水稻jacalin相关甘露糖结合凝集素(OsJAC1)的过表达增强了水稻对电离辐射的抗性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物中与jacalin相关的凝集素在防御信号传导、调控生长发育和应对非生物胁迫等方面具有重要作用。我们描述了水稻甘露糖结合jacalin相关凝集素(OsJAC1)在响应伽马辐射DNA损伤中的功能。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

的时间和剂量依赖性变化gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba响应于γ辐射检测水稻中的表达。识别osjac1功能，osjac1过度表达转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba产生植物。有趣的是，OSJAC1过表达赋予了这些植物中的γ辐射的超抗性。使用比较转录组分析，在OSJAC1-过度表达的22个差异表达基因中鉴定了与病原体防御有关的基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba射线照射后的线。此外，在这些转基因株系中测定了与植物DNA损伤反应相关的基因表达谱，揭示了重要的DNA损伤检查点和感知调节成分的表达变化gydF4y2BaMCMS.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba战gydF4y2Ba那gydF4y2BaatmgydF4y2Ba,gydF4y2BaMRE11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

OsJAC1过表达可能通过激活DNA损伤感知和DNA损伤检查点来增强对伽马辐射的高抗性gydF4y2Ba拟南芥，gydF4y2Ba表明OsJAC1在植物DNA损伤反应中起关键作用。这项研究是首次报道甘露糖结合jacalin相关凝集素在DNA损伤中的作用。gydF4y2Ba

凝集素是碳水化合物结合蛋白，在植物和动物中发挥不同的作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在植物中，凝集素与内源性碳水化合物相互作用，据报道参与信号通路[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．已经鉴定出植物凝集素的12个亚科[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．其中一个亚家族，即与jacalin相关的凝集素(JRLs)，因具有类似jacalin的结构域而得名，由25个已确定的成员组成[gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba］．根据其碳水化合物结合特性、亚细胞定位和分子结构，这个大的亚家族进一步分为两个亚家族[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba］．例如，甘露糖结合的JRLs位于细胞核和胞质，而半乳糖结合的JRLs位于维管室[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba］．植物JRLs在应对生物胁迫(如病原体和昆虫攻击)中起重要作用[gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba，以及非生物胁迫，如盐度胁迫[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba］．在功能上，大多数JRL与抗性和信号传导有关，响应于倍数应力[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba］．特别是，具有方向性结构域的JRLs与植物对病原体的防御有关。OsJAC1是一种来自水稻(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba）.如Jiang等人所描述的，该因子在其n端区域包含一个直接域[gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba］．过表达OsJAC1抑制胚芽鞘和节间的伸长，与OsJAC1在生长发育中的调控功能一致[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．此外，Weidenbach等人[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba结论，该蛋白质也参与了植物防御对病原体攻击。gydF4y2Ba

所有生物体的基因组都容易受到各种有害的内源性和外源性因素的影响，包括复制错误、活性氧(ROS)、电离辐射和基因毒性化学物质。电离辐射，包括伽马辐射，是一种致癌物。伽马辐射通过在DNA中引入双链断裂(DSBs)直接破坏基因组[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．dsb的修复有两个重要途径:非同源端连接和同源重组[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．此外，γ辐射还通过产生的ROS间接诱导DNA损伤，这引入了不同类型的DNA病变[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］．细胞DNA损伤反应(DDR)机制，包括维持基因组完整性的修复机制，在所有生物体中基本上都是保守的[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］．DDR的一个重要调节剂是Ataxia Telanciectasia突变（ATM）蛋白[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，这是一个信号传感器，对dsb作出反应。共济失调毛细血管扩张和rad3相关(ATR)蛋白也参与了对单链断裂和停滞复制叉反应的信号传导[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

