用于油棕榈育种和种子生产的一种实用的基因组合法性测定

背景

育种和商业作物生产的合法性取决于优化的规程，以确保杂交的纯度和材料的正确田间种植。在油棕中，三种水果形式的存在允许这些假设得到验证，尽管只有在田间种植之后。在十字架上出现不正确的果形是不合法的明显标志。考虑到特内拉形式产生30％的油，用于与相同的水果重量硬脑膜，低水平的存在硬脑膜污染可能在油棕的经济寿命期间产生重大影响，这是大约25年。我们评估了两种合法性试验方法1）使用壳标记物与确定壳厚度特征2）使用SNP标记的基因，确定交叉的合法性。

结果

我们的结果表明，壳牌标记理论上可以减少由于壳体的主要损失硬脑膜污染特内拉然而，这些标记不能区分非法的特内拉这降低了培养精英的价值特内拉在商业种植和育种计划中，果型效用有限，不正确的身份可能会导致重大问题。我们提出了一种利用SNPs进行常规质量控制的优化方法。

结论

二者都硬脑膜和特内拉可以在幼儿园或之前鉴定和去除污染。使用与合适的取样方案耦合的SNP标记的优化合法性测定现在可以部署为油棕种子生产和繁殖的标准控制。相同的方法也是其他多年生作物的有效解决方案，例如椰子和枣棕榈。

油棕(Elaeis Guineensis.Jacq.)是一种异花授粉，但雌雄同株的作物;然而，以种子生产为目的的母系和父系系是根据果实中核仁壳的存在/不存在而独立发展的。Thick-shelled硬脑膜棕榈树产生较低的油产量特内拉杂合的,而无壳的pisifera手掌通常为雌性不育。之间的交叉硬脑膜和pisifera结果在薄皮特内拉其后代的石油产量比硬脑膜父母恢复了全部生育。因此，特内拉棕榈树是商业种植的首选。

与其他植物和动物养殖计划一样，了解家庭和个人的父母至关重要。在油掌中，目标是测量之间的组合能力硬脑膜和pisifera基于他们的表现特内拉后代，也称为后代测试。需要受控授粉以确保测试反映真实的家庭或背景。然而，授粉误差，例如受污染的花粉源，花序袋损伤和晚袋仍然是油棕养殖和种子生产中的明显，导致非法造成的[1]．除了不受控制的授粉的情况之外，雌雄同体偶尔花卉是否可以发生自我授粉[2]但通常可以识别和去除具有大量阳性花序的束。因此，油棕的种子刊物可以在花粉收集，授粉和种子处理到现场种植的任何阶段发生。质量保证和问题识别通常很困难，特别是当发生组合错误时。

迄今为止，油棕行业仍然依赖于壳体果实形式和核心周围存在纤维环，以确定种子批次繁殖和商业种子生产中的种子纯度。衍生自的种子硬脑膜（sh + sh +)xpisifera（嘘-嘘-）理论上是100％特内拉（sh + sh-)，由于共显性单基因遗传[3.]．意外硬脑膜和pisifera后代棕榈树被定义为非特内拉污染。然而，水果人口普查只能在田间种植后2 - 3年进行。基于成熟果实横截面的人口普查方法是艰苦的，效率低下。最重要的是，在这种成熟阶段的污染物替代污染物在经济上不可行，导致这些污染物的长期屈服损失在整个20-25岁的生产寿命中。解决这个问题，新的突变壳牌已识别负责果实形式的基因[4.]并且可用于检测非特内拉污染早在种子阶段。早期消除污染物在田间种植之前会显着提高成本效益，由于种子生产质量差，降低了产量损失，从而提高了每单位土地面积的油掌状效率[5.那6.]．但是，常规的水果人口普查和壳牌测试都分享了两个关键限制，其中该方法无法识别非法特内拉这是从错误的交叉或父母中得出的，并且没有向非法性的生产原因提供信息丰富的数据。由于从授粉花卉产生的每种由此产生的后代种子的不同遗传结合能力，错误的父母非法界面对油产量产生了进一步的影响。这在繁殖计划中特别有影响，非法父母股票可以影响多次未来几代，并混淆育种试验中的解释。

成立的种子生产商和种植园公司拥有专门的育种计划来维持其种植要求。准确的谱系记录使这些生产商能够利用每个交叉或种子批次的合法性测试，然后将种子释放到利益攸关方，这通常包括小农种植园和农民。本研究的目的是使用优化的基因组单核苷酸多态性（SNP）标记来开发合法性试验的改进的实际测定，然后实施为商业质量控制工具。商业人口硬脑膜，半和全SIB母语是盲目的测试，以确定使用1000个SNP和标记子集进行合法性测试的准确性。

遗传聚类和果实形式验证

测定的SNP在GS1000™面板中具有<5％缺失数据，可为988个标记。标记成功地将1000个棕榈树分配给三个集群，即家庭a（700棕榈树;黑色），家庭b（150棕榈树;红色）和家庭c（150棕榈树;绿色）在一个原理组件图中（图。1）.由于它们的半SIB谱系，家庭A和家族B更加遗传相关，因此重叠。家庭C的更广泛的分布是由于来自不同谱系的母婴。此外，所有三个家庭的果实形式也被壳牌试验验证。家庭A和家庭B与上海^熟食店/上海^雅拓基因型是特内拉，而家庭c上海^熟食店/上海^熟食店是硬脑膜．总体而言，结果表明了与已知的血统记录和观察到的果实形式的良好一致性。

1000油棕榈样品的遗传聚类。三个集群包括A - Family A（Deli硬脑膜1 x Avros.Pisifera1），B - 家庭B（Deli硬脑膜2 x avroPisifera1）和C - 家庭C（Deli硬脑膜手掌)。PC -主成分

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家庭的合法性参考

家族A显示出0.5–2.9%的非法性指示SNP，因此可以定义为合法人群。使用GS1000成功解决了这两个非法性来源™ 面板（图。2）.全部硬脑膜来自家庭C的污染物明确区分了12.3-47.7％的非法指示性SNP。第二个污染物来源，家庭B为98.7％半SIB特内拉3.0-10.0％的非婚生指示性SNP。该信息被用作后续敏感性分析的合法性参考标准。

合法性参考基于家庭A的父母A处于非法指示的SNP阈值= 3％（红色中的虚线）。a = family a（deli硬脑膜1 x Avros.Pisifera1)、家庭B(熟食店硬脑膜2 x avroPisifera1）和家庭c（熟食店硬脑膜手掌)。每个蓝点表示一粒经过测试的种子

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标记密度的合法性测试的敏感性

在所有的家系组合中，当使用更多的标记时，准确率显著提高 + C） 家庭（A+B） + C） 具有最高的准确性平均值，在900个SNP处分别记录到0.997（±0.001）和0.993（±0.002）（图。3.）.然而，准确率在不同的标记子集大小取决于家族组合时趋于平稳。对于Family (A + C)，平台点为80个SNPs，精度均值为0.959(±0.096)。Family的平台点(A + B + C)为200个SNPs，精度均值为0.977(±0.027)。

标记子集尺寸的合法性测试的敏感性。红色盒子=家庭（A + C）;蓝色框=家庭（A + B + C）。*高原点为80个SNP，家庭（A + C）为0.959个精度（±0.096）。**高原点为200时，家庭（A + B + C）为0.977个精度（±0.027）。家庭（A + C）表示发生硬脑膜家族(A + B + C)表明两者均有发生硬脑膜和特内拉污染

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对于常年种类，如油棕，选择性育种精英硬脑膜和pisifera个体是基于其后代的表型表现(反映在配合力上)。如果没有，则宣布商业后代的合法性特内拉污染通过水果人口普查低于5％。然而，过度硬脑膜和特内拉通常可以在用于扩大和改进亲本系的育种杂交计划中找到，例如硬脑膜X特内拉和特内拉X特内拉，与理论孟德尔偏析比有显著偏差(卡方检验)[7.]．这表明，“隐藏的”非法可能存在于未知的水平，在那里，壳类型被期望分离，甚至在壳类型与合法性一致的地方，如商业特内拉材料。

估计1％硬脑膜污染可能会根据马来西亚的2860万千万吨的年度原油棕榈油（CPO）生产，造成1788百万/年（4560万美元/年）的成本[8.]，假设油损失率为25%硬脑膜水果相比特内拉水果和2500 /吨/吨（638美元/吨）的CPO价格。因此，在考虑报告的平均值10.7％的情况下，在使用壳标记之前，在使用壳标记之前植入前的果实形式的重要性变得更加明显。特内拉马来西亚的小农种植污染[6.]．SHELL测试也立即受益pisifera选择项目。由于女性普遍不孕，新的pisifera父母是通过兄弟姐妹交配产生的。特内拉X特内拉或者特内拉Xpisifera．在一个特内拉X特内拉十字架，后代的果实形式的分离通常遵循孟钟的比例1硬脑膜：2特内拉：1pisifera(无花果。4.）.油棕榈饲料可以去除不必要的硬脑膜幼苗通过壳牌试验，减少25％的土地用于试验，留下所需数量特内拉和pisifera在离散块中种植，以便在未来更轻松的试验管理和数据记录。作为pisifera通常雌性不育，她们倾向于分配更多的资源到营养生长和经常激烈竞争硬脑膜和特内拉在同样的试验中，导致有壳水果形态的潜在性能下降。育种人员也可以在分离的区块中进行产量评估和花粉采集，而不是在常规的随机种植中花时间跟踪棕榈树。

壳牌标记的应用一个tenera.X特内拉争取pisifera选择程序。壳牌测试能够分化三种水果形式。硬脑膜那特内拉和pisifera在托儿所阶段。Tenera和pisifera通过所需数量的棕榈树，可以在不同的块中种植，并且通过去除不需要的块可以减少25％的试验陆地面积硬脑膜

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在这项研究中，使用GS1000成功地检测了总共1000个棕榈树™ SNP面板，并根据其系谱分为三类，即A家族、B家族和C家族（图。1）.结果进一步验证了以往研究中使用的OP200K基因分型阵列的实用性[9.那10]．与普通的父母，雅罗斯州的家庭A和重叠的家庭B的家庭A和Family BPisifera这介绍了这两个家庭之间的遗传相关性。家庭c起源于多个谱系硬脑膜在主成分图上可以清楚地区分出母掌和母掌，说明其遗传基础不同。然后建立了基于A家族血统的合法性参考(图)。2）.在3%的非法SNP阈值硬脑膜通过合法性测试来区分污染（家庭c）。虽然上海^雅拓单独的突变可以解释基于Avros的100％的果实形式变化特内拉在这项研究中，这可能不是其他来源的情况，因为另外报道了新的基因突变壳牌基因[4.那6.]．对单倍不足的进一步描述壳牌基因也揭示了可能的新突变和顺式复合突变的潜力尚未被描述。这可能会混淆壳型预测，特别是在渐渗杂种和更多外来种质中[11]．基于血统的身份的合法性测试可以有效解决这个问题。本研究中开发的合法性测试也能区分特内拉家庭A和家庭B的果实，而壳牌标记没有区分它们并将它们正确鉴定为100％特内拉．有0%的人硬脑膜目前，马来西亚标准与工业研究所(SIRIM)的商业种子生产认证会宣布A族和B族的混合是完全合法的，但部分样本集实际上来自错误的亲本(B族)特内拉有了这个实用的合法性分析协议，污染现在可以防止或至少可以解释。同样的情况也发生在其他作物上，非法个体不能总是通过表型来区分。例如，在椰子(Cocos Nucifera在黄矮×高杂交中，叶柄颜色常被作为表型标记来确定遗传纯度，但在高品种中未观察到颜色变异[12]．

在发现人DNA中的限制性片段长度多态性（RFLP）标记后，在1980年代开发了DNA指纹识别技术[13]．然后发现更多标记系统并施用于哺乳动物[14)、鸟类(15并最终种植。为了增加基因分型通量和多态性，油棕研究人员改变了他们对微卫星标记的偏好，结果很有希望[16那17那18]。在过去十年中，该技术一直被强烈推荐为所有杂交种和组织培养克隆的标准做法。然而，之前尚未实现将合法性指纹技术完全用于商业种子生产，主要原因是检测成本高，采样方法不明确。为了解决这一问题，使用g SNP标记是为商业规模的合法性测试而开发的，标记集大小从1000到200个位点进行了优化，足以识别这两个位点硬脑膜和特内拉基于测试系列(A + B + C)，污染具有一致的准确性(图。3.）.有趣的是，只需要80个基点来区分硬脑膜符合Family (A + C)要求。油棕种子生产商每年通常生产100多万颗种子。检验每一个杂交品种的每一粒种子是不切实际的，在经济上也是不合理的。然而，许多已建立的质量控制抽样方案，如ISO2859-3系列在制造业中被广泛采用。这些方案为有效样本量的确定提供了全面的参考依据，并可有效地为种子生产质量控制的合法性分析提供质量基础。然而，当处理替代群体时，或现有亲本群体的遗传基础由于选择性育种而变得狭窄时，仍有必要重新评估分析方法。

使用SNP标记的合法性测试可以识别硬脑膜和特内拉托儿所阶段或之前的污染。一种优化的标记集200 SNP与合适的采样方案相结合，将实现合法性测试，精度超过97％，作为种子纯度在繁殖和商业生产中的标准质量控制程序。如果没有访问谱系记录和父手掌，shell测试仍然是小农丢弃的强大工具硬脑膜田间种植前的污染。对于像油棕这样的多年生作物，非法性很容易导致12年的育种选择周期失败，而对于商业棕榈树，则会导致产量潜力降低25年。因此，基因纯度和良好的农业实践对于确保未来油棕工业最高的产油量同样重要。

植物材料和DNA制备

共有1000棵棕榈树，其中包括A家族(700棵来自德利)硬脑膜1 x Avros.Pisifera1） 家庭B（熟食店150棕榈树）硬脑膜2 x avroPisifera1）和家庭c（150 deli硬脑膜手掌)被选中。家庭A和家庭B是作为商业产品生产的特内拉种子和家庭C被用作养殖和商业种子生产的母照。另外，三个父掌上棕榈，被称为熟食店硬脑膜1，熟食店杜拉2.和雅罗罗斯Pisifera 1所有棕榈均来自内部育种材料，并在马来西亚森那美种植园研发中心保存。总基因组DNA从0.1 使用DNAeasy Plant Mini Kit（德国Qiagen）采集幼叶组织（叶0处）。

单核苷酸多态性基因分型

为合法性测试和果实形式验证进行了1003个棕榈树基因分型。从OP200K Infinium阵列（Illumina）中选择总共1000个SNP [9.]形成一个较小的基因分型小组，即GS1000™. SNPs的探针设计基于Kompetitive等位基因特异性PCR的要求™ （卡斯普）™) 基因分型平台。约0.3 以基因组DNA的ng为模板，用两个荧光团FAM和HEX区分KASP™ 基因分型数据。在聚类图中，红色和蓝色标记的样本分别为HEX和FAM等位基因的纯合样本。杂合样本显示为绿色。为了确认分析棕榈的果实形态，使用KASP进行相同的基因分型方法™ 探测上海^mpob和上海^雅拓突变[11]在他们报告的基因组位置，即3,078,161 bp和3,078,154bp染色体2 [4.]．仅选择具有低于5％缺失数据的SNP进行后续分析。

数据分析

在R包装中分析了三个家庭（A，B和C）中的遗传聚类snprelate.默认参数[19]．测定棕榈树中的壳体测试和遗传相关性用于验证其血统记录。然后使用内部开发的程序进行合法性测试，即高保尔1.0.．只有当后代和亲本基因型遵循孟德尔遗传时，该方案才将样本归类为合法样本(见表)1).在本测试中，“合法”个人接受≤3%的非婚生性指示性SNP™’据报告，阳性DNA样本的平均基因分型误差为0.7–1.6%[20.]．

在盲测中，假定家庭B和家庭C是家庭A的污染物。合法性测试是在不同的家庭组合中进行的，反映了生产/田地中可能的污染类型:(i)家庭(A + C)(850棕榈树)硬脑膜(ii)家庭(A + B)(850棕榈树)为半同胞污染，(iii)家庭(A + B + C)(1000棕榈树)为多个污染源。使用GS1000™面板从Family (A + B + C)构建合法性参考。其次是灵敏度分析合法性测试使用不同的SNP子集从20到900标记的逐步增加20 100 100个SNP,然后标记为每个组合多达900 (i)和(iii)。每一个标记子集与1000次迭代分析的随机标记选择GS1000™面板。每个测试的准确性是根据观察到的不能与参考区分的非法手掌的数量来确定的。描述统计和图表绘制的准确性产生在R。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

CPO：

原油棕榈油

卡斯普™:

Kompetitive等位基因特异性PCR™

RFLP：

限制性片段长度多态性

西里姆：

马来西亚标准和工业研究所

SNP：

单核苷酸多态性

我们要承认我们的育种者从油棕养殖部分进行样本贡献。我们还要感谢分子育种实验室进行基因分型样品和分析支持。

本研究得到了Sime Darby Plantation Sdn的充分支持。有限公司资助森美达比种植研发中心收集资料、进行实验、分析数据、撰写论文和修改稿件。

隶属关系

1. 马来西亚雪兰莪州班汀森美达比种植研发中心生物技术与育种部

   邓志敬，李恒冷，Hafiza Abidin, ailing Ong & David Appleton

2. 诺丁汉大学马来西亚，Semenyih，Selangor，马来西亚大学生物科学学院

   Chee-Keng Teh＆Ai-ling Ong

3. 英国诺丁汉大学生物科学学院

   肖恩·梅耶斯

4. 新加坡国立大学生物科学系，新加坡，新加坡，新加坡

   Fook-Tim咀嚼

贡献

CT和HL构思和设计了实验;HL和CT分析数据;本文由CT、HA、AO、FC、DA、SM撰写。所有作者都已阅读并批准了稿件。

通讯作者

通信Chee-Keng格兰．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

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