通过小麦高吞吐量SNP阵列遗传前芽前群体耐受性和推定基因发现（Triticum Aestivum.l .)

背景

耐除草剂是旱地小麦作物有效除草的重要特性。小麦耐metriczin的遗传知识是培育小麦新品种的基础。在这里，我们研究了九个小麦杂交组合对metriczin耐性的基因效应，通过将每个杂交组合的6个基本代的平均值和方差划分到它们的遗传成分中，以评估控制该性状遗传的基因作用。治疗后21天，通过视觉衰老评分测量metriczin耐受性。采用小麦90 K iSelect SNP分型技术，分析了耐药和易感群体中等位基因在SNP位点的分布。

结果

缩放和合资比例的测试表明，在小麦嗪草酮耐受性的继承了充分的被加性 - 显性模型来描述，用添加剂基因作用的最显著因素的耐受性。The potence ratio for all the crosses ranged between − 1 and + 1 for senescence under metribuzin-treated conditions indicating a semi-dominant gene action in the inheritance of metribuzin tolerance in wheat. The number of segregating genes governing metribuzin tolerance was estimated between 3 and 15. The consistent high heritability range (0.82 to 0.92) in F_{5 - 7}基因rations of Chuan Mai 25 (tolerant) × Ritchie (susceptible) cross indicated a significant contribution of additive genetic effects to metribuzin tolerance in wheat. Several genes related to photosynthesis (e.g. photosynthesis system II assembly factor YCF48), metabolic detoxification of xenobiotics and cell growth and development (cytochrome P450, glutathione S-transferase, glycosyltransferase, ATP-binding cassette transporters and glutathione peroxidase) were identified on different chromosomes (2A, 2D, 3B, 4A, 4B, 7A, 7B, 7D) governing metribuzin tolerance.

结论

简单的加性-显性基因效应将有助于育种家在早期世代中选择耐药品系，并为开发耐药功能标记提供指导。

小麦(Triticum Aestivum.L.）是生产和面积覆盖范围内的主要全球谷物作物（粮农组织2018）[1]．小麦是澳大利亚最大的粮食作物，占世界贸易的12%左右。在澳大利亚，西澳大利亚州(西澳大利亚州)有最高的抗除草剂杂草报告，这是西澳大利亚州农民的关键农艺问题。在一些情况下，杂草侵扰已导致小麦产量严重下降(高达50%)[2]．提高对甲虫嗪的耐受性有利于西澳小麦工业保护作物不受除草剂侵害，提高产量。因此，通过改良计划培育耐除草剂能力更高的小麦品种是至关重要的，特别是在地中海型气候地区。

在作物中，metriczin耐性的遗传有不同的遗传控制方式。大豆单基因隐性遗传(甘氨酸最大l .) [3.，4]和土豆（Solanum Tuberosum.l .) [5]．硅等。[6]报道了两种独立的半导体基因，在窄叶羽扇豆中具有添加剂效应（卢比斯angustifoliusl .)。耐受嗪草酮的硬粒小麦的继承（T. Turgidum.L.）是由小麦核和细胞质基因控制的复杂性格[7，8]．这一观点得到了如下观察的支持:生理过程，如吸收、转运和代谢/解毒，改变了除草剂到达靶点的数量。对metrizin抗性的遗传控制和遗传力的研究将指导育种人员制定合适的除草剂抗性品种选育方案。

在我们之前的调查中报道的来自六大洲的小麦对metriczin耐性的变异[9，为育种人员估计基因效应和制定有利的育种程序以提高除草剂耐受性提供了宝贵的资源。抗性基因型间的自然变异表明选择可能是提高产量的有效方法。然而，选择效率与遗传力的大小和遗传进展有关。遗传力估算和遗传进展是重要的选择参数，通常更有助于预测选择下的遗传增益[10.]．因此，深入了解基因作用的性质、遗传力和预测遗传增益有助于在小麦育种中选择优良种质，提高小麦的耐除草剂性和产量。

DNA标记有用于改进传统的植物通过标记辅助选择（MAS）的育种效率和精度的巨大潜力。嗪草酮的耐受性小麦的分子机制知之甚少。在新一代测序的进步促进了SNP的发现在整个基因组[11.，12.提供大量的全基因组多态性，因为它们可能代表基因组中发生的所有突变[13.，14.]．由Illumina开发的最近的小麦90K isElect测定是标记农艺上重要特征的有用遗传资源。闭合终端测定将现有的序列知识包含在微阵列平台上，从而在不同的池中启用高吞吐量SNP发现。