DNA复制对于将遗传信息传递给子细胞和后代非常重要;因此，所有生物都有保护DNA复制保真度的机制。例如，DNA损伤会对复制机制产生不利影响，并导致复制叉停滞不前。在真核生物中，DNA复制始于许多复制起源[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]通过两步的过程。第一步是原产许可，其在晚期有丝分裂或细胞周期的G1相中开始复制复合复合复合体[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．预复制复合物由细胞分裂6（CDC6），原始识别复合物，细胞分裂周期10依赖性转录物1（CDT1）和迷你染色体维持蛋白2-7（MCM2-MCM7）组成（MCM2-MCM7）。第二步，原点触发，开始激活MCM2-7复合物。组分激酶，例如循环依赖性激酶（CDK）和DBF依赖性激酶（DDK），其特异于细胞周期的S相对于该原始烧制步骤[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在我们的初步微阵列研究中，差异表达gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba发现响应电离辐射（未发表的数据）。几项研究报告说，植物JRL涉及非生物和生物应激的反应[gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba];然而，没有证据表明JRLs在DDR中的作用。因此，我们检测了OsJAC1在DDR中的分子功能。我们试图建立电离辐射和非生物胁迫对表达的影响gydF4y2BaOsJAC1。gydF4y2Ba我们还产生了转基因osjac1过表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba抗伽马射线的细胞系。我们通过对OsJAC1过表达系的比较转录组分析，探讨了OsJAC1在DDR中的作用的分子机制。gydF4y2Ba

表达式的分析gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba水稻对电离辐射、非生物胁迫和植物激素的反应gydF4y2Ba

我们测量gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba暴露于不同剂量的伽玛辐射后2周龄幼苗的表达随时间的变化。gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba在所有水平的照射后立即在水稻幼苗中大大减少了表达（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)与未经治疗的对照相比gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba在100和300 Gy的γ辐射下，植物的转录本分别减少了约150和50倍。与0-h时间点相比，照射6、12和24 h后转录水平略有增加(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba罪犯);然而，在照射48小时后，我们观察到的诱导率大于2倍gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba幼苗中的表达与非辐照对照中的水平相比（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).此外，与未辐照对照相比，所有剂量辐照168 h(相当于7 d)的转录本数量均增加。在100、200和300 Gy的伽玛射线照射下，这些增加分别约为30倍、4倍和8倍。gydF4y2Ba1gydF4y2BaF）。确认这一晚期归纳gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba本研究采用γ辐射或离子束辐照干稻种子，在MS培养基上发芽，2周后辐照。这些幼苗表现出gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba两种类型的辐射反应的转录本(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag h)。gydF4y2Ba

此外,gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba表情因暴露于其他压力源而改变。gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba在盐度胁迫下，表达也上调(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。在用NaCl处理6小时的幼苗中，我们观察到的数量增加约8倍gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba与未经处理的幼苗相比。的gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba在暴露于热应激3 h后，转录本的表达也略有增加，但在暴露6和12 h后没有显著差异(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).的表达水平gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)处理也上调了表达。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC，D）。gydF4y2Baosjac1.gydF4y2BaJA治疗后，表达约为40倍12小时，而SA处理导致5倍诱导gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba此时的表达水平与未处理对照组相比。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaOsJAC1-overexpressing行gydF4y2Ba

我们下次试图通过产生osjac1过度表达来探测os.pac1的分子功能gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba行。原理图(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa）显示了osjac1过表达构建体的结构gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba是由gydF4y2Ba35年代gydF4y2Ba启动子和终结者。转基因品系# 16-6和# 18-2表现出显著的过表达，分别约为70倍和130倍。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba与野生型对照相比，转基因株系的过表达伴随着更高水平的OsJAC1蛋白(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD显示转基因株系在营养生长期早期的形态，表明在没有辐照的情况下，转基因株系与野生型对照相比没有明显的形态差异。gydF4y2Ba

