包裹状态更多地解释了总成藏变化(部分)R.²= 0.37)比基因型(偏R.²= 0.28)。在这两年中，这些因素的相互作用虽然很小，但却是显著的(部分的)R.²= 0.10)(附加文件3.：表S2），表明丝绸叶片叶片的效果呈血管覆盖物的总含油量变化。

为了探索这组遗传多样性的自交系的代谢组组成模式，我们使用主成分分析(PCA)来检验表面碳氢化合物代谢组的变化在多大程度上可能与本研究中所代表的五个杂种优势群体相关(表)1）.在2009年和2010年的数据集中，基于所有碳氢化合物成分丰度的PCA图显示，杂种优势组在很大程度上无法被代谢组成分分离(图2)。2)这一点对于包裹外壳的丝绸尤其如此，无论杂种优势群如何，它们都紧密聚集在一起。然而，在出现的丝绸样品中观察到了更广泛的变化，特别是B73在这两年间与硬茎杂种优势群的其他成员分离得非常明显。

烯烃组合物由基因型和丝绸微环境的影响

示出了表皮表面烃代谢要由烷烃和烯烃，主要monoenes（即单双在烷基链键），和二烯（在烷基链即两个双键）的少量的（附加文件1：表S1）。结果表明烯烃的来自于2010年种植的22个自交系丝的相对组合物（包含总烃烯烃即％），以通过基因型显著影响（局部R.² = 0.62), and to a much lesser extent by silk encasement status (partialR.² = 0.03) and by the interaction between these factors (partialR.² = 0.08) (Additional file4:表S3)。烯烃的相对组成差异很大，浮丝上烯烃的相对组成占总烃的5.2 - 53.9%，壳包丝上烯烃的相对组成的变化范围也相似，为10.2 - 56.5%(图2)。3.a） .对于其中10个自交系，脱壳丝和裹壳丝之间的烯烃相对组成存在统计上的显著差异（图。3.一种）。B73和OH7B在出现的丝绸上积累了百分比的百分比。In contrast, eight inbred lines (IL14H, TX303, B97, NC350, CML322, Mo18W, NC358, and Mo17) accumulated higher percentages of alkenes on husk-encased as compared to emerged silks, with NC350 exhibiting the greatest difference (i.e. ~ 20%).

16个自交系的丝在2009年生长，并在3天的PSE分析显示出一个较窄的范围内的相对烯烃组成在出壳丝(24 - 49%)和壳包裹丝(30 - 62%)5:图S2)，但趋势与2010年材料增长时观察到的趋势相似。8个自交系的羽化丝和壳包丝的相对烯烃组成存在显著差异，其中6个品种(CML91、CML5、PHG39、B37、Tzi18和Mo17)在壳包丝上积累的烯烃比例较高。而B73和Oh43则表现出较高的烯烃相对组成。B73和Mo17在两个生长年份的变化趋势相似。即，B73在出壳丝上积累了更高比例的烯烃，而Mo17在壳包丝上积累了更高比例的烯烃(图3)。3.a和附加文件5：图S2）。类似于在2010生长的自交系，变化跨越2009年观察到生长的自交系可以主要由基因型解释的（局部的R.² = 0.64），并在较小程度上通过丝绸包装和这两个因素之间的相互作用（附加文件4:表S3)。

为了评估在所观察到的集烯烃的双键位置基因型的影响，我们确定用于与二甲基二硫醚的化学衍生化之后个别烯烃双键位置（附加文件6:图S3)。由于在2010年和2009年的自交系中发现烯烃组成景观具有可比性，所以我们只报告2010年生长材料的数据。在我们的研究中观察到的烯烃大部分是单烯，在烷基链的第7和第8个碳原子之间有一个双键(即7-单烯;C23:1(7)， C24:1(7)， C25:1(7)， C26:1(7)， C27:1(7)， C28:1(7)， C29:1(7)， C29:1(7)， C30:1(7)，和C31:1(7))或在第9和第10个碳原子之间(即9-单烯;C23:1(9)、C24:1 (9), C25:1 (9), C27:1 (9), C29:1 (9), C30:1(9)和C31:1(9))。也鉴定出了键位大于烷基链第9个碳的烯烃，但它们不能通过GC-MS分解成单独的峰，因此被集体量化为Cn:1(> 9)(即C29:1(> 9)和C31:1(> 9))的异构混合物。在C29:1(> 9)混合物中发现的烯烃在烷基链的第10、11、12、13或14位有双键。组成C31:1(> 9)混合物的烯烃在烷基链的第10、14或15位有可识别的双键。虽然单烯是主要可观察到的烯类，但也观察到一种单二烯，C29:2。由于这个二烯的丰度低，双键位置无法从二甲基二硫加合物中破译。

碳链长度为23至31个碳原子的7-和9-单细胞构成出出的大部分烯烃（55至97％;图。3.b）和壳包封的（77至96％的图。3.c)丝绸。对于9个自交系(NC358, Mo18W, CML69, B73, B97, Oh7B, PHG84, CML277和Mo17)，我们观察到与壳包丝相比，羽化丝的9-单烯百分比增加，同时7-单烯百分比降低(附文件)7:图S4)。与烯烃的相对丰度相似，自交系基因型也解释了绝大多数(部分)R.²= 0.55)8:表S4和附加文件9：表S5）。

monoenes内双键位置的基因型差异可以从序列多样性酰基ACP去饱和酶基因内出现

变化的7-和9- monoenes相对组成表明在近交系之间的表达和/或脂肪酸去饱和通路调控的差异，出现和壳包封的丝之间。具体而言，在7-和9- monoenes积累所观察到的变化可以归因于酰基 - 酰基载体蛋白（酰基-ACP）去饱和酶，其利用饱和酰基-ACP作为底物，以除去从两个氢原子的差动作用相邻碳原子以产生单不饱和酰基-ACP。这些酰基-ACP去饱和酶可以具有不同的底物特异性（综述[30.])。几个这些酰基-ACP去饱和酶的核苷酸多态性和基因表达的差异已经与硬脂酸油酸的转化相关联31，这表明遗传多样性是单烯变异的原因之一。玉米基因组编码11个硬脂酰acp去饱和酶基因(sacd)，通过与拟南芥硬脂酰acp去饱和酶(AtSSI2），这是具体的饱和18碳脂肪酸酰基-ACP [31，32]．我们比较了B73现有基因组组合中这11个基因的蛋白质序列[33]及Mo17 [34]（附加文件10.表S6)，并通过国家生物技术信息保守域数据库(National Center for Biotechnology Information conservative Domain Database)鉴定了保守的催化二铁中心、同源二聚体界面和假定的底物结合口袋。其中5个基因的开放阅读框(ORFs)在这些自交系(sacd1, sacd2，sacd5，sacd6,sacd7）.蛋白质序列的比较sacd10揭示的精氨酸至组氨酸取代在一个保守的同型二聚体界面可能影响酶的活性的同型二聚体形式的形成。其余五个开放阅读框（Sacd3, sacd4, sacd8, sacd9和sacd11)在可识别的功能域之外存在氨基酸多态性，但可能仍有助于蛋白质功能的差异。总之，已识别的多态性可能有助于本文观察到的烯烃积累的变化。

偶数碳链长度的碳氢化合物以基因型依赖的方式积累到低水平

目前流行的表皮表面碳氢化合物生产生物合成模型侧重于偶数碳(或酰基)链长脂肪酸前体(2n，其中n表示用于组装脂肪酸的2-碳醋酸单元的数量)，它们被还原为相应的醛中间体，然后脱羰生成奇数碳链长度(即2n-1碳链长度)的碳氢化合物(在[35])。实际上，多数的先前的玉米穗丝的表面上观察到的饱和和不饱和脂肪酸是偶数碳链长度的[18.，19.，20.]．除了这些预期的奇数烃类成分，偶数链长的烃类也在丝表面积累，尽管丰度很低(< 10%的总积累表面烃类;额外的文件11.:图S5)。在生长于2010年的22个自交系中，有18个出现丝系和壳系之间偶数链长烃的相对组成存在显著差异，出现丝系中偶数链长烃的积累量比壳系多1 - 7%11.:图S5A)。在2009年的自交系中也进行了类似的观察，并在3天的PSE中进行了分析(附加文件)11.：图S5B）.在两个田间环境中，在评估基因型中出现的丝绸上观察到的偶数碳链长度碳氢化合物的变化幅度有所不同；2010年，在22个自交系中，这些成分占碳氢化合物的2.0%至10.2%，而在16个自交系中，这一比例为0.6%至4.1%2009年培育的品系。两组自交系的外壳丝变异幅度较小（2009年为0.5%至1.9%，2010年为3.4%，无明显差异）。