这项研究的目的是（1）表征耐受嗪草酮的继承九个小麦杂交，（2）考察F中的遗传_{5 - 7}RILs of the most diverse cross (Chuan Mai 25 × Ritchie) (3) conduct 90 K iSelect SNP genotyping assay in diverse cultivars to discover allelic variants in SNP markers in tolerant and susceptible groups, and (4) determine the likely chromosomal locations and candidate genes responsible for metribuzin tolerance in wheat.

表型变异

在宽容和在这项研究中使用容易受到父母的平均衰老（SS）是表1．敏感的父母有很大意义（P < 0.05) higher SS than the tolerant parents. Average SS for F₁F₂公元前,_T和BC_年代人口是表2．方差分析表明世代间差异极显著，表明小麦对metriczin的耐受性存在遗传变异。F₂平均值具有与F相当的范围₁的意思。回交的平均SS随亲本的不同而不同。表示叉的缩写见表1．回交f₁行(公元前_T除K × D杂交外，其余亲本的SS值均低于中亲本(mp)，表明加性基因作用正，耐metriczin表达较高。相比之下,公元前_年代SS高于中亲本值。F的叉形₁结果表明，CM × D、F × D和K × D组合中，敏感Dagger与mp值相差最大，分别为31.3、38.6和29%。交互杂交的比较显示出显著差异(P≤0.05)，但三种互反交叉组合除外(表3.）.因此，正反交不汇集了一代平均分析。

基因的影响

小麦耐metriczin的遗传模型及基因作用

六个杂种的缩放测试（A，B，C和D）的结果（表4）均无显著，这表明不存在上位基因相互作用和简单添加剂的显性模型的适当性。对于熔点的遗传参数，由联合缩放测试估计添加剂基因效应（d）和显性基因效应（h）和它们的标准偏差列于表4．反映基因座效应和相互作用贡献的mp在9个杂交组合中均达到显著水平。加性基因效应显著(P = 0.05) for all nine crosses, and dominance gene effects were significant (P = 0.05) for four crosses (CM × R, CM × S, F × D and ER × D). The additive-dominance model fitted well for all crosses. The model significance was checked using χ²统计数据显示，预期和观察到的一代均值之间存在微不足道的差异，证实了小麦梅群耐受性的重要添加剂 - 优势模型（表4）.

小麦对metriczin的耐受性表现为部分显性或隐性显性。1）.在表的潜在能力比2在- 0.75 ~ 0.51之间，介于- 1 ~ + 1之间，表明该基因对小麦耐metriczin遗传具有半显性作用。负电位比的组合(CM × R、F × S、ER × R、K × S和K × D) F值较低₁装置（降低植物毒性作用），也更类似于宽容父母，指示部分显性基因效应的存在。The crosses with a positive potence ratio (CM × S, CM × D, F × R, F × D, ER × S, ER × D) had higher F₁装置（更高植物毒性作用），这表明隐性显性（图1）.

遗传力和抗病基因的数量

研究了F_{5 - 7}RILs of the Chuan Mai 25 × Ritchie appeared to be normal, indicating metribuzin tolerance as a quantitative trait (Fig.2）.种群均值仍高于亲本，表现为亲本两个方向的越界分离。遗传力高，具有可比性₅（0.82），F₆(0.95)和F₇（0.92）十字川迈25 /里奇（表5）.有代表在F大基因和一些小的修饰基因八大峰最低₅F₆和F₇ril种群。基因号，n₁，根据亲本和F的方差估计₂和基因数n₂估计基于父母，F的差异₁和F₂变化对于大多数杂交。Wright的公式估计出的最小的三个基因和最大的15个基因在小麦赛克津容差（表6）.