OsJAC1过表达导致对伽马辐射的超抗性gydF4y2Ba

然后，我们评估了OSJAC1过表达对γ辐射响应γ辐射的生长和发展的影响。通过200或300gyγ辐射照射转基因系和野生型对照植物，2周后比较生长率。在没有照射的繁殖阶段，转基因和对照植物之间没有形态差异（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba一种）。在照射之后，OSJAC1过度抑制线在两种剂量照射时比野生型植物增长得更快（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Baa).因此，过表达株系比对照植株更高，积累的质量也更多(图2)。gydF4y2Ba4.gydF4y2Bab, c)。具体而言，在300 Gy γ辐射处理后，osjac1过表达品系的株高和鲜重均比对照高3倍以上。我们还测量了作为盐胁迫手段处理的osjac1过表达系的生长速率。与未受胁迫的植物相比，OsJAC1过表达增强了受胁迫植物的根生长(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。因此，我们得出结论，具有osjac1过表达的植物对γ辐射和盐度应力具有抗性。gydF4y2Ba

osjac1过表达系DNA损伤反应的转录组学分析gydF4y2Ba

下一步研究OsJAC1在DDR中的分子功能。我们对osjac1过表达系进行了转录组分析。从一个野生型对照和两个过表达osjac1的转基因株系经或不经γ辐射处理共产生了超过1.29亿个修剪的reads(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.修剪后的reads被映射到ARAPORT数据库的参考基因集(gydF4y2Bahttps://www.araport.org/gydF4y2Ba）.6个样本的平均映射率为84%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.数字gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba结果显示，与野生型对照相比，在100gy辐照后，过表达的两个osjac1系中DEGs的上调和下调数量。这两个转基因品系共有12个上调和10个下调的deg。在上调的DEGs中，检测到3个木葡聚糖内转葡萄糖基酶/水解酶基因(AT4G14130, AT3G23730, AT5G65730)(表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.有趣的是，在两个osjac1过表达系中，病原菌防御相关基因，如抗病蛋白(AT5G41740和AT5G41750)和npr1样蛋白(AT5G45110)都是下调的基因。额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S1显示了osjac1过表达线中所有注释的转录本的表达数据。gydF4y2Ba

我们接下来评估了在osjac1过表达线中参与的基因的表达谱，在osjac1过表达系中，没有γ辐射（图。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.在没有照射的情况下，表达gydF4y2BaMCM5gydF4y2Ba那gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba在osjac1过表达系中比野生型对照中更明显。在辐照之后，表示gydF4y2BaMCM6gydF4y2Ba和gydF4y2BaMCM7gydF4y2Ba与辐照对照植物相比，osjac1过表达株的表达显著上调。gydF4y2Ba

此外，在没有照射的情况下，与野生型对照相比，OsJAC1过表达显著降低了At1g23750(复制蛋白A1)的转录水平gydF4y2Ba．gydF4y2Ba较少gydF4y2BaRPA3AgydF4y2Ba和gydF4y2BaRPA3BgydF4y2Ba记录在gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba与野生型对照相比，γ辐照导致了这两个基因的转录诱导(图。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.这两个gydF4y2BaPOLGAMMA1gydF4y2Ba与野生型植物相比，在没有照射的转基因中，在转基因中升高AT5G67100（DNA聚合酶Alpha亚基A）基因。类似地，聚合酶ε子单元的表达水平gydF4y2BaTIL1gydF4y2Ba和gydF4y2BaTIL2gydF4y2Ba在未辐照条件下，过表达OsJAC1增加，而在γ辐照后，这些转录本轻微减少。此外，γ辐照导致转基因株系中At1g67320 (DNA引物酶大亚基)基因的转录诱导(图)。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba显示同源重组修复所涉及的基因的表达水平。osjac1过度表达影响了积累gydF4y2BaatmgydF4y2Ba．与野生型对照相比，该基因在未辐照过表达的osjac1系中表达显著上调。有趣的是，我们并没有发现gydF4y2BaATR.gydF4y2Ba过表达线和野生型控件之间的表达式(数据未显示)。gydF4y2Ba减数分裂重组11.gydF4y2Ba（gydF4y2BaMRE11gydF4y2Ba） 和gydF4y2Ba范可尼贫血组J蛋白gydF4y2Ba在辐照和非照射植物中osjac1过表达上调（图。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba显示核苷酸切除修复、错配修复和非同源重组相关基因的表达模式。在核苷酸切除修复中，OsJAC1过表达增强了的转录积累gydF4y2BaDDB1AgydF4y2Ba和gydF4y2BaDDB1BgydF4y2Ba（UV受损的DNA损伤结合蛋白）在非照射条件下（图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba一)gydF4y2Ba．gydF4y2BaDNA错配修复基因gydF4y2BaMSH3gydF4y2Ba那gydF4y2BaMSH6gydF4y2Ba,gydF4y2BaMLH3gydF4y2Ba两种转基因素增加（图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Bab)，未经γ辐射过表达OsJAC1，非同源重组修复因子At4G57160 (DNA连接酶4)基因表达增加(图4)。gydF4y2Ba8.gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

OsJAC1参与对非生物胁迫的响应，包括伽马辐射和盐胁迫gydF4y2Ba

JRLs与植物对胁迫的反应有关，包括非生物胁迫和病原体攻击[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba］．的表达gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba在暴露于伽马辐射和离子束之后，以时间和剂量依赖的方式上调，其编码JR1（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.我们注意到这些回答与之前的两项相关研究有一些相似之处。Jin等人[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，利用微阵列分析，观察暴露于伽玛辐射下的人间充质干细胞中与信号转导、转录和代谢相关的基因的时间和剂量依赖性表达。这些基因要么参与细胞防御，如细胞凋亡和应激反应，要么参与基本的细胞过程，如DNA复制和修复。人们也注意到gydF4y2Ba衣藻reinhardtiigydF4y2Ba[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba[γ辐照改变许多DDR基因的表达。来自响应之间的相似之处gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba我们推测OsJAC1可能参与了DDR，可能参与了这些过程中的信号转导。gydF4y2Ba

鉴于JRLs在植物对胁迫的响应中起核心作用，我们还研究了植物对胁迫的响应gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba表达盐度应力。盐度应力，如辐照，增加gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba在水稻中的表达(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与野生型对照相比，osjac1过表达系表现出对盐胁迫的抗性(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。Zhang等人也做了类似的观察[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba他还发现了凝集素与水稻的非生物胁迫(包括盐胁迫)之间的关系。盐胁迫对植物的一个影响是活性氧的产生[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]，也通过电离辐射产生。ROS损害细胞组分，包括DNA，多种方式[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，这些相似的反应进一步加强了OsJAC1与DDR之间的关系。gydF4y2Ba

JRL由植物激素JA和SA调节，与植物中的应力反应和病原体防御有关[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．因此，我们检测了这些激素对表达的影响gydF4y2BaOsJAC1。gydF4y2Ba激素增强了转录gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC，D）。SA与遗传毒性应力相关，导致甲磺酸乙酯和甲基汞氯化物接触[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]，并可能增强与基因毒性应激相关的信号通路[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba];但是，SA在该信号传导中的作用仍然尚不清楚[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．这些激素在植物防御响应对ROS中发挥中央作用[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，其信号通路受HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba积累在gydF4y2Bacat2拟南芥gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．同样的,沉默的gydF4y2Bamannose-binding凝集素gydF4y2Ba（gydF4y2BaCamlb1.gydF4y2Ba）转录结果导致辣椒植物中的抗病性和ROS积累的减少[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba］．此外，Weidenbach等人[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba据报道，osjac1介导水稻病原体防御反应。然而，有趣的是，DEG分析显示在OSJAC1过度抑制线中病原体防御相关基因的下调（表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这些结果表明，OsJAC1通过与植物ROS水平的协调调控不同的逆境，如DNA损伤和病原菌攻击。gydF4y2Ba

OsJAC1的过度积累导致DNA复制成分的调控gydF4y2Ba

OsJAC1和非生物胁迫之间的关系是有充分记录的[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba]但尚未建立该蛋白质的分子功能。我们首先在植物暴露于γ辐射之后DDR在DDR中的分子功能。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba过表达OSJAC1的线向伽马辐射显示耐受性（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba）.此外，DEG分析显示，这些转基因株系突出了在伽玛辐照后参与病原体防御的基因的差异表达(图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba和表格gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.ojac1在病原体防御中的功能已经被很好地描述了[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．Hadwiger等。[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]也报道了DDR与通过SA信号防御病原体密切相关。因此，在OsJAC1过表达系中，病原体相关基因在gamma辐射响应中的差异表达表明，OsJAC1可能参与了DDR和病原体防御之间的重叠通路。gydF4y2Ba

DDR作为许多DNA修复途径的调节信号，这些途径可能已经进化到维持基因组完整性。DDR还调节细胞凋亡、衰老和DNA复制过程[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．DNA复制是细胞增殖的关键步骤，因为传播的基因组重复在所有生物中都是必不可少的。数字gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba显示与OSJac1过表达线中的DNA复制相关的基因的表达水平。它特别感兴趣的是抄本数gydF4y2BaMCM4gydF4y2Ba-gydF4y2BaMCM7gydF4y2Ba在osjac1过表达线中增加。MCM蛋白是DNA复制的许可因子[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．对于复制前复合物的形成，MCMs与OCR、CDT1和CDC6/CDC18形成复合物[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba那gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba罗马数字gydF4y2Ba基因已经被确认gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba那gydF4y2BaZea Mays.gydF4y2Ba,gydF4y2Bao.苜蓿gydF4y2Ba并且在具有复制细胞的年轻组织中表达[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］．我们观察到显著的积累gydF4y2BaMCM6gydF4y2Baosjac1过表达系暴露于伽玛辐射后的转录本(图。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.Dang等人。[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba[]注意到MCM6单次亚基在植物中的非生物胁迫耐受性必不可少。上调gydF4y2BaMCM6gydF4y2Ba在暴露于盐度和冷应力的豌豆植物中检测到，以及豌豆过度表达gydF4y2BaMCM6gydF4y2Ba烟草对盐胁迫具有抗性。因此,upregulationgydF4y2Ba罗马数字gydF4y2BaOsJAC1过表达的转录本表明OsJAC1可能参与了盐和伽马辐射诱导的DNA复制胁迫的调控。gydF4y2Ba

RPA是一种单链DNA结合蛋白，由三个亚基(rpa1,2,3)组成，与DNA修复、减数分裂和DNA复制有关，并激活细胞对DNA损伤的反应[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．低水平的gydF4y2BaRPA3AgydF4y2Ba和gydF4y2BaRPA3BgydF4y2Ba在辐射与野生型对照相比，在osjac1过表达系中检测到转录物，但伽马辐照增加了这些数量gydF4y2Ba战gydF4y2Ba成绩单(无花果。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.DNA聚合酶epsilon由四个亚基组成:一个大亚基TILl (Pol2)和三个小亚基DNA结合蛋白(DPB) 2,3,4 [gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．聚合酶Delta和Epsilon的确切功能仍然存在争议，但聚合酶epsilon与复制误差修复和复制应激感测相关[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．在osjac1过度抑制线条上，gydF4y2BaTIL1gydF4y2Ba和gydF4y2BaTIL2gydF4y2Ba与野生型植物相比，这两个亚基的基因水平上调，但与辐照前相比，辐照后这两个亚基的基因水平略有下调(图1)。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba突变体gydF4y2Baabo4-1gydF4y2Ba具有部分有缺陷的聚合酶ε亚基，对复制应激但对DNA损伤剂的过敏，包括Zeiocin [gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba］．此外，过表达聚合酶ε小亚基DPB2受损DNA复制gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．因此，我们得出结论，OsJAC1过表达改变了参与DNA复制的基因的表达，表明OsJAC1在DNA复制中的功能。gydF4y2Ba

OsJAC1可能与MRE11和ATM协同增强DNA修复gydF4y2Ba

对DNA损伤的细胞反应受到蛋白激酶ATM和ATR，其被不同类型的DNA损伤激活[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba］．ATM主要是响应于DSB而激活的，而ATR响应于停滞的复制叉而被激活。坎曼等人。[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]观察到响应于哺乳动物细胞中的DSB诱导电离辐射的ATM激活。在本研究中，OSJAC1过度抑制线呈现更大gydF4y2BaatmgydF4y2Ba在没有照射的情况下，转录本的表达量比野生型对照高(图。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba)，而在数量上没有差异gydF4y2BaATR.gydF4y2Ba在转基因株系和对照株系之间观察到转录本(数据未显示)。我们还观察到gydF4y2BaMRE11gydF4y2Ba与野生型对照相比，osjac1过表达系的表达量(图。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba）.MRE11是MRN复合体的组成部分，包括辐射敏感50 (radi50, RAD50)和奈梅亨断裂综合征1 (Nijmegen broken syndrome, NBS1)，是dsb的传感器。该复合物在DNA损伤修复、DNA复制、减数分裂和基因组稳定性中也很重要[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba］．与dsb结合后，MRN复合体激活ATM [gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]但是，ATR激活不需要这种复杂的[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba］．MRE11和DNA复制之间的相互作用已经被注意到。具体来说，MRE11对于恢复羟脲诱导的HeLa细胞复制应激是必要的，在羟基脲或紫外线处理后，MRN复合物和RPA共定位并相互作用[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba］．这些结果表明，osjac1通过与ATM和MRE11的协调调节DNA损伤感知和DNA修复以及DNA复制。gydF4y2Ba

此外，我们还研究了OsJAC1在核苷酸切除修复中的作用。紫外线损伤dna结合蛋白复合物首次在人类细胞中被报道。过度的gydF4y2BaDDB1AgydF4y2Ba和gydF4y2BaDDB1BgydF4y2Ba增强了对紫外线的抵抗力gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，而两个淘汰突变体，gydF4y2BaDDB1A.gydF4y2Ba和gydF4y2Baddb1b,gydF4y2Ba易感[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．我们的结果与之前的报告一致gydF4y2BaDDB1AgydF4y2Ba和gydF4y2BaDDB1BgydF4y2Ba记录在gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba- 重新表达转基因系（图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Baa).由于核苷酸碱基的插入、缺失和错误的结合，导致聚合酶错误的结合和错误的DNA重组。DNA错配修复(MMR)系统检测和修复这些不匹配的核苷酸，并且gydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba基因在基因组维护中发挥重要作用[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．MSH（MUTS同源物）和MHL（MUTL同源物）是高度保守的蛋白质;虽然，这些因素具有多种蜂窝功能[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．在本研究中，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba过表达osjac1的线条具有更大的表达gydF4y2BaMSH3gydF4y2Ba那gydF4y2BaMSH6gydF4y2Ba,gydF4y2BaMHL3gydF4y2Ba与野生型对照相比(图。gydF4y2Ba8.gydF4y2Bab)。以前，发现MSH2缺乏小鼠细胞在X射线照射后具有低存活率，并且MSH2在细胞周期的G2相中需要RAD51和MRE11的重新定位[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．综上所述，这些结果可能表明OsJAC1在DDR通路中与MMR和NER连接。gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba显示一种方案，示出了通过osjac1过表达赋予的电离辐射的超电阻。总之，我们建议观察到的上调gydF4y2BaatmgydF4y2Ba和gydF4y2BaMRE11gydF4y2BaOsJAC1过表达提供了增强DNA损伤感知的证据。我们将观察到的DNA聚合酶、rpa和MCMs编码基因的转录变化解释为响应复制胁迫，osjac1过表达系DNA损伤检查点激活的证据。因此，通过OsJAC1过表达激活DNA损伤感知和DNA损伤检查点可能会增强对γ辐射的高抗性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