均匀编号的碳链长度烃的相对组成被显示为双基因型的相似范围（部分R.²= 0.36)和环境暴露程度(部分R.² = 0.39), as well as by the interaction of these factors (partialR.²= 0.15，附加文件12.：表S7）。因此，蚕丝包裹状态对偶数碳氢化合物相对丰度的环境影响取决于近交系。这一结论也得到了从2009年生长的自交系收集的数据的支持（附加文件）12.：表S7）。总的来说，这些数据表明，除了作为烃生物合成前体的偶数碳链长度VLCFAs，奇数VLCFAs也可以作为前体在基于脱羰途径，尽管以低得多的频率。

丝暴露于外部环境的持续时间影响丝表面烃代谢

因为表皮脂质已经对环境压力的保护性能[1，4，5，6，7，我们假设，与出现时间较短的丝类相比，暴露在外部环境时间较长的丝类，其表面碳氢化合物水平将增加。评估的相对影响基因型,外壳leaf-encasement丝绸和持续时间的接触外部环境,表面烃组成评估出现与husk-encased丝绸从2009年的15个自交系种植和评估暴露于外部环境的两个时间,3 - 6天PSE(表1）.

总烃积累最低限度由丝绸到外部环境的暴露时间（局部的影响R.² = 0.01), and as reported previously for silks evaluated at 3-days PSE (Additional file3.表S2)，主要由蚕丝的装箱状况(部分)来解释R.²= 0.49)和基因型(部分R.²= 0.25)。即便如此，有4个自交系暴露于外部环境6天的总积累量比暴露于外部环境3天的总积累量高1.3- 1.5倍(图1)。4一种）。有趣的是，CML91和M37W在出现的丝网上累积更多的烃，在6天PSE的壳体包裹丝状纤维上也表现出1.2至2.0倍的烃积累（图。4b)。

暴露于外部环境的时间对相对烯烃组成的影响较小(部分影响)R.² = 0.04；附加文件4:表S3)。尽管烯烃组合物对大多数近交系不变化，但特定的基因型在6天PSE下表现出较低百分比的烯烃（图。5）.与烯烃的相对丰度相似，7-和9-单烯的相对组成也受到基因型(部分R² ≈ 0.60），包装状态和环境暴露时间最低限度地解释了观察到的变化（附加文件8:表S4和附加文件9：表S5）。近交系的基因型和暴露于外部环境的持续时间的相互作用解释的7-和9- monoenes，组合物所观察到的变化的少量以及用于烯烃的相对丰度更一般（见ANOVA的基因型X PSE相互作用项模型的其他文件4:表S3，附加文件8:表S4和附加文件9：表S5）。例如，出现了来自六个自交系（B73，CML52，H99，LH1，Mo17的，和PHG39）丝绸表现出5至15％的7-monoenes更高的相对丰度（图6a)和伴随的9-单烯百分比下降在6天的PSE(图。6c).同样，对于来自4个自交系(CML5, CML52, Oh43和PHG39)的壳包丝，我们观察到在6天的PSE中7-单烯的百分比更高(图5)。6b)伴随9-单烯百分比的下降(图。6d）。这可能表明在烃生物合成途径在使用一个代谢转变和/或特定的不饱和脂肪酸的前体的可用性，导致7-monoenes由于暴露于外部环境更高的增加的积累。总的来说，这些数据表明，脂肪酸去饱和通路可以通过在某些自交系环境暴露的增加的持续时间中差异的影响。

现场环境以基因型依赖性方式影响丝面烃代谢物

为了检验这一假设的环境条件可影响代谢的组合物中，我们调查了在两个连续的生长年（即现场环境7个自交系;表1）.在艾奥瓦环境中介网附近收集并报告的天气数据集[36[从种植时间到丝绸收集时间的时间下载。环境条件在2年之间变化很大。2009年和2010年的现场位置分别收到36厘米和74厘米的降雨。此外，2010年平均高温低温和低温均高出约3°C，使2010年温和较温暖，较为较薄的年份。

评价的4个自交系对总碳氢化合物的田间环境响应表现良好，在2009年的试验中，B73、CML322和M37W的总碳氢化合物积累量都是露壳丝和壳包丝的1.6 ~ 2.0倍(图2)。7(a和b). Mo17在2009年(即生长年份更冷、更干燥)的油气积累量增加了1.5倍，但仅在包壳丝绸中。这些数据集的统计评估(附加文件3.：表S2）表明，基因型和丝绸套装状态解释多数烃积累观察到的变异的（部分R.² = 0.29 and 0.25, respectively). Although field environment also contributes to the observed variation (partialR.²= 0.06)，其程度较轻。基因型和包膜状态之间的双向相互作用(部分R.²= 0.08)、装箱状态和现场环境(部分R.² = 0.02) also contribute, but again in relatively small amounts. In addition, a two-way interaction between inbred genotype and field environment (partialR.² = 0.03) supports statistically-significant albeit minorGXE表面烃类代谢组总积累的相互作用。

类似地，表面烃代谢的相对组合物还通过场环境变化的影响。例如，B73，CML322和PHG39表现出较高的约6至12％的烯烃丰度干燥器和冷却器2009场的环境中，并且这种增加是一种不论穗丝是否壳包封的或出现（图7c和d)。相比之下，7-单烯和9-单烯的相对组成在这2年间几乎没有显著差异。统计分析(附加文件4：表S3）表明，田间环境变化和壳叶包裹状态是相对较小的影响因素（部分）R.² = 0.09 and 0.02, respectively) to compositional changes in the silk surface hydrocarbon metabolome, whereas genotype has the largest effect (partialR.²= 0.32)。另外，自交系基因型与壳叶包膜状态之间存在双向互作(部分互作)R.²= 0.08)、基因型和野外环境(部分R.² = 0.11), are small but significant, reinforcing the existence ofGXE在确定表面烃代谢的组合物相互作用。

基因型、丝素微环境和田间环境对表层烃代谢组有影响

利用32个不同的玉米自交系，分别属于5个独立的杂种优势群体GXE相互作用影响二者总烃的积累和代谢物。PCA表明所观察到的不同的表面脂质组合物不簇根据杂种优势群。但是，我们观察到B73表面烃代谢是独一无二的，这可能对商业玉米产量广泛重视。B73一直以来公开发布的等位基因商业种质的一个最重要的贡献在1972年[37]，占1984年至2008年登记的1132个玉米自交系基因组的12%以上[38]．此外，B73种质在单交杂交种生产中对穗亲本尤其重要，其中种子数、种子大小和种子质量都是重要的性状。我们认为B73独特的丝表面代谢组可能是其作为母本优势的部分原因。

细胞外表面脂质(即角质层脂质)的组成在玉米丝的外露部分和外壳部分之间已经被证明是不同的[18.，19.]．在本研究的两个生长期，几乎所有评价的自交系都表现出较高的表层烃积累量。通过对蚕丝微环境的基因型互作鉴定，表明自交系对进入外部环境的蚕丝所经历的条件有不同的反应。另一种可能是丝的发育，因为在出现的丝中细胞分裂和伸长已经停止[39]在PSE的第3天，它们可能在发育上不同于包裹着外壳的同类。在涉及有限数量的自交系的研究中，先前已经观察到吐丝上碳氢化合物积累的增加[18.，19.，21.]．从B73和Mo17中出现的和壳包裹的丝绸可以与之前的研究进行比较[18.]．在本研究中，B73和Mo17在3天的PSE中分别增加了2.2倍和1.4倍的碳氢化合物积累量，而之前的研究分别增加了3.8倍和2.5倍[18.]．这些研究之间观察到的差异可能归因于不同的环境，这再次指示基因型环境（GXE)交互。

地表油气聚集的时间在暴露于外部环境的3天和6天之间变化。与我们在这两个时间段取样的15个不同自交系的结果一致的是，之前的一份报告显示，在PSE增加天数时评估的一个较小的小组在PSE 2- 8天期间表现出不同的烷烃积累模式[21.]．先前的研究表明，自交系B73的壳包丝和羽化丝的总碳氢化合物积累量在3天收获时比在2天收获时增加，在7天收获时增加幅度较小[19.]，和大约2倍相比，3天PSE在6天PSE上从近交系B73和Mo17的出现和壳包封的丝绸多种烃[18.]．然而，在该研究中，对于来自近交系B73的丝绸B73和暴露于外部环境的MO17，对于不同持续时间的MO17，不会观察到总烃积累的显着差异，这是对环境（例如现场环境）效应的暗示。

事实上，我们比较了7个自交系在两个生长期评估的结果，揭示了表面碳氢化合物代谢组组成的差异。我们观察到，在2009年干燥和凉爽季节，一些自交系的总碳氢化合物积累增加，烯烃相对丰度增加。有趣的是，缺水已被证明会增加拟南芥叶片表皮碳氢化合物的积累[26.]，大豆[23.]，还有芝麻[24.，这与这些代谢物对环境压力的保护作用是一致的。本研究扩展和加强了对显著性的观察GXE在丝表面烃代谢，这是在先前的报告使用较少的烃代谢物从更小和更多样化的自交系制成作用[21.]．

偶数酰基链长度碳氢化合物提示烃生物合成的替代前体

烃类生物合成被广泛认为是从偶数酰基链长度的VLCFA前体开始，通过脱羰反应转化为碳原子少一个的相应烃类。虽然在丝的代谢组学中，奇数链长的碳氢化合物占主导地位，但也观察到偶数酰基链长的碳氢化合物，而且在自交系中丰度不同，特别是在出现的丝中。数据集中始终存在偶数编号的烃类，这表明奇数编号的VLCFAs也可以作为脱羰烃类生物合成途径的前体。事实上，之前的研究已经在玉米丝表面发现了奇数链长的脂肪酸(如十七烷酸、三烷酸)[18.，20.]，以及对应的偶数烃，可能导致从这些前体（即十六烷和二十二烷）[18.]．

酰基- acp脱饱和酶的烯烃组成及潜在差异作用

烯烃的组成在自交系之间差别很大，根据基因型和2010年外壳的情况，它占表层碳氢化合物的5 - 57%。即使有如此广泛的变异，仍不清楚烯烃是否具有与烷烃不同的生物功能。有趣的是，一些研究表明，干旱条件会导致角层碳氢化合物的积累，这些研究集中在产生相当数量烷烃的生物体或组织上，而不是烯烃(例如拟南芥、大豆、芝麻)[23.，24.，26.]．烯烃对丝绸普遍的积累和在烯烃组合物中的丰富的多样性可以提供用于对表皮烷烃与烯烃在功能电位差评估易处理的系统，该系统将具有在积聚烯烃（例如大麦）其它植物的应用[40]．

内的代谢组的烯烃部分，特定的烯烃类（即7-和9- monoenes）的丰度向变基于基因型。一个Cyl-ACP desaturases, which introduce carbon-carbon double bonds within saturated acyl-ACP substrates, display different specificities, by either acting on substrates of different acyl-chain lengths (e.g. 16- or 18-carbon acyl chains) and/or by removing hydrogen atoms from pairs of adjoining carbon atoms that are differently positioned in a given acyl-chain. For example, the archetypal desaturase in this class of enzymes is the stearoyl-ACP desaturase, which is specific for the saturated 18-carbon fatty acyl-ACP (i.e. stearoyl-ACP), and removes hydrogen atoms from the 9th and 10th carbon atoms, generating oleoyl-ACP (i.e. ∆⁹-十八烯酰- acp)(在[30.])。随后，通过内质网相关的脂肪酸延伸途径，产生的油酰辅酶a中间体可以被连续拉长，生成长度为20到30多个碳的VLCFA中间体。这些VLCFA中间体可以还原成相应的醛，然后脱羰形成9-单烯系列烯烃。另外，棕榈酰- acp去饱和酶已经在包括拟南芥在内的几种植物中被鉴定出来[41，42]，猫的爪（Doxantha unguis-CATIL.）43]，以及马利筋(Asclepias syriaca）[44]，将16-碳棕榈酰-ACP转化为棕榈酰-ACP（即δ⁹-十六烯酰- acp)，生成7-单烯系列烯烃。事实上，无论是18碳硬脂酸和相应的单不饱和油酸(即∆⁹- 辛烯酸），以及16-碳棕榈酸和相应的单饱和棕榈药酸（即δ⁹对玉米穗丝-hexadecenoic酸）累加[18.，19.]．有用于生成7-和9-单烯系列的烃的其他可能的排列。例如，硬脂酰-ACP去饱和酶可以充当在同一基板（即硬脂酰-ACP）上，但是从第11和第12个碳原子，其通过类似于将产生Δ移除的氢原子^11.-十八烯酰- acp，最终生成7-单烯系列烯烃。虽然还没有找到具有这种底物特异性的硬脂酰acp去饱和酶，但单不饱和疫苗酸(即∆^11.十八碳烯酸），将导致从这个提议的途径已被观察到玉米穗丝[18.，19.]．11种玉米检验sacd基因(31]揭示的这六个窝藏B73和Mo17的之间的氨基酸多态性可能影响功能性同二聚体或以其他方式影响的功能的形成。重要的是，这些多态性可依据在此研究中观察到在烯烃组合物中的变化和提供候补sacd基因的功能特征。

本研究介绍了32种遗传多样性玉米自交系中丝绸表面碳氢化合物景观的详细解剖，鉴定了总烃积累的宽变化和代谢物的相对组成。在许多自交系中，代谢物组合物在出现和壳体的包围部分之间变化，其被暴露于非常不同的微环境，证明了丝环境对负责表面烃代谢物的遗传途径的可能影响。对于大多数近交系的出现的丝塞上观察到的烃积累的增加与碳氢化合物对环境应激的潜在保护作用一致。实际上，日益增长的年份之间的不同环境条件改变了丝绸表面上碳氢化合物的积累，近交系对这些刺激不同。它仍然是特定的环境刺激负责对玉米纤维的影响的概念，在玉米发展的阶段，这些刺激是有影响力的，并且丝绸发展在影响表面烃代谢物中发挥作用的程度。即便如此，这项工作甚至为未来的研究奠定了追求烷烃和烯烃组合物的功能意义的基础，以及特定组合物是否防止某些生物或非生物胁迫（例如昆虫草食物，干旱）。

在这种不同种质中观察到的代谢物变异主要是通过基因型解释的，包括在其他烃组合物性状的总烃积累和明显变化的11倍差异，为识别控制遗传源位的遗传测绘策略提供了基础脂质生物合成。利用本文所示的多种血统线具有独特的烃代谢物的两种现有的玉米协同方法包括使用来自Nam创始线的群体的嵌套关联映射[27.]和与B73xMo17互交作图群体的双亲本连锁作图[45]．最终，控制基因座的协调认识和角质代谢如何抵御环境压力可能有助于将来施加滋生显示出增强的来自特定环境压力保护特定的代谢物。

植物材料和组织取样

一个19玉米的子集（Zea Mays.L.）不结盟运动人口的创始人线[27.]从北部中央区域植物介绍站（AMES，IA）获得。来自近交系PHG39，PHG84，LH1和LH123T的种子被比尔比斯（爱荷华州立大学）和Martin Bohn（伊利诺伊州大学）捐赠。在2009年夏天，在爱荷华州立大学农场（Boone，Ia）和22种近交系数在2010年的爱荷华州立大学（Ames，Ia）种植了28个近交系数。1）.在这两年的研究中，自交系采用完全随机的设计，使用普通栽培方法种植，没有补充灌溉。B73、CML322、CML52、M37W、Mo17、PHG39和Tzi8在这两年的研究中都进行了检测。

在丝绸之前覆盖耳朵射击，以防止授粉，并每天监测壳叶的丝绸射出。对于样品收集，将未成熟的耳朵收获在上午10点至晚上12点至晚上3天或6天PSE，并在冰上运输到实验室。对于2009年的研究，每次自交系收获至少三种生物重复，其中大多数线具有五六个生物重复。对于2010年的研究，每条线收获至少三种生物重复，其中大多数有五个或更多的生物重复。该农艺学上重要的自交系，B73和MO17更深入地复制，每个生物复制超过10个（表1）.从每个生物学重复出现在丝绸从包裹苞叶出现的点被切除。剥壳耳后，皮包裹的丝绸小心地从芯去除，以保证胚珠组织未收集。Silk samples were flash-frozen in liquid nitrogen and stored at − 80 °C.随后，样品在FreeZone 4.5升冷冻干燥系统(Labconco, MO)中冻干，并用Geno/Grinder 2000 (Spex CertiPrep, NJ)粉碎。记录丝粉的质量，进行代谢物积累计算。

碳氢化合物的提取

在提取烃之前，将10 μg六烷(1 mg/mL) (Fluka, WI)直接应用于干燥的植物材料(约100 mg组织)，并作为内标。每个样品中的碳氢化合物在1.5 mL hplc级己烷(Fisher Scientific, NJ)中提取，超声15分钟，13,000离心X g为1分钟。每次离心后收集上清，提取、超声、离心循环重复3次。将组合的上清液通过含有0.6 g硅胶(J.T. Baker, NJ)的玻璃移液管，用10 mL己烷预洗。洗脱后用10ml己烷洗涤硅胶。联合洗脱液在N₂气体在旋转氮气蒸发器(Organomation Associates, Inc.， MA)在30°C。已有研究表明，经干燥和粉状提取的丝样与浸在萃取溶剂中的新鲜丝样之间烃含量没有显著差异[19.]．因此，我们认为萃取的碳氢化合物存在于蚕丝表面。干燥的碳氢化合物样品溶解在1ml己烷中，然后通过GC-MS进行分析。

不饱和烃的衍生化

识别烯烃的双键的位置是由二甲基二硫化物加合物的质谱分析确定为报道46),与修改。提取液在50 μl正己烷、200 μl二甲基二硫醚和50 μl碘溶液(6% w/v乙醚)中40°C孵育24 h。加入500 μl硫代硫酸钠(5% w/v)终止反应，在500 μl己烷中萃取衍生产物。提取液在N₂气相色谱-质谱分析。

气相色谱分析-质谱法

2009年和2010年收集的样本的色谱分析是在爱荷华州立大学的wm凯克代谢组学研究实验室进行的。气相色谱仪(GC;6890系列，安捷伦技术，帕洛阿尔托，CA)，配备质量探测器(5973型，安捷伦技术，帕洛阿尔托，CA)。色谱柱为HP-5MS交联(5%)-二苯基-(95%)-二甲基聚硅氧烷柱(长30 m，内径0.25 mm)，氦气为载气。对于未充分灭菌的烃萃取物，通过不分流进样，将等量的1 μl注入气相色谱，气相炉温度为200°c，增加到280 °答案:C°℃/分钟，进一步提高到320 °C的速率是20°C/min and held at this temperature for 3 min. For extracts derivatized with dimethyl disulfide, 1 μl aliquots were injected into the GC via splitless injection and the GC oven temperature program started at 120 °c，增加到160 °下以10的速度 °C / min并在该温度下保持2分钟，进一步增加到260 °答案:C°C / min并在此温度下保持10分钟，进一步增加到300 °答案:C°C/min，并在此温度下保持5分钟，进一步提高至320°答案:C°C/min and was held at this temperature for 17 min.

为了定量的烃组分，所述质谱仪的响应被校准到每个样品中的二十六烷内标。使用AMDIS软件包[进行定量分析47]，并通过国家标准与技术研究所质谱库鉴定化合物[48]．在补充材料被提供的所有烃的积累数据（附加文件1：表S1）。

GC-MS检测限为0.0034 μmol /g干重。大于零和小于检测限的累加值修改为0.0017进行分析。以各基因型、生长期(即田间环境)、确定相对标准偏差小于33%、平均值小于0.005 μmol /g干重的PSE组合，以确定的平均值平均值计算检出限。

统计方法

所有的代谢物数据都是从至少3个生物重复中收集的1）.假设方差不等的学生t检验使用R的3.4.3版本进行[49，以两两比较羽化丝和壳包丝之间的一个自交系的平均代谢物积累，羽化丝和壳包丝之间的3- 6天PSE时间点，羽化丝和壳包丝之间的生长期。方差分析(如双向和三方)进行了适当分区的数据集从附加文件1:表S1评估基因型和环境因素的影响(补充文件3.:表S2，附加文件4:表S3，附加文件8：表S4，附加文件9：表S5，附加文件12.表S7)使用JMP Pro(版本12.0.1,SAS Institute Inc.， Cary, NC)。PCA利用R/stats基包中的prcomp()函数探索蚕丝表面脂质积累模式[49]，并使用R/ggplot2包中的stat_ellipse（）函数构造95%置信椭圆（图。2）[50]．

本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本发表的文章及其补充信息文件中。

机场核心计划:

酰基载体蛋白

方差分析:

方差分析

EX-PVP：

Ex-plant多样性保护

GC-MS：

气相色谱分析-质谱法

GWAS：

全基因组关联分析

GXE：

基因型x环境相互作用

南:

嵌套的关联映射

orf：

开放阅读框

PCA：

主成分分析

PSE：

Post-silk出现

QTL：

数量性状位点

SACD:

Stearoyl-acp去饱和酶

VLCFA：

极长链脂肪酸

作者感谢博士。安·佩雷拉，卢卡斯飞奔，和宋志宏在爱荷华州立大学W. M.凯克代谢组学研究实验室有关GC-MS援助和咨询的分析。我们还感谢Drs。威廉·比维斯（爱荷华州立大学），马丁·博恩（伊利诺伊大学），保罗·斯科特（USDA-ARS，爱荷华州立大学）访问植物材料和有用的意见。

这项研究是由美国国家科学基金会支持授予EEC-0813570，EFRI HyBi-0938157和IOS-1354799，和由能源艾姆斯实验室系的种子补助。该资助者在研究设计，数据收集和分析，数据解释或书面上没有作用。

从属关系

1. 爱荷华州立大学，阿梅斯，美国阿米斯互联遗传学和基因组学研究生课程

   Tesia Dennison, Nick Lauter, Basil J. Nikolau & Marna D. Yandeau-Nelson

2. 美国爱荷华州立大学植物病理学与微生物学系

   Tesia丹尼森与尼克·劳特

3. 罗伊J. Carver生物化学系，生物物理学，爱荷华州立大学，美国艾姆斯和美国的分子生物学系

   刘文民秦，参孙G. F.康登和罗勒J. Nikolau

4. 现地址：金斯瑞，南京，中国

   Wenmin秦

5. 美国爱荷华州立大学遗传、发育和细胞生物学系

   德里克·M·朗曼和玛娜·D·扬多·纳尔逊

6. 现住址:美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院

   德里克·m·Loneman

7. 地址：美国麦迪逊威斯康星大学生物化学系

   参孙G. F.康登

8. 美国爱荷华州立大学玉米昆虫和作物遗传学研究中心

   尼克清澈的

9. 爱荷华州立大学NSF-工程技术研究中心生物可再生化学品，艾姆斯，美国

   Basil J. Nikolau & Marna D. Yandeau-Nelson

10. 爱荷华州立大学代谢生物学中心，AMES，USA

    Basil J. Nikolau & Marna D. Yandeau-Nelson

贡献

BJN和MDY-N构思了这项研究;MDY-N设计了实验;WQ、SC、TD、DL、MDY-N进行研究;TD、WQ、NL和MDY-N对数据进行分析;TD, DL, NL和MDY-N撰写了文章，BJN, WQ和DL提供了重要的编辑。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Marna d Yandeau-Nelson．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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