SNP发现和潜在的候选基因

90 k isElect SNP基因分型测定含有81,587个SNP。除去总共60,635次单声道等位基因（74％），没有任何基因型的聚类模式。共有12,294个基因座没有呼叫并被删除。其余8,661个基因座（12.9％）具有≥2个簇，用于主成分分析（PCA）分析;在七种基因型中的等位基因变异结果如图2所示。3.．PCA的分析表明宽容和易感人群之间显著的变化。耐受组和易感组清晰的分离，根据PCA部件1中，所表示的两组之间的高的遗传多样性。总共296个SNPs，两组之间的多态性/双等位基因标志物（附加文件1：表S1）。

涉及与宽容和易感人群之间的差异鉴定的SNP假定基因是通过在BLASTN搜索标记的研究Triticum Aestivum.IWGSC_refseqv1.0。结果表明，metriczin耐性是由不同染色体(2A, 2D, 3B, 4A, 4B, 7A, 7B, 7D)上的几个位点控制的数量性状7）.只有与光合作用和代谢解毒途径相关的基因被认为是候选基因．多个SNP和候选基因鉴定染色体7B（光合作用系统II装配因子YCF48和ABC转运蛋白），染色体4A（细胞色素P450家族），染色体7A（谷胱甘肽S-转移酶），染色体2A和3B（糖基转移酶），以及染色体2D（谷胱甘肽过氧化物酶）表示与在小麦赛克津公差显著关联可能的基因/基因家族。

的芽前除草剂耐受性继承和基因作用的模式将有助于育种者选择合适的育种方法来开发更宽容的品种和打击早期杂草的竞争，以提高小麦的产量。的选择和植物育种计划的效率取决于遗传变异的存在[15.]．在我们之前的研究中，小麦耐metrizin的遗传变异很明显[9，16.]．metriczin的耐受性和敏感性是由细胞质和核基因共同控制的₁混合动力车。之前，Ratliff等人[7报道在小麦嗪草酮耐受性核和细胞质基因的作用。嗪草酮宽容是一种多基因遗传特征和本次调查发现的最大的负责性状15个基因。比利亚罗亚等。[8]报道赛克津耐受性的数量性状由许多基因在小麦控制，它支持本发明的发现。在分离群体中观察到的表型侵（图2）与父母表型相比是由于添加剂等位基因的重组，都是正面和负方向。重组导致两个或多个基因座的新等位基因。这些基因座的改变/增强基因表达引起了新的表型[17.]．

metriczin的耐受性可以用简单的加性-显性模型来解释，这表明不存在上位性或非等位互作。没有上位性和显著的加性效应有效地响应了选择[18.]．这些特征的等位基因在早期的几代中是固定的。这些事实可以指导育种家在早期世代选育品系。标度检验、联合标度检验和卡方统计结果均可作为加性基因效应高于显性基因效应的证据，说明加性基因效应是影响metriczin耐药的决定性基因类型。所有杂交组合的加性基因效应(d)都非常显著，这表明加性基因效应在麦虫嗪耐受方面具有优势，并表明利用早期系谱选择程序提高小麦叶绿素性状性能的潜力。

占优势遗传学是一个人的等位基因之间的关系基因，效果的影响表型掩盖了同一位点上第二个等位基因的贡献。这是一个关键的概念孟德尔遗传和经典遗传学．常为功能性蛋白质的显性等位基因代码而隐性等位基因不[19.]．在数量遗传学，测量并在数值上测量并治疗的表型。在目前的调查中，f₁低SS的杂种表现出部分显性基因作用。因此F₁负效比的杂交种具有中到低的毒力效应，表现出与耐受亲本相似的表型。1）.然而,F₁具有较高的SS杂交种隐性，显性基因作用。因此，在F₁杂种具有正潜在能力比例已经中期到高赛克津植物毒性作用，并表示类似于易感亲的表型。

遗传率一致，在80%以上_{5 - 7}RIL川迈25×RITCHIE的群体，这表明梅里布林耐受性稳定性。这些特征可以通过在繁殖计划中轻松转移，以产生更高的耐受品种。没有超声囊增加本研究中基因数量估计的准确性，因为它符合Wright的赖特的假设[20.]．十字架有根据药敏的易感家长程度基因的单向分布。涉及里奇作为易感亲十字偏析最基因，随后匕首投枪。

鉴定为具有在异生素的解毒蛋白质保护免受氧化损伤的细胞和在应力下保持光合作用过程完整通过PSII复杂修复的网络的耐受组编码的纯合等位基因的SNP的候选基因。鉴定的基因超家族或结构域，尤其是细胞色素P450（CYP同工酶）和谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）糖基转移酶（GT），ATP结合盒转运蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是参与共轭农药代谢产物的液泡封存基本上异生素的解毒酶[21.，22.，23.]．植物可以利用酶代谢各种各样的外生物质，如有机污染物和杀虫剂，以及除草剂[22.]．小麦中除草剂解毒最常见的途径是初始羟基化，通常由细胞色素P450混合功能氧化酶(CYPs)和谷胱甘肽s -转移酶(GSTs)介导的谷胱甘肽结合。cyp和gst与杂草(如黑草)对多种除草剂的基于代谢的抗性有关[24.]．

所鉴定的糖基转移酶和氧化还原酶介导了不同的生物过程。它们参与蔗糖代谢和外生解毒的代谢解毒。从我们之前的研究中发现的候选基因[16.] QTL作图建议糖基转移酶和参与代谢解毒氧化还原酶的，部分赋予在小麦赛克津公差。通过皮尔彻等人所进行的微阵列分析。[25.]表明，蔗糖代谢是高度响应小麦嗪草酮的压力。所识别的光系统（PS）II装配因子YCF48是光合电子传递链，即PSII，PSI，细胞色素B的类囊体包埋大色素蛋白复合₆f复合物和ATP合酶。这些多部分复合物利用太阳能，并与ATP合酶一起产生还原力(NADPH)和化学能(ATP)，以在卡尔文循环中生产碳水化合物[26.，27.，28.，29.]泛素化途径参与氮气再循环，防止在除草剂应激期间的衰老[30.]．综上所述，所鉴定基因编码的蛋白参与了PSII复合体的代谢解毒、碳代谢和修复。

了解小麦的除草剂耐受的遗传将引导育种者在具有更广泛的安全余量的除草剂耐养品种。小麦的Metribuzin耐受性具有高遗传性和显着的添加剂基因作用，没有外观。因此，MAS可以是用于在作物改善计划中选择除草剂耐药线的可行常规解决方案。小麦的Metribuzin耐受性很可能是一种基于非目标的机制，其中Metribuzin被一系列代谢酶解毒。然而，需要转录的组宽基因表达分析，以显示小麦中重代谢除草剂抗性的基因和途径。

基因作用的简单加性-显性模式表明，在小麦的早期分离世代中，可以成功地利用简单的选育程序来选择耐metrizin的品系。本研究强调PSII组装因子、抗氧化剂和解毒系统(CYPs、GSTs、GT、GPX)的基因表达程度是决定小麦耐metrizin的主要因素。鉴定的标记可用于抗性品种的标记辅助选育。另一种方法是通过自然渗透将耐受基因引入到小麦品种中，以增强对metriczin的耐受性。

除草剂

赛克津(C₈H_14.N₄OS），从Syngenta作物保护中购买了三嗪酮除草剂。Metribuzin在PSII中结合其靶位点D1蛋白，并抑制初级电子受体与塑性醌之间的电子流动，抑制光合作用。Metribuzin剂量为400g a.i.哈^{- 1}用于评估父母的宽容状态₁F₂公元前,_T和BC._年代人口和F_{5 - 7}十字架的rils，cm×r（对于所有缩写，请参阅表格1）.

植物材料

7个小麦基因型对metriczin有不同的耐受性(表)1）从澳大利亚冬小麦收集获得。本研究选取的宽容和敏感的父母是从以前的宽容筛选[9]和Kleemann和Gill鉴定的当地WA品种[31.]．Plants of metribuzin T (tolerant) and S (susceptible) parental type were grown in 1 L pots containing potting mix (50% peat moss: 50% river sand) and maintained in a glasshouse at The University of Western Australia during a normal winter growing season. Single T and S plants growing individually in pots were paired according to floral synchronicity to produce F₁母体r和payern s（f₁rs）和f₁母亲S和父亲R (F₁SR)混合动力车。用互交法检验母系对除草剂抗性的影响。随后,RS F₁s自交和回交到它们的R和s植株上产生F₂和回交(公元前_T和BC._年代）代，分别。Additionally, the Chuan Mai 25 (T) × Ritchie (S) cross was selected to develop recombinant inbred lines (RILs) in the growth chamber using rapid generation single seed-descent in-vitro embryo culture technique (Fig.4）[32.]．总共73华氏度_{5 - 7}重组自交系中筛选出在温室中，以计算遗传嗪草酮的耐受性。

除草剂筛选和植物毒性评估

父母，f₁F₂公元前,_T和BC._年代人口和F_{5 - 7}杂交组合CM × R在砂盘系统中评估了metrizin的耐受性[9]．The trays were sprayed with 400 g a.i. ha^{- 1}通过双平面风扇喷嘴，垂直于两个通过的托盘表面的梅里布列汀以118L公顷的流速垂直于托盘表面^{- 1}和20.0 kPa pressure in a cabinet spray chamber. The amount of herbicide required for 400 g a.i. ha^{- 1}使用双平板喷嘴流量的除草剂率的比率来计算L / HA。将托盘保持在植物中，其中温度设定为25/15℃/夜/夜，每48小时定期浇水。

治疗21天后测量衰老评分(SS)/视觉损伤(DAT)(图。5）.植物没有视觉症状得分为0,增加水平的泛黄和发育不良是得分从1到4,增加水平的叶异常(叶子皱)和叶坏死从5到8分,和死与总叶植物褐变和坏死的顶端被得分为9。平均SS≤3个株系记录到耐受(T)， 4 ~ 5个中等耐受(MT)， 6 ~ 9个易感(S)₁SS在三个重复上取平均值。

鉴定SNP和潜在候选基因

利用小麦90 K iSelect SNP基因分型分析评估了SNP位点等位基因的分布，该分析包含81587个全基因组分布的SNPs，遵循Wang等人描述的程序[33.]．在这项研究中使用的7个父母产生等位基因查出（表1)，将4个抗性基因型作为组1,3个敏感基因型作为组2进行比较。利用Genome Studio 2.0软件(Illumina)进行SNP聚类和基因型调用。缺失值超过20%、SNP呼叫不明确或等位基因频率低于5%的单形性和低质量SNP标记被排除在进一步分析之外。利用两组间的多态SNP位点进行候选基因分析。

利用BLASTN程序鉴定了控制metrizin耐性的候选基因。Triticum Aestivum.IWGSC_refseqv1.0)，查找基因的Traes数。BLAST的点击被过滤了e -价值阈值10^− 5序列相似性大于95%。在UniProt in TrEMBL (http://www.uniprot.org）和uniparc（https://www.uniprot.org/uniparc/），以获得更多的信息，包括蛋白质结构域，家族，潜在候选基因的分子和生物学功能。此外，域和InterPro的注释的主要特点进行了检索PFAM和的Prosite检查蛋白质的特性。只有那些具有已知功能的基因和/或相关的光合作用和代谢排毒能力被认为是潜在的候选基因小麦嗪草酮的耐受性。

主成分分析（PCA）

PCA是在七个父母的SNP调用执行，以确定遗传相关性/多样性。SNP等位基因转换为1/0二元体系，接着PCA使用内置中的R函数“prcomp”进行，并且使用“dudi.pca”函数从ade4ř包数据是可视化[34.使用SNP作为变量。

基因分析

母体效应或细胞质效应对群体均数差异的贡献通过比较倒数F的均数来评估₁十字架。采用代均值分析方法，对各杂交组合的耐metriczin的遗传方式进行了估计。不同世代(即父母)的SS平均数据(P₁和P₂), F₁F₂公元前,_T和BC._年代对9个交叉组合进行标度(a, B, C, D)和联合标度测试，使用加权最小二乘法，证明存在或不存在上位性[35.，36.，37.]．当加性优势模型拟合数据时，根据Allard [38.]．这提供了方差的加性和显性成分的估计。估计的基因效应:平均值(m)，加性值(d)和显性值(d)在0.05和0.01的概率水平上通过t检验。通过比较由参数估计得到的6代期望均值和观测代均值，验证了模型的拟合优度²)的统计量，各参数的显著性用at-测试 [35.，36.]．

优势的性质是根据​​[38.] P\(= \压裂{F_1-M.P。}{0.5 \ \ P {} _2 - P{} _1 \右)}\)，其中P是基因组F的相对能力₁第一代意味着，p₁下父结点的均值是P吗₂为上亲本的均值，M.P.为中亲本的值。当Pwas − 1 or + 1, while partial dