接枝联合形成期间的代谢物分析显示初级代谢的重编程和葡萄叶片移植界面的僵尸合成诱导

背景

用砧木接枝对许多多年生果裁作物的培养至关重要，并且在生产年度水果和蔬菜的生产中正在增加。我们以前基于微阵列的工作表明，在均方移植物（用其自身嫁接的基因型接枝的基因型接枝的基因型）和杂交接枝中的移植蛋白形成期间，在初级和次生代谢的转录物中编码初级和次生代谢的酶的转录物。本研究的目的是归于初级和次级代谢物，并量化苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）和中性反转酶（Ni）的活性，以及​​葡萄葡萄球菌的HOMO和杂交移植物的移植界面嫁接后。将桌面接枝在葡萄叶片的过冬茎（孔）上进行，将移植界面组织（含有一些木质干组织和愈伤组织）与周围的砧木组织进行比较。该目的是鉴定参与移植联合形成和杂覆盆反应的化合物。

结果

测定了54个初级和次级代谢产物(19个氨基酸，5个初级和30个次级代谢产物)和2种酶的活性。接枝界面增加了支链氨基酸、碱性氨基酸和某些二苯乙烯化合物的积累，与周围木本茎组织相比，PAL和NI活性更高。一些氨基酸和二苯乙烯类化合物在接穗/砧木组合的嫁接界面上有不同的积累，其积累方式与它们在周围木本茎组织中的浓度无关。

结论

该研究揭示了初级代谢的修饰，以支持愈伤组织细胞形成和刺激移植界面的刺激合成，以及这些方法如何通过杂覆包移植来修饰。关于成功移植联盟形成所需的代谢物和/或酶的知识为我们提供了识别可供苗圃和研究人员使用的标志物的潜力，以获得选择和育种目的。

嫁接在园艺中被广泛使用，因为砧木可以提供对土壤传播的病原体和非生物胁迫的抗性，并影响接穗的生长和性能[1]．嫁接利用植物天生的伤口愈合机制将两个不同的物种结合在一起，以达到农艺的目的。移植物连接的形成始于坏死层的形成和两个移植物之间的粘连;接着是愈伤组织的增殖，接穗和砧木之间形成功能性木质部和韧皮部连接[2]．嫁接是对植物的相当大的压力，并触发伤口损伤的反应，例如反应性氧物种的产生[3.]，防御相关基因的表达[4，5，6]，防御相关和抗氧化酶的积累[3.，7，8]，酚类化合物[9]和伤口诱导的愈伤组织的生产[10.]．

由于其农艺上的重要性，大多数嫁接结合形成的研究集中在不亲和反应上，这与嫁接后不久接枝不良或嫁接后数月至数年发生的延迟不亲和反应有关。在果树的不亲和反应中已经观察到某些次级代谢物在嫁接界面的积累[9，11.]，橄榄树[12.]，桉树[13.]在葡萄园品种Syrah的死回来的情况下[14.，15.]．已经使用了不同的采样策略（在移植界面上的上述与移植界面下方的采样，在散装界面，散装组织或分离的Phloem中，在移植后的不同时间（从几天到多年）拍摄样品。虽然已经在葡萄葡萄酒的各种组织和中断/砧木组合中已经报道了一些黄酮类化合物的积累[14.，15.迄今为止，没有关于任何物种接枝界面的积累的报道。Stilbenes是一个小家庭，次要的次生代谢产物，包括在内的一些无关的家庭中葡萄科．斯蒂芬以响应许多非生物和生物应激处理累积在葡萄组织中，并且据认为除了植物脂素外，还可以防止氧化应激[16.，17.]．除了代谢物的积累之外，诱导转录物编码的表达苯丙氨酸氨裂解酶（朋友）首先和在苯基丙酮途径中致力于苯丙酮途径，已经与Prunus中的不相容反应有关SPP。［18.，19.]和橡胶树[20.，但未测定这种酶的活性。接枝界面PAL活性的增加可能会增加与胁迫相关的具有抗氧化功能的次级代谢产物的产生，并为木质部形成所必需的木质素的合成提供前体。

我们先前已经描述了相容同种移植物的移植物界面上转录本丰度的变化[21]和葡萄藤的异种嫁接[4]．同种移植物移植后28 d，移植物界面处22个推测参与次级代谢物合成的转录本的丰度增加;包括16号染色体上存在的35个二苯乙烯合酶中的11个[21]．此外，我们将在接枝后葡萄葡萄嘧啶28d的同型和异质移植物之间的移植物界面之间差异表达的转录物的转录物：45个基因在杂血移植物的移植界面上调节次级代谢物的合成，但没有斯莱特合酶基因[4]．这一基因表达数据表明次生代谢产物的产生可能对葡萄嫁接结合的形成和异种嫁接反应起重要作用。本研究的目的是分析嫁接1个月后葡萄藤同株和异株接穗和砧木组织中PAL (EC.4.3.1.24)和NI (EC.3.2.1.26)的一级和二级代谢产物，并定量分析其活性。采用高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和酶法测定了54种初级和次级代谢产物(19种氨基酸、5种初级代谢产物和30种次级代谢产物)和2种酶活性。

葡萄树木植物砧木，中断和移植界面组织的初级代谢物剖面

在同质移植物的移植界面处的愈伤组织的增殖诉酿酒用葡萄简历。接枝后赤霞珠（CS / CS）28d显示出与中隙和砧木组织相比的不同的主要代谢物型材。该移植接口组织（含有木质裂片和砧木组织和新形成的愈伤组织）具有较高的水，蛋白质和GLC含量，与周围组织相比，淀粉浓度较低（图。1。，附加文件1:表S1)。接枝界面组织含水量约为60%，接穗和砧木组织含水量约为50%。这种高比例的水分伴随着蛋白质的积累(约3毫克g)⁻¹FW）在接枝界面组织中，同时在中段和砧木中，蛋白质含量近似为1.7mg⁻¹弗兰克-威廉姆斯。接枝界面葡萄糖浓度较高(3nmol g)⁻¹FW）与中隙和砧木组织（2 Nmol G）相比⁻¹弗兰克-威廉姆斯)。界面处果糖略有积累，但差异不显著。嫁接界面淀粉含量几乎是接穗和砧木组织的2倍。氨基酸的总浓度在三种组织之间没有差异，但某些氨基酸的浓度在接枝界面和周围组织之间是不同的。其中，与接穗和砧木的木质组织相比，CS/CS界面样品中Gln和GABA含量显著升高，而Arg、Lys、His、Phe和Tyr含量较低。

在研究的不同砧木样品之间变化的某些原代代谢物的浓度;CS浓度的淀粉，FRU，SUC，ARG，Pro，PHE，THR，他和遇到的浓度较高，而不是美国砧木基因型（诉? ?XV. Rupestris.简历。1103保尔森(1103P)和诉锐利简历。Gloire de Montpellier（RG）（图。1，附加文件2：表S2）。然而，RG和1103P的GLC的浓度较高（图。1，附加文件2：表S2）。在1103P的木材中，ASN的浓度高，RG的水含量高于另外两种基因型（约53％）。

Cs / Cs的接枝界面样品具有比Cs / Rg和Cs / 1103p的淀粉和较低的水含量更高（图。1，附加文件3.:表S3)。总氨基酸浓度CS /移植接口最高的RG和个别氨基酸特别是积累在移植接口的方式是与他们无关的根茎组织浓度,如Asp的积累,Ile,亮氨酸,Val,爵士,Asn Gln移植接口的CS / RG。CS/RG和CS/1103P中甘氨酸积累浓度高于CS/CS。接枝界面处的精氨酸浓度反映了砧木的基因型特异性积累模式。

CS/CS各组织中Pro浓度均高于其他两种接穗砧木组合。

在移植界面，中断和砧木组织中分析PAL和NI的活动

在本研究中，PAL在CS / CS的移植界面处具有更高的活性，与周围的水域和砧木木质组织相比，Ni也增加，但差异不显着（图。1，附加文件1:表S1)。砧木中的Ni活性存在基因型差异（图。1，附加文件2：表S2），这反映在移植界面组织中Ni活性的差异：Ni活性为10 nmol min⁻¹g⁻¹CS / CS和CS / 1103P中的FW和5 Nmol Min⁻¹g⁻¹CS / RG中的FW（图。1，附加文件3.:表S3)。不同接穗/砧木组合间PAL活性无显著差异(图2)。1额外的文件1：表S1，附加文件2：表S2和附加文件3.:表S3)。

对黄烷醇浓度的分析显示，在接枝界面处黄烷醇的浓度普遍降低

黄黄酮可以存在于葡萄树中作为单体（儿茶素，EpicaTechin及其无磷酸酯）和低聚物（也可以被称为原花青素）[21]．我们的分析允许我们识别几个单体和二聚体(未鉴定的三聚体的总浓度添加到总黄烷醇浓度数据中)。在CS/CS接枝界面处总黄烷醇浓度降低(图)。2，附加文件1表S1)，这种下降主要是由于表儿茶素浓度的下降，因为表儿茶素是CS组织中含量最多的黄烷醇(补充文件4:表S4)。不同基因型的砧木组织黄烷醇谱不同;1103P的黄烷醇总浓度高于其他两种基因型(图2)。2，附加文件5:表S5)。不同基因型黄烷醇的比例也不同;例如，在RG的砧木样品中，儿茶素的比例较高，而在CS和1103P中，其他黄烷醇的比例较高(附加文件5:表S5)。通常，移植界面的黄烷醇浓度的差异主要是由于砧木中代谢物浓度的差异（图。2，附加文件5：表S5和附加文件6：表S6）。

斯蒂芬斯在接枝后28天在移植界面积聚

在接枝后Cs / CS移植物28d的接枝界面在接枝后增加斯蒂芬的总浓度;这主要是由于浓度的增加反式-ε-viniferin(主要的二苯乙烯，在CS木材中发现，Fig。3.，附加文件7:表S7)。此外，其他二聚体和三聚体，如反式- - - - - -ω-viniferin pallidol,CIS.-miyabenol C和α- vinifin在接触面比砧木或接穗组织增加了4倍以上。3.，附加文件7:表S7)。只有一个对称二苯代乙烯,CIS.与周围的木质组织相比，移植界面的浓度显着降低。

砧木木材中的斯蒂芬属于基因型特异性

研究的3个基因型葡萄藤，CS, RG和1103P，在砧木组织中有不同的二苯乙烯分布(图。3.，附加文件8表S8)，但总二苯乙烯浓度在基因型之间没有差异(附加文件2：表S2）。Cs在单体和四聚体（主要是Hopeaphenol）中富有浓郁，而RG和1103P具有较高的二聚体浓度。组织中存在的主要斯蒂莱烯的浓度，反式-ε- vinifin在RG中含量特别高。1103P富含四聚体vittisin A和ampelopsin A二聚体。

大多数斯蒂芬在不同的曲米/砧木组合的移植界面处累积累积

CS / CS和CS / RG接枝界面处的斜裂浓度远高于CS / 1103P（附加文件）3.：表S3），大多数单独的斜纹纤维在Cs / Cs和/或Cs / Rg中较高，而不是Cs / 1103p（Ampelopsin a除了1103p中的高浓度）（附加文件9:表S9)。嫁接界面上二苯乙烯的浓度通常与木本组织中二苯乙烯浓度的基因型特异性差异有关。但需要注意的是，CS/CS嫁接界面上ε- vinifin、pallidol和ω- vinifin浓度的特别高与砧木组织的基因型特异性差异无关。嫁接界面二苯乙烯含量相对于砧木的增幅均低于同种嫁接。在这两种异种嫁接中，只有少量二聚体(孤雌花青素a)，一些三聚体(反式- 和CIS.-miyabenol C和α- vinifin)，一种四聚体(异希望酚)和两种单体(反式- 和CIS.- stringin)在接枝界面处高度增加。

主成分分析(PCA)

在研究中的三个中段，砧木和移植件组织中测量的所有变量进行PCA，并鉴定了与组织类型或基因型相关的变量。前两个主要成分（PC）占总方差的49％，PC1和18％的31％通过PC2解释（图。4）。在分数图中，数据的PCA表明样品根据所研究的组织类型沿PC1清楚地分离（图。4A)，以接穗和砧木的木质样品为阴性面，嫁接界面组织为阳性面。接枝界面与Asn、Ile、Val和Gln氨基酸的积累、含水量的增加和二苯乙烯的积累有关trans和CIS.-piceid，反式-涩皮苷、苍白素、孤雌花青素A和α-葡萄糖苷(图。4b).然而接穗和砧木样品与高浓度的表儿茶素、黄烷醇二聚体B1和B2以及淀粉有关。主成分2根据所研究的基因型对样品进行分离(图。4a），Cs与高浓度的arg，thr，lys，tyr相关联，CIS.-Astringin，1103P与高浓度的血管蛋白A和B，Ampelopsina，儿茶素和黄黄烷醇二聚体B3相关联（图。4b）。

移植联盟形成重新编程初级代谢，以支持愈伤组织细胞的增殖

在大多数植物组织中，愈伤组织细胞在受伤时增殖[22在移植界面处，接枝采用内在伤口反应加入不同的基因型，共同养生园艺兴趣。由于移植界面组织含有杨，快速分割的愈伤组织细胞，这些样品在蛋白质和水中比周围的木质组织更丰富。淀粉浓度在移植接口处减少，而GLC累积。在移植物界面处的Glc的积累与三个真空转化酶的转录和一个六叶草转运蛋白的转录相一致调节[21]．移植界面处的中性转化酶的活性较小，但它不显着。在多年生作物中，嫁接通常在弹簧中进行过次，休眠植物材料进行，使得移植联合形成与弹簧活化的生长相一致[21]．多年生结构中的淀粉储备在春天的时间中调动糖，以支持芽突破的生长[23，24];据推测，淀粉类似地动员，以在移植界面向愈伤组织细胞开发提供糖。同样，Arg是葡萄藤木质组织中的冬季储存氨基酸[25]它在温度和砧木中累积在高浓度下。它可能会被动员和转化为在移植界面处的其他氨基酸（特别是gln）转化为支持愈伤组织细胞发育。谷氨酰胺是移植界面组织（以及大多数植物组织）中最丰富的氨基酸，并且是从无机氮源的氮同化的主要产物，因此对于蛋白质和核苷酸合成是重要的。GABA的浓度也高于同种移植物Cs / Cs的接枝界面高。γ-氨基丁酸由Gln通过Gln合成，并响应各种非生物和生物应力累积在植物组织中。γ-氨基丁酸通过调节碳和氮气平衡，细胞溶质pH和渗透势以及保护氧化应激损伤，具有植物反应的一系列潜在功能，以及保护氧化应激损伤，认为是代谢物和信号分子[26]．有趣的是，Gln和GABA的应用都能促进离体培养中愈伤组织的形成[27，28]．

与周围的木质中隙和砧木组织相比，移植界面在接枝界面下较低的芳族氨基酸Tyr和Phe的浓度。苯丙氨酸和Tyr是形成次级代谢物的重要前体，其响应于损伤的应力而积累。PHE浓度的降低与PAL活性的增加有关，表明PHE在移植界面处转化为次级代谢物。

CS/CS嫁接接穗、砧木茎和嫁接界面组织之间氨基酸浓度的变化与番茄伤愈伤组织代谢组重编程重叠[29的短暂过表达伤口诱导DEDIFFERENTIATION1（风1.）在油菜中[30.]．Apetala2 /乙烯响应因子转录因子风1是拟南芥伤口诱导细胞重编程的关键调节因子[31]．番茄calli [29]，瞬态过度表达风1.［30.[葡萄树的移植界面的特征在于Gln和Gaba的显着浓度，以及Ala，Val和Ile的增加。这表明代谢物重新编程响应于伤口愈伤组织的形成在草本和木质物种之间是类似的，尽管原理风1.在砾石中，在砧木和移植界面组织之间没有差异表达[21一些氨基酸显示出相反的反应。例如，Lys，Thr和Phe在番茄的愈伤组织相对于子叶中累积[29[相比，它们与周围的木质干膜组织相比，它们处于葡萄树的移植界面处于较低浓度。类似地，Pro，Ser，Asp和Gly在番茄的愈伤组织中积累[29]但它们在葡萄树的茎和移植物界面组织之间的浓度不差异。

异种移植物的代谢物分析表明，在冬季形成的游离氨基酸和淀粉储备以及移植物界面的代谢物反应中，存在基因型特异性差异

研究不同基因型之间的初级代谢产物的谱的比较表明，Cs水平高，淀粉和Arg（以及其他一些次氨基酸）比两种美国砧木物种RG和1103P相当高。这可能是由于秋季（储存氨基酸的储备和它们的数量）的形成差异和/或从休眠中动员储备的差异直至接枝后28 d。Cs / Cs的移植界面的淀粉和Arg含量可能与Cs的甲壳（和中隙）木材的淀粉浓度高于其他两个基因型，但下水含量较低，表明这些样品含有较少的愈伤组织组织。

一些氨基酸以与其砧木组织浓度无关的方式在杂 - 移植物的接枝界面上积聚，例如在接枝处的支链氨基酸（ILE，Leu和Val），ASN和Gln的高积聚CS / RG的界面。支链氨基酸在蛋白质合成中具有重要作用，并且编码其合成的酶通常在年轻组织中高度表达[25]．类似地，ASP和GLN是关键的氨基酸，因为它们是其他氨基酸和代谢物的前体。然而，为什么支链链氨基酸，ASP和GLN特别积聚在CS / RG的接枝界面，而不是另外两个中隙/砧木组合尚不清楚。杨树茎的树皮和木材中的游离氨基酸浓度的季节变化表明，当木材的代谢活性增加时，许多氨基酸的浓度增加或只是在芽突破（Arg）之后增加[32]．这可能表明CS / RG的移植界面的代谢活动高于另外两段的曲线/砧木组合的代谢活动，这可能是诉锐利众所周知，在成长未接枝时是早期发展的基因型[33]．

均 - 移植物Cs / Cs的所有组织中Pro的浓度高于两种杂种覆盖的组合，Cs / Rg和Cs / 1103p，表明在移植界面和杂交中覆盖杂交在距离中段的短距离。已知脯氨酸响应于非生长和发展的植物组织中积聚在植物组织中，它具有多种生长和发展的功能[34]，提高水稻愈伤组织发育[28]．与异种移植相比，同种移植CS/CS中Pro的增加可能与Pro合成的增加和/或Pro对细胞壁成分形成的通量减少有关。与CS/RG相比，CS/CS嫁接界面8种富脯氨酸蛋白的转录下调支持了后一种假说[4]．

黄烷醇在CS/CS接枝界面处减少

通常，与周围的木质组织相比，转移界面的黄黄醇（特别是EpicateChin）的浓度降低，大概是木材具有高浓度的黄烷醇，随着愈伤组织细胞的发展而稀释。黄烷醇浓度，特别是EpicaTechin，在移植不相容性的一些研究中被测量[15.，35，36，37，38]但是这些研究通常不会研究移植联合会本身或不包括同性移植的控制，因此很难将这些结果与当前的工作进行比较。然而，对葡萄葡萄葡萄的杂接枝的一项研究还报告了相对于周围的木质组织的移植界面中的表古蛋白酶（但不是儿茶素）的浓度降低[15.建议这种代谢物的变化是葡萄葡萄树中的移植蛋白质形成的典型。

斯蒂芬斯在接枝后28天在移植界面积聚

在接枝后28 d, CS/CS接枝界面上编码二苯乙烯合酶的转录本丰度增加与二苯乙烯总浓度的增加有关，这主要是由于二聚体浓度的增加反式-ε-viniferin（CS木材中发现的主要斯特比氏）和3个三聚体：trans和顺式Miyabenol C，和α-viniferin。斯蒂芬有抗氧化能力[39因此，这些化合物在响应接枝胁迫时积累了抗氧化性能。研究还表明，对越冬葡萄藤的伤害也会诱导二苯乙烯合成酶转录本的表达和二苯乙烯的积累[40]潜在暗示斯蒂芬的积累与愈伤组织细胞形成无关。已知芪合成通过用茉莉甲酸甲酯治疗来刺激[41.[通常在嫁接后28天的Cs / Cs 28天的接枝界面上调节响应于伤害的伤害和茉莉酸盐生物合成途径的转录步骤的转移界面也上调了一种激素。21]．

通常，在葡萄对应激的葡萄牙响应中经常观察到芪浓度的增加和黄酮酸浓度的降低的偶联[42.]．

砧木中斯蒂芬的谱是基因型特异性，某些斯蒂芬在不同的曲米/砧木组合的移植界面处不同地积聚

研究的葡萄葡萄酒的三种基因型，Cs，Rg和1103p在砧木组织中具有不同的斯蒂烯型材，先前在不同品种中报道了芪浓度的基因型变化诉酿酒用葡萄［43.，44.]以及在不同rootstock基因型的根部[45.]．反式-ε- vinifin是所有品种甘蔗中报道的主要二苯乙烯[39，43.，44.，含量在0.43-2.30克/公斤之间⁻¹，这与我们的结果一致。

不同温度/砧木组合的移植界面处的斯蒂芬的积累通常与周围木质组织中斯蒂芬的浓度有关;然而，一些斯蒂芬在接枝界面处特别累积。不同的基因型葡萄。表现出依赖于病原体的芪合成诱导的变化[46.]及紫外线处理[47.，提示二苯乙烯合成在应激反应中存在基因型特异性调节。二苯乙烯在植物防御和胁迫反应中的作用尚不明确。然而，众所周知，不同的二苯乙烯对病原体有不同程度的毒性(其中viniferin是毒性更大的二苯乙烯单体)，而糖基化可以降低这些化合物的毒性[48.]．

嫁接是对植物的相当大的压力，导致伤口响应和愈合过程的刺激（即非分化的愈伤组织的生产及其分化为木质和韧皮肌）。在葡萄葡萄树的移植界面处初级代谢物的代谢物分析表明，移植界面的代谢物重新编程以通过GLN和GABA的积累来支持愈伤组织细胞增殖，以及PHE，ARG，TYR和LYS浓度的减少。在全球范围内，与所有CAROC /砧木组合的周围组织相比，香叶醇的浓度降低，并且在接枝界面上增加了移植界面的浓度。在砧木组织中的黄黄醇和斯蒂芬的谱系中存在基因型特异性差异，尽管移植界面处的这些代谢物的浓度经常反映了这些基因型特异性差异，但观察到一些特异性代谢物累积模式。少数斯蒂芬显示Chion /砧木特定的积累模式;这可能表明，杂交地带两种不同的基因型在一起触发了移植界面的次级代谢和植物防御反应的特异性变化。

植株材料及嫁接条件

vitis Vinifera简历。“赤霞珠N”(Cabernet-Sauvignon N, CS，克隆15;葡萄属国际品种目录号码：1929），诉锐利简历。'Riparia Gloire de Montpellier'（RG，克隆1030;葡萄属国际品种目录号码：4824）和诉? ?XV. Rupestris.混合CV。'1103 paulsen'（1103p，克隆198;葡萄属(国际品种目录编号:9023)硬木于1月(根据制度规定)从法国的一个葡萄园中采集，并作为1米长的茎储存在低温室(4°C)中，直到3月嫁接。植物材料的鉴定是由法国蒙伯利埃的资源生物学中心ampélographique de Vassal收集，通过简单的序列重复标记完成的。获得这种植物材料不需要许可。接穗CS分别嫁接到RG (CS/RG)和1103P (CS/1103P)上，同时嫁接到CS砧木(CS/CS)上;这些接穗/砧木组合亲和度高，嫁接成功率达87 ~ 95%。在嫁接前2天，将休眠、储存的茎(直径约0.8 - 1.2厘米)从冷室中取出，在室温下浸泡以补充水分。接穗采用单芽扦插，砧木在嫁接前不久采用双节脱芽扦插。在直径近似相同的接穗/砧木对上进行机械嫁接。接枝被短暂地浸入熔化的蜡中，然后放入充满木屑的潮湿盒子中，在28°C下进行胼胝体培养28 d。收获三个15个接枝界面区(包括接穗和砧木组织，长度约为5毫米)，并立即在液氮中冻结。2011年春季和2012年春季分别进行了两次独立嫁接实验; some of this material was also used for previously published transcriptomic studies [4，21］

葡萄糖，果糖，蔗糖，淀粉和总蛋白质的测定

乙醇提取的步骤如下:[49.]．基于[中描述的方案，在乙醇上清液上测量葡萄糖（GLC），果糖（FRU）和蔗糖（SUC）在[50.[如下所述测量氨基酸。如[3所述）在100mm NaOH中的颗粒上测量淀粉和总蛋白质。49.，51.];在96孔微孔板中制备测定，并分别在340和595nm处读取溶液的吸光度。

定量游离氨基酸

6-氨基喹啉- n -羟基琥珀酰亚胺-氨基甲酸酯(AccQ-Tag衍生试剂，Waters)衍生后测定游离氨基酸，其描述如下[52.]．使用UltiMate 3000超高压液相色谱系统(Thermo Electron SAS)和FLD-3000荧光检测器(Thermo Electron SAS)对氨基酸进行定量。采用AccQ•Tag Ultra色谱柱，2.1 × 100 mm, 1.7 μm (Waters)， 37℃，0.5 mL min洗脱⁻¹（洗脱液A，乙酸钠缓冲液，pH5.7的140mm;洗脱剂B，乙腈;洗脱液C，水）根据[53.]．记录了250 nm激发和395 nm发射对应的色谱图。为了保持一致的保留时间和稳定的基线，在每次试验前对18个样品进行对照。使用Chromeleon软件7.1版(Thermo Electron SAS)计算峰面积。一套标准氨基酸(丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(半胱氨酸(Cys)， γ-氨基丁酸(GABA)，甘氨酸(Gly)，谷氨酸(Glu)，谷氨酰胺(Gln)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，蛋氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，从西格玛购买的酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)用于对照后和每次运行的中间来量化氨基酸浓度。

酶提取

倪的测量和朋友活动,500毫克的冰冻组织提取4毫升的100毫米Tris-HCl缓冲pH值8.8包含3毫米EDTA(乙二胺四乙酸),亚精胺0.05% (w / v), 4毫米β巯基乙醇,二硫苏糖醇2毫米,0.1% triton x - 100,蛋白酶抑制剂(CompleteTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒片，Sigma)， 1% (w/v)牛血清白蛋白和5% (w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮的混合物。离心后(20分钟，4℃，16000 g)，使用PD-10色谱柱(Sephadex树脂g -25, PD-10色谱柱，GE Healthcare)与25 mL 100 mM Tris-HCl pH 8.8, 3 mM EDTA平衡脱盐蛋白提取物。

酶测定

NI活性使用来自[54.]．对于PAL活性，测定含有100μl酶提取物，其中150μl苯丙氨酸40mm，100mM Tris-HCl pH 8.8,3mM EDTA。举出肉桂酸的产生并在37℃下通过290nm的吸光度变化在37℃下测量。在96-孔聚苯乙烯微孔板中使用板式读取器（Biotek）来定量Ni和PAL活性。

酚类化合物的定量

将一百毫克植物材料在超声浴中在1ml甲醇中萃取10分钟。离心后，将上清液过滤并在毫水（1：1）中稀释，用于分析黄烷醇和斯蒂芬。在40℃下通过HPLC在Agilent SB-C18 RRHD柱上（2.1 X100mm，1.8μm）在40℃下分离黄黄烷醇。梯度如下：溶剂A：0.1％甲酸中的毫克水;溶剂B: 0.1%甲酸乙腈(LC-MS级);流量0.4 mL min⁻¹；0 min: 18% B;3.5 min, 33% B;6.5 min, 33% B;12分钟，40% B;13分钟，95% B;16分钟，95% B;16.5 min, 18% B.儿茶素(西格玛)，表儿茶素(西格玛)和B2(超asynthese)在0.04-50 mg L范围内的校准曲线⁻¹制备50％甲醇。在下列条件下使用三重四肢（6430 TQ，Agilent）进行检测：气体温度：350℃，气体流动：11 L min⁻¹，雾化器15 psi，电压：3000 V.每种分子的量子离子从文献中调整[55.]．二聚体和三聚体都表达为B2的等价物。二苯乙烯在相同的体系中分析，但有不同的梯度:溶剂a: 0.1%甲酸在milliQ水中;溶剂B: 0.1%甲酸乙腈(LC-MS级);流量0.4 mL min⁻¹；0 min：10％b;3分钟，20％b;10分钟，33％b;13分钟，33％b;14分钟，50％b;17分钟，95％B;22分钟，95％B.校准曲线与白藜芦醇，粉末，Piceatannol，astringin，pallidol，parthenocissin，ε-viniferin，ω-viniferin，Δ-viniferin，miyabenol c，hopehenol，异酚，血糖A和vitisinol c范围内0.011-50 mg L.⁻¹准备好了。为每个样品和标准注射1μL。在下列条件下使用三重四肢（6430 TQ，Agilent）进行检测：气体温度：350℃，气体流动：11 L min⁻¹，雾化器15 psi，电压：3000 v;检测模式：MRM（转换适应）[56.]．

统计分析和数据介绍

所有的数据分析和数据展示都是使用R环境完成的[57.在包裹的帮助下。热图是用gplot包制作的[58.]，而PCA用GGPLOT2和造福器制成。

本研究中生成或分析的所有数据均包含在本文中(及其附加文件)。

103 p:

葡萄? ?X血管卢比斯简历。1103 paulsen.

阿拉巴马州:

丙氨酸

Anova：

方差分析

arg：

精氨酸

Asn:

芦笋

Asp:

天冬氨酸盐

BH：

Benjamini-Hochberg.

CS：

vitis Vinifera简历。赤霞珠N.

简历。：

品种

半胱氨酸:

半胱氨酸

EDTA:

乙二胺四乙酸

FRU：

果糖

弗兰克-威廉姆斯:

鲜重

加巴：

γ氨基丁酸酸

glc：

葡萄糖

Gln:

谷氨酸

glu：

谷氨酸

gly：

甘氨酸

他:

组氨酸

HPLC：

高效液相色谱法

Ile：

异吲哚

低浓缩铀:

亮氨酸

LYS：

赖氨酸

见了：

甲硫氨酸

你：

中性转化酶

朋友:

苯丙氨酸氨裂解酶

个人电脑：

原理成分

主成分分析:

原理成分分析

PHE：

苯丙氨酸

亲：

脯氨酸

RGM：

涟漪Riparia.简历。荣誉赞不绝口de蒙彼利埃

系列：

丝氨酸

成功：

蔗糖

thr：

苏氨酸

三:

Trisaminomethane

酪氨酸:

酪粉

瓦尔:

缬氨酸

风1：

伤口诱导DeffifeEntiation1.

作者感谢Jean-Pierre Petit和Jean-Paul Robert的技术援助。

本研究进行了法国国家研究机构与金融支持(ANR)在未来的投资计划的框架,集群中的卓越象牙海岸(ANR-10-LABX-45)和项目计划的国家起源Deperissement du Vignoble (franceagrimer - 22001149 - 00001505)。该研究得到了Bordeaux Metabolome Facility和MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010项目)的支持。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有作用。

作者笔记

1. Duyên prohomme和Josep Valls Fonayet对这项工作做出了同样的贡献。

隶属关系

1. 在inra，大学。波尔多，ISVV，EGFV UMR 1287，F-33140，Villenave D'Ornon，法国

   DuyênProdhomme，CyrilHévin，Ghislaine Hilbert，Nathalie Ollat＆Sarah Jane CoreSon

2. Unité de recherche Oenologie, EA 4577, USC 1366 INRA, ISVV, Université de Bordeaux, F33882, Villenave d’ornon，法国

   Josep Valls Fonayet，CélineFranc，Gilles de Revel＆Tristan Richard

贡献

CH嫁接实验和样品制备,DP, JVF, GH和CF分析代谢物,DP统计分析数据和准备数据,DP, JVF, TR,民主也没有导致数据的采集和解释,SC写了大部分的手稿,DP, JVF修订后的手稿。

通讯作者

对应于莎拉简康森．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

开放访问本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

再版和权限