植物生长条件gydF4y2Ba

粳稻gydF4y2Ba简历。伊利可乐妇女来自韩国的农村发展管理局。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba生态型号gydF4y2Ba兰茨贝格erectagydF4y2Ba由全南大学锦湖生命科学实验室收购的“拟南芥生物资源中心”。水稻植株在30°C条件下生长，光照16 h，黑暗8 h。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba如上所述，在光和暗循环下在23℃下在23℃下培养植物。gydF4y2Ba

代OsJAC1-overexpressinggydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba行gydF4y2Ba

osjac1.gydF4y2Ba（XM_015763269）使用聚合酶链式反应（PCR）与基因特异性引物扩增cDNA。PCR条件如下：在94℃下一个循环5分钟;35循环在92℃下1分钟，57℃，1分钟，72℃持续1分钟;在72℃下循环5分钟。引物序列gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba是5'-ATG GCT GAT CCC AGC AAG CTG C​​A-3'和5'-TTA GAT CGG CTG C​​AC GTA GAC AC AAC-3'。放大的gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba将cDNA亚克隆到pCR™8/GW/TOPO®载体中，然后按照制造商的说明使用Gateway克隆系统转移到pMDC83载体中。引入osjac1过表达结构gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2BaLBA4404使用电穿孔。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba使用花卉DIP方法转化植物[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．从浸渍中收获种子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物。为了识别osjac1过表达构建体的插入，使用含有50μg/ ml卡那霉素的MS培养基进行选择。为了获得纯合OSJac1过度抑制线，进行从所选后代种子的分离分析。鉴定了六种含有OSJAC1过表达的纯合线。gydF4y2Ba

辐照条件gydF4y2Ba

水稻种子在Murashige和Skoog (MS;Duechefa，哈勒姆，荷兰)含有0.8%琼脂和1%蔗糖的固体培养基。用γ辐照器(gydF4y2Ba^60gydF4y2BaCO，大约150 TBQ;加拿大，有限公司，渥太华，安大略省的原子能为12小时，在韩国原子能研究所。为了鉴定剂量依赖性效果，每个样品使用各种剂量（100,200,300和400Gy）的γ辐射。在γ辐射分析后在不同时间（0-168小时）获得幼苗样品。确认时间依赖表达gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba响应于电离辐射，在不同剂量（100,200,300和400gy）以γ辐射暴露干稻种子，然后在MS培养基上发芽种子。收获了两周的米饭幼苗。gydF4y2Ba

盐胁迫的施加和植物激素的处理gydF4y2Ba

对于植物激素处理，米种子在含有0.8％琼脂和1％蔗糖的MS固体培养基中发芽。用1 mm SA（Sigma，St.Louis，Mo，USA）和0.1mm Ja（Sigma）治疗两周幼米幼苗。每次治疗后6,12和24小时收集样品。为了施加热应激，将2周龄的米幼苗在45℃下孵育2小时。在热处理后得到0,3,6和12小时的样品。gydF4y2Ba

RNA分离和定量逆转录(RT)-PCRgydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用RNEasy植物迷你套件（Qiagen，Hilden，德国）分离了总RNA（Qiagen，Hilden，德国），然后使用无RNase的DNase（Takara，Kyoto，Japan）除去DNA污染。使用Superscript®III逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）进行cDNA合成。对于定量RT-PCR，使用CFX™实时系统（Bio-Rad，Hercules，USA）使用Power Sybr Green PCR主混合物（Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL）进行cDNA扩增。PCR反应的条件如下：在94℃下循环5分钟;在92℃下循环为30 s，60℃，30 s，72℃，30 s;在72℃下一个循环5分钟。引物序列gydF4y2Baosjac1.gydF4y2Ba分别为5 ' -CGT CTC GAA AGC ATC ACA TT-3 '和5 ' -CGG CAT GGT CAA GGT AAG TA-3 'gydF4y2Ba肌动蛋白gydF4y2Ba分别为5 ' -TGA AGT GCG ACG TGG ATA TTA G-3 '和5 ' -CAG TGA TCT CCT TGC TCA-3 '。gydF4y2Ba

免疫印迹分析gydF4y2Ba

提取总蛋白时，将整个植物组织均置于提取缓冲液(100 mM Tris-Cl, pH 7.5;1 mM乙二酰胺乙酸;0.5 NP-40;150毫米氯化钠;3 mM二硫苏糖醇)和蛋白酶抑制剂(Sigma)。总蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(Sigma)上通过电泳分离，然后转移到Immobilon-P膜(Millipore, Burlington, MA, USA)。使用大鼠抗gfp抗体(Abcam, Cambridge, MA, USA)进行免疫检测，并根据制造商说明使用化学发光ECL试剂盒(Thermo Fisher Science, Waltham, MA, USA)进行可视化检测。gydF4y2Ba

比较转录组分析gydF4y2Ba

为转录组分析制备了两个生物植物样品重复。如上所述进行RNA分离。如Koo等人所述进行转录组分析。[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．简而言之，使用Illumina Truseq RNA样品制备试剂盒V2（Illumina，San Diego，CA，USA）构建mRNA-SEQ成对末端文库，并利用了Kapa图书馆定量试剂盒（Kapa Biosystems，威尔明顿，MA，USA）quantification of the library according to the manufacturer’s instruction. The cDNA libraries were sequenced using an Illumina HiSeq2000 (Illumina). For short-read mapping, reads were mapped to reference transcripts using the bowtie software (Langmead et al., 2009). DEGs (pgydF4y2Ba从基因图谱中筛选出转基因株系与对照比较中普遍表达的≤0.01和倍数变化≥2的基因。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用单因素分析(ANOVA)对定量RT-PCR和植物生长测量进行统计分析，使用R程序(版本3.6.1)。gydF4y2Ba

当前文章中的所有材料都可以从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

ATM机:gydF4y2Ba

共济失调毛细血管扩张症突变蛋白gydF4y2Ba

DDR:gydF4y2Ba

DNA损伤反应gydF4y2Ba

可见：gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

双边带:gydF4y2Ba

双股休息gydF4y2Ba

OsJAC1:gydF4y2Ba

水稻甘露糖结合拟合曲林相关章程gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

这项工作是由韩国原子能研究所的研究项目资助的。该资助机构在本研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有发挥任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 在Jung Jung和Joon-Woo Ahn对这一工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 高级辐射技术研究所，韩国原子能研究所，29 Geumgu-Gil，Jeongeup-Si，Jeollabuk-Do，56212，韩国56212gydF4y2Ba

   在Jung Jung，Joon-Woo Ahn，Min Jung Hong，Hong-Il Choi＆Jin-Baek KimgydF4y2Ba

2. 朝鲜共和国33657，93657，生态研究所生态保护局，生态学局gydF4y2Ba

   李贞恩黄gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

IJJ生成了转基因株系并分析了转基因植株的数据。JWA进行转录组分析，撰写手稿并整理所有数据。IJJ和SJ进行RT-PCR分析。JEH和MJH帮助设计实验。HIC帮助分析转录组数据。JBK监督工作并解释数据。所有作者都对手稿进行了修改。所有作者阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba金包克金gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

本研究不包含任何需要伦理同意或批准的研究。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba