固氮细菌和酢浆草-垂直遗传细菌共生的证据

背景

植物与内生菌的共生通常围绕着氮代谢，并涉及不同程度的亲密关系。虽然固氮内生细菌垂直遗传的证据正在增加，但它主要局限于作物植物，迄今为止还没有报道这种系统用于地生植物。

方法

细菌内生菌与酢浆草研究了非洲南部开普植物区系中物种最丰富的地生属。从3个地点的6种寄主植物的营养和生殖器官中分离出可培养的内生菌。利用序列数据对不同人工培养基上的微生物菌落进行形态分型、枚举和鉴定。通过过滤排除实验确定内生菌是否垂直传播到种子，确定黏液是否起到积极吸引土壤微生物的作用，并评估从黏液中分离出的微生物丰富度酢浆草幼苗。荧光显微镜是为了可视化在冷冻切片种子内生细菌。

结果

报道了一种新型垂直传播共生的证据。固氮促进植物生长的群落芽孢杆菌发现内生菌与所选植物有关酢浆草来自海角缺氮环境的宿主芽孢杆菌在不同的物种和植物体中，内生菌普遍存在且种类繁多，在种子中尤为突出。三种常见的固氮芽孢杆菌具有已知的草酸营养特性，似乎被安置在植物体和种子内专门的腔内(含有草酸盐)。

结论

垂直传播的发现和对宿主和内生菌的潜在益处表明，在植物中存在着特别紧密的共生关系酢浆草内生植物系统。这一发现表明，地植物可能以意想不到的方式避免缺氮，并表明这种共生关系比以前预期的更为普遍。

非洲南部的大开普植物区生物多样性热点(开普)以其多样性和物种极其丰富的植物区系而闻名于世[1，2]。迄今为止，这种显著的多样性至少部分归因于非生物因素，如古气候稳定性、可靠的季节性可用水量、地理梯度和不同的土壤类型[3.，4]。砂岩衍生物和大多数土壤的低pH值，加上可预测的冬季降雨和相对频繁的野火，都导致了严重缺氮的营养不良状况[4]。其中包括全球测量到的一些最低的氮和磷水平[5]。氮是所有陆生植物生长发育所必需的[6，7，8]。越来越多的证据表明，不同的Cape植物谱系通过与促进生长和固氮的微生物形成联系而适应[9]。最近有人提出，植物与微生物的相互作用在形成、塑造和维持Cape内的生态系统多样性方面起着重要作用[10，11]。许多最多样化和生态优势的本土开普植物谱系与有益微生物形成了经典的“教科书”共生关系[12，13，14，15，16，17]。不幸的是，很少有研究关注这些关联;很明显，关于Cape植物微生物关联的机制、多样性和作用的可用信息有限[18]。

好望角也以世界上最多样化的地植物区系而闻名，包括来自20个科的2100种植物[19，20.]。尽管驱动这种显著的海角地植物多样性的因素仍然知之甚少，但已经提出了地理分布、气候因素(降雨量和可靠性)和植物生长形式(储存器官大小)[21]。然而，植物与微生物相互作用的作用尚未得到证实[22]。

酢浆草是开普最大的地植物属(180种)，并在非洲南部经历了广泛的辐射(约230种)[1，2]可能起源于好望角[23]。这个属在开普敦的进化成功可能部分归因于其独特的生活史，其中包括地球植物习性，冬季开花和可变的种子策略。然而，这个属的进化成功仍然知之甚少。角酢浆草就种子发芽策略而言，物种是非常不寻常的，因为大约60%的种子具有顽固性。这些种子从果实脱落后立即发芽，与大多数被子植物相比，它们的发芽顺序是相反的，在大多数被子植物中，叶面发育和生长紧随其后的是延迟的胚根生长1:图S1)。这种非凡的发芽策略提出了一个问题，即这些幼苗如何能够在没有发育良好的根或根的情况下进行光合作用和生长。一系列的观察结果表明酢浆草已经发现了与固氮和/或促生长内生细菌(EB)的独特联系。这种联系可能有助于解释生态(和进化)的成功酢浆草在海角极具挑战性的地形条件下

本研究的重点是有益植物与微生物的相互作用，并考虑:1)与Cape相关的EB的存在酢浆草2)寄主内和地点间的EB群落组成，最后3)阐明寄主植物与内共生植物之间关系的本质。

在植物和生殖器官中发现的细菌种类

对6种植物的营养器官和生殖器官中EB的存在和多样性进行了评价酢浆草从三个不同地点取样的宿主物种(图2)。1a).使用通用的16S细菌引物对从灭菌、浸渍的植物材料中分离的纯培养菌落进行鉴定。测序结果显示，92%的重复与形态分型一致，3个重复均显示相似的16S序列，序列间约800对碱基对差异小于2%。对于剩下的两个复制集，其中一个序列与其他两个不同。这个误差范围(2.6%的形态型分配错误)足够小，不会对本研究的结论产生实质性影响。测序用于鉴定种子中的细菌菌落，形态记录用于确定未测序的植物器官中细菌种类的分布。

可培养EB有一个不稳定的群落酢浆草其中最丰富和一致的EB种中有9种来自该属芽孢杆菌。这些物种包括b . aryabhattaiShivaji et al. 2009，巴达维氏白蚁Heyrman et al. 2004，蜡样芽孢杆菌/苏云金芽孢杆菌弗兰克兰和弗兰克兰1887/柏林人1915，地衣芽孢杆菌Weigmann 1898B. megaterium德·巴里1884年、芽孢杆菌1886年百， B. safensis/pumilusSatomi et al. 2006/Meyer and Gottheil 1901B.单纯的;Priest et al. 1989修订版。Heyrman et al. 2005/Sumpavapol et al. 2010和b . subtilus / siamensis1872年科恩。最可能的细菌种类鉴定是基于16S序列和系统发育比较(附加文件)1:图S1)。

在种水平上鉴定了6种细菌内生菌，并利用形态特征(细菌细胞长度)进行了区分b . megaterium和b . aryabhattai基于共识树的未解决关系。在三种情况下，不可能区分两个密切相关的物种。由于这些物种在形态上彼此难以区分，因此这些内生植物被称为b .仙人掌/基因，b . safensis /、和b . subtilus / siamensis根据BLAST结果，表明了这些分离株最可能的两种身份。应该指出的是b的仙人掌和b . subtilus以前从根际和根中分离过两种吗酢浆草源自哥伦比亚的物种[29]，因此被认为是最有可能的EB。对后一分类群的更确切的鉴定需要额外的标记。

芽孢杆菌在寄主植物的根、球茎、茎、叶、种子等器官以及植物根周围的根际土壤中发现了内生菌。绝大多数(77.8%)从植物组织中取样的EB也存在于所研究的特定寄主植物的根际。这表明这些EB是根际细菌的一个子集。其余的EB可能是通过前一个生长季节的定植事件、亲本植物的垂直传播或在培养过程中由于分离方案或EB被琼脂培养基上的其他污渍所淘汰而未能分离或鉴定特定EB而到达植物的。绝大多数EB(91.1%)占据了所有的植物器官，并且所有寄主物种中至少含有2种EB(抗性和正统种)。这表明这些EB是多能内生菌，不受寄主物种、器官或发芽策略的限制。采样位置可能会影响内生菌群落组成，因为从每个站点分离出一个或两个独特的EB或在两个站点之间共享(图2)。1b)。然而，9个确定的EB中有5个在所有三个位置共享(图2)。1C)，表明两者之间的普遍联系芽孢杆菌内生菌和酢浆草主机。

需要注意的是，种子细菌的多样性(芽孢杆菌相对于每株植物(根、球茎、茎和叶)分离的细菌和真菌形态多样性总量，物种(Species)是一个很小的子集(平均为25%)。细菌和真菌定殖的真正内生多样性酢浆草宿主可能比本研究报道的要大得多。

EB从所有寄主物种和地点的表面灭菌、浸渍种子中分离得到。使用通用细菌16S引物对从单一寄主植物的营养(根、鳞茎、叶、茎)和种子组织中分离的多个纯培养菌落进行测序。在88.9%的研究病例中，从亲本植物和种子材料中分离得到相同序列的EB菌株。这些EB的分离和鉴定表明，从亲本植物到后代的垂直传播最有可能解释这一观察结果。

过滤排除实验，以评估水平和垂直传输

已知230种被子植物属的种子和果实在种皮和下胚轴基部周围分泌富含碳水化合物的粘液[32]。最桀骜不驯的海角酢浆草种子萌发时产生大量粘液。通过过滤器排除实验来评估EB是否栖息在发芽幼苗的粘液中，并确定来自土壤的其他微生物是否主动移动到粘液中。过滤器的平均孔径为10 ~ 15 μm，所鉴定的EB尺寸为3.19 × 1.33 μm(长SD = 1.770 μm，宽SD = 0.671 μm)。

形态相似菌落的鉴定成功率为97.4%，约800个碱基对序列之间的碱基对差异小于2%。如果遇到形态上新的或未知的菌落，它们被赋予一个独特的形态型编号。真菌分离物已被记录和鉴定，但不在本文中讨论。本研究以浸渍植物材料中经测序鉴定的EB为对照材料，证实了相同的EB序列芽孢杆菌当在无菌培养基上发芽时，发育中的幼苗粘液中不存在任何其他可培养细菌(图2)。2a - b)。两种阴性对照处理的平均菌种数均显著大于零(无菌琼脂平均= 1.67，±1.118 SE;无菌土壤平均值= 1.89，±1.150 SE, z = 4.592;p> 0.0001)，证实存在从亲本植物垂直传播给后代的种子内生菌。两种阴性对照处理的种数差异不显著(z = 0.908;p= 0.795)。各垂直传播EB的总多样性酢浆草宿主物种(即所有种内重复的总细菌物种多样性)高于每个物种单个幼苗报告的平均值。EB种的不同组合与个体幼苗重复相关。

环境控制处理每株幼苗的分离株数最高(平均= 6.80，±1.121 SE)，而过滤器处理的平均分离株数显著低于环境控制处理(平均= 4.08，±1.129 SE)。2a).过滤器排除处理和环境对照的微生物多样性显著高于对照组(z = 7.399;p< 0.0001, z = 12.343，p< 0.0001)，相对于阴性对照。采样地点可能对分离株的数量有影响，如两者酢浆草从普通花园采集的物种中，每个处理的分离株数显著减少(平均值= 1.17,z = - 2.363，p= 0.018)。这可能表明花园土壤中微生物多样性丧失的瓶颈效应，或者如果它们存在，则使用不利的生长介质来检测此类EB。该实验表明，土壤细菌和真菌的不同组合栖息在黏液酢浆草幼苗，一些可以从根际积极招募和其他提供(通过垂直遗传)的种子本身(图2)。2b)。

分离的EB具有潜在的植物促生长特性

从浸渍中分离的细菌种类酢浆草90.9%的种子被鉴定为EB，具有良好的促进生长和/或固氮特性(附加文件)4:表1)。这意味着有利内生菌垂直传播的选择可能起作用。三种最普遍的内生植物从所有地方分离出来酢浆草宿主和地点均为重氮营养菌种b .仙人掌/基因，b . megaterium和b . safensis /、(无花果。1c).从寄主植物的角度来看，与重氮营养和促进植物生长的EB共生可以被认为是一种非常有益的关联。初步的δ¹⁵N数据从83酢浆草物种的取值范围很广(16.78 - 2.09)^o/_面向对象)，包括相对较轻的值，接近报道的与固氮EB相关的植物的范围。然而，由于采样有限，缺乏参考土壤样本[33]，这需要进一步的测试。据我们所知，这是EB和地生植物之间潜在的固氮关联的第一份报告。未来的研究应探索幼苗和成熟植株的固氮程度。

EB的潜在好处还没有经过测试，但可能包括能源和房屋的碳源酢浆草植物组织。迄今为止，已经从4个病毒中分离出9个EB病毒酢浆草全球物种[34]，其中7种已知具有草营养特性。这些包括Azospirillum brasilenseKrieg & Döbereiner, 1978B.解淀粉菌种Priest et al. 1987、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、山谷芽孢杆菌罗伯茨等人，1996草酸甲基杆菌Tani et al. 2012和沙雷氏菌属fonticolaGavini et al. 1979 [34，35]。草酸营养菌具有代谢能力，利用草酸盐作为它们唯一的(通常是首选的)碳源。35，36]，通常形成共生体以获取这些化合物。草营养细菌已从各种生境中分离出来[37]，但最常见于排泄大量草酸的植物的根际和根部。草酸盐通常以草酸或草酸钙晶体的形式出现在该属的成员中Rumex和酢浆草［37，38，39]。由于草酸盐的毒性和低能量产出，大多数微生物不能利用它们作为能量来源[35，40]。

在本研究中，已知的三种具有草营养活性的EB在Cape中普遍存在酢浆草：蜡样芽孢杆菌/苏云金芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌．重要的是，所有这三种嗜氧营养菌都被报道为固氮菌，并且从每个取样的寄主植物的种子中至少分离出其中的一种。这些发现可能表明两者之间有很强的联系酢浆草植物和重氮营养草营养EB。垂直传播通常在共生关系是互惠的情况下发展，以确保有益的内共生菌从一代传给下一代[41，42]。最近的一项研究表明，EB的草营养特性是确保在寄主植物内定植和传播所必需的[43]。

草酸盐是光呼吸的副产物[44]和高浓度草酸可能对植物组织有害，尤其是光合系统[45]。为了避免这种损害，植物通常将草酸盐划分为细胞内(普通细胞或特殊的晶体异母细胞)或细胞外结构(腔)[46，47]。草酸钙晶体异母细胞和含草酸钙晶体的空腔在植物的储存、营养和生殖组织中都有详细的记录酢浆草［38，48]，包括开普酢浆草(无花果。3.a e)。鉴于异母细胞和空腔在酢浆草草营养固氮EB普遍存在酢浆草宿主，内生菌可能被安置在这些结构中。那酢浆草-相关的草营养EB将利用草酸盐作为碳源，并反过来为宿主提供生物固定的氮，因此是一种有趣的可能性。

在本研究中，绝大多数(95.5%)种子具有大的和(或)丰富的异母细胞或含有草酸盐的空腔酢浆草物种。这种结构上的适应，以及与发芽相关的粘液分泌，可能有助于确保顽固性物种寄主并将有益的内生菌转移到它们的种子中。所有病例均检出草嗜性重氮性EB酢浆草在物种中，顽固性幼苗可能最依赖于这些关联，因为它们的发芽顺序是颠倒的。额外的氮可以减少对根系立即生长的需求，这可以使资源分配从根系萌发转向叶片生长。与EB的关联可能是对这种不寻常的发芽、快速生长和建立幼苗的反向序列的预适应。

如果证明对宿主有益，那么这种与EB的广泛关联可能是一种关键机制酢浆草在像好望角这样营养匮乏的环境中茁壮成长和多样化。这种共生关系的发现可能对目前对细菌分布的理解具有重要意义酢浆草它的解剖学和生理学，在开普植物区系中幼苗的建立和这个属的进化。鉴于缺乏其他地植物的内生关联数据，这可能是Cape和全球范围内更普遍的现象。这一知识也直接关系到所有的保护工作，入侵生物学和预测该属和其他海角植物在当前气候变化预测下的预期反应。

最重要的是，所有这些EB菌株都是通过表面灭菌分离出来的酢浆草种子，说明从亲本植物到下一代的垂直传播。迄今为止，在经过充分研究的作物植物中已记录到促进生长和固氮的种子内生菌[49，50]，但在野生植物中很少有记录[51]。固氮EB在地植物中垂直传播的证实表明，它可能比以前认为的要广泛得多。迄今为止，重氮营养细菌垂直传播的唯一已知例子发生在巨型绳状仙人掌(华氏厚蜡虫) [52]和一种入侵的草(高粱halepensel .) [53]，都来自北美。

重氮营养和/或草营养种子EB的许多有益性状可用于自然和农业系统，特别是在恶劣和营养枯竭条件下生长的植物[54，55]。芽孢杆菌人们普遍知道，用于促进作物生长和产量的品种既安全又高效[56]。能够垂直传播的固氮EB的作用和重要性代表了开普植物区系一个迷人的，但在很大程度上尚未得到充分研究的方面。

垂直传播的发现芽孢杆菌从亲本植物到下一代的内生菌以及对寄主和内生菌的潜在益处表明，在植物中存在着特别紧密的互惠关系酢浆草内生植物系统。鉴于异母细胞和空腔在酢浆草草营养固氮EB普遍存在酢浆草宿主，内生菌可能被安置在这些结构中。这一发现还表明，地植物可能以意想不到的方式避免缺氮，并表明这种共生关系比以前预期的更为普遍。

酢浆草植物材料和灭菌方案

六个系统发育上的代表性酢浆草物种(o . glabra研究。O.希尔塔l， O. obtusaJacq。O. pes-caprael紫癜l .,o . tenuifolia)在南非西开普省的三个地点(Malmesbury [- 33.481121, 18.753625]， Stellenbosch[- 33.932358, 18.874571]和Tulbagh[- 33.311688, 19.096747])取样。所有植物都被正确鉴定并从野外采集(从南非西开普省自然保护委员会获得研究样本采集许可证)。2016年5 - 6月和2017年5 - 6月在每个地点采集5只(相距至少10 m)，无外部微生物感染迹象(无症状)。把植物挖出来，尽量减少对地下器官的干扰，把所有多余的土壤抖掉，直到根部和鳞茎上看不到土壤。在对样品进行内生菌分离处理之前，用5ml无菌水轻轻冲洗植物根，以获得根际样品。根、球茎、茎/根茎(视乎物种的地上生长形式而定):o . glabra，o . hirta和o . tenuifolia有地上的茎;o . pes-caprae，o .紫竹样本总体o . obtusa不)，所有植物的叶子和种子都用手术刀无菌分离，并单独表面消毒。为了进行表面消毒，样品在33%稀释度的家用漂白剂(±5%次氯酸钠)和75%乙醇中洗涤1分钟，并在无菌水中洗涤3次，每次1分钟。作为灭菌控制，每个植物器官的一些额外样本被涂抹在细菌平板计数琼脂(Biolab，默克)和麦芽提取物琼脂(Sigma-Aldrich)上，并在28°C的黑暗中培养7天-未检测到菌落。

菌落的分离

在无菌条件下，用手术刀将植物器官手工切成小段，用5个无菌玻璃珠和1.5 mL的无菌水转移到埃彭多夫管(0.5 mL标记)中。在Stellenbosch大学中央分析设施使用组织分析仪(Qiagen TissueLyser, Retsch MM301)浸泡样品，将1:4无菌水稀释的浸渍剂各200 μL涂于三种琼脂培养基上:细菌平板计数琼脂(Biolab, Merck)，每升琼脂添加4 g草酸钾(BMS Education)的营养肉汤琼脂(Sigma-Aldrich)和麦芽提取物琼脂(Sigma-Aldrich)。将草酸钾添加到营养液琼脂中，以重现寄主植物的高草酸含量(如Sahin(2005)所述);琼脂培养基(pH 5.51)。28°C黑暗培养5天后，所有形态不同的菌落(颜色、形状、大小和/或质地)传代到新鲜培养皿上。对每一种确定的形态再孵育5天后重复此过程，直到获得纯培养物。记录所有细菌形态并拍照。每种形态各有三个个体酢浆草保存每个地点的物种以检验形态鉴定的准确性。将每个有代表性的形态分型，其中50%用于DNA提取和测序，其余50%甘油冷冻保存(- 80°C)。

DNA提取、扩增和测序

为了评估内生菌形态分型的准确性，对来自25种不同细菌形态的3个重复进行了测序，期望每个形态三联体的DNA序列相同。从种子和鳞茎(生殖繁殖体)中分离的形态型在本研究中被优先排序。按照改进的2X CTAB协议进行DNA提取，如Oberlander等人所述。[24]。使用通用细菌引物27F(5′- agagtttgatcmtggctag -3′)和1492R(5′-ACCTTGTTACGACTT-3′)对16S rRNA区域进行扩增和测序[25]。用9 μL dH2O、2.5 μL MgCl组成的25 μL反应混合物进行PCR扩增反应₂各引物0.25 μL (10 μM)， KapaTAQ (KM1000, Kapa Biosystems) 12 μL, DNA (326 ~ 498 ng/μL) 1 μL。PCR热循环条件为:94°C (5 min)， 94°C (1 min)， 49°C (1 min)和72°C (2 min)的30个循环，最终延长至72°C (10 min)。PCR产物在Stellenbosch大学中央分析设施测序。在Chromas v. 2.6.5 (http://www.technelysium.com.au）.使用嵌入的ClustalW函数对序列进行对齐[26]在BioEdit v. 7.2.6 [27]。使用BLAST在线检索将获得的序列与GenBank (NCBI)提交的序列进行比较。

系统发育分析

使用内生细菌16S序列数据集(不包括重复序列)重建系统发育树，从Genbank下载序列(每个序列有三个代表性BLAST结果)酢浆草内生菌序列)以及四种外群细菌。树样本在MrBayes (v. 3.2)中生成，使用nst = mixed命令进行模型选择和2 X 10的伽马率校正⁷代在其他默认设置下。在Tracer (v.1.6)中检查参数值的收敛性[2825%燃烧。共识树被用来辅助物种鉴定(附加文件)1:图S1)。

过滤器排除实验

这些实验的目的是确定EB是否从亲本传播到幼苗(垂直传播)，并确定粘液是否从土壤中吸引额外的微生物(水平传播)。通过筛选实验，评估了从蚕豆黏液中分离出的微生物丰富度酢浆草幼苗。灭菌的凝胶干燥架(Sigma-Aldrich)用作发芽种子和选定处理介质之间的过滤屏障。这些过滤器的孔径(10-15 μm)大到足以允许微生物通过过滤器。过滤器用无菌水湿润，以防止在带有粘液的种子放置在过滤器上时产生人为牵拉效应。实验过滤处理与两个阴性对照(无菌条件)和一个阳性环境对照(土壤)进行比较。

成熟的种子从12个倔强的酢浆草已知能产生大量下胚轴粘液的种(每种20粒种子)。对于每个物种，在每个采样点收集了一个土壤样本(10x10cm和5cm深)(10个物种从田间采样，2个物种从Stellenbosch大学植物园的研究收集中采样)。从南非西开普省自然保护委员会获得了采集野生种子的研究样本许可证。按照上述方案对种子进行表面灭菌。将种子随机分为四组，每组五粒，并分配到四种试验处理中的一种。处理1作为阴性对照，将种子置于无菌琼脂上。处理2作为额外的阴性对照，将种子放置在灭菌过滤器上，并将高压灭菌的土壤样品放置在无菌培养皿中。处理3包括在培养皿中放置无菌过滤器的原始土壤样本。然后将种子放在过滤器的顶部，以确定微生物是否主动向粘液移动。处理4作为积极的环境控制，将种子放在未经处理的原始土壤样本上，以确定微生物是否通过种子粘液和土壤之间的直接接触被动地向粘液移动。 After 3 days of exposure to treatments, each seed was individually removed and the mucilage around the base of the hypocotyl was lightly streaked across one bacteriological and one fungal agar growth medium under sterile conditions. Isolates were sub-cultured to obtain pure culture colonies of each identified morphotype, as described in the protocol above. Morphotypes were visually compared to a reference database created from all sequenced microbes (as described in the section above).

记录不同微生物形态的总数，以评估四种处理下所有种子粘液的微生物丰富度。利用lme4包对微生物形态计数数据进行最优拟合广义线性混合效应模型分析[30.]在R统计环境中，版本3.4.1 (R- core - team, 2014)。处理类型和采样位置作为固定效果和酢浆草作为随机效应的宿主物种。残差图未显示任何明显偏离正态性或均方差。采用事后Tukey检验比较四个治疗组之间的估计值。

种子、幼苗和植物解剖

所有酢浆草球茎、叶片、种子和幼苗材料(从研究采集和野外取样)固定在福尔马林-乙酸-醇(FAA)中，在酒精系列中脱水，逐渐被石蜡浸润并包埋[31]。用旋转切片机(Leitz, Germany)对样品进行切片。切片采用Safranin-Alcian-blue或Safranin-Fastgreen鉴别染色方法进行染色[31并用DPX胶水将这些切片保存为永久玻片。采用尼康ECLIPSE E400光学显微镜研究嵌入植物材料的解剖特征，使用徕卡MC 170高清相机和LAS CORE软件(徕卡，瑞士)拍摄。利用徕卡M125立体显微镜和LAS CORE软件记录幼苗发芽和生长情况。使用Gimp 2.10.2中的“模糊选择工具”删除准备载片的图像背景和植物碎片。

新鲜的酢浆草按照上述方案对种子进行表面灭菌，使用徕卡CM1860紫外低温恒温器(徕卡生物系统)进行包埋和冷冻切片。所有的种子都是从野外收获的酢浆草斯泰伦博斯的人口正在增长切片装在消毒过的玻片上。在收获种子的同一天进行切片和染色。用LIVE/DEAD BacLight细菌生存能力试剂盒(Life Technology)染色，每片100 μL。使用来自Stellenbosch大学荧光显微镜单元(中央分析设施)的卡尔蔡司共聚焦LSM 780 Elyra S1显微镜观察载玻片，以检测种子内细菌的位置。原来的红光和绿光荧光图像已被更改为一种颜色安全的品红和石灰绿色组合。3.i-iii)，使用Inkscape 0.92.3中的“颜色移位功能”(310°到319°)。

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件(附加文件)中1:图S1，附加文件2:图S2，附加文件3.:图S3，附加文件4:表S1和附加文件5表2)。

海尔哥哥:

内生细菌

N -固定:

固氮作用

我们感谢斯泰伦博斯大学和植物与动物学系提供的设施和设备。我们感谢斯泰伦博斯大学荧光显微镜组(中央分析设施)在共聚焦显微镜方面的协助和西开普省自然保护委员会提供的研究样本收集许可证。

我们感谢国家研究基金会提供的稀缺技能博士奖学金(授予M.J.)和国家研究基金会蓝天研究基金(授予L.L.D.)。这些拨款为本研究提供了资金支持，但这些资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释或撰写手稿方面没有发挥任何作用。

从属关系

1. 斯泰伦博斯大学植物与动物学系，私人袋X1，南非，马提兰，7602

   米歇尔·朱斯特，盖伊·f·米奇利和拉萨姆·l·德雷尔

2. 斯泰伦博斯大学保护生态与昆虫学系，私人袋X1，南非，南非，7602

   弗朗索瓦Roets

3. H. G. W. J. Schweickerdt植物标本室，比勒陀利亚大学植物科学综合大楼植物与土壤科学系，私人包X20，哈特菲尔德，0028，南非

   肯尼斯·c·奥伯兰德

贡献

所有作者都设计了这项研究。MJ在LLD的一些现场和实验室协助下进行了大部分研究。数据分析由MJ在KCO的投入和协助下完成。所有作者对数据解释的贡献相同。MJ撰写了论文，FR、GFM、KCO和LLD对两份草稿进行了评论。所有作者都已阅读并同意本文。

相应的作者

对应到米歇尔Jooste．

伦理批准并同意参与

植物的实验研究，包括植物材料的收集，符合机构和国家的指导方针。实地研究是根据当地立法和酢浆草研究样本收集许可证由南非西开普省自然保护委员会颁发。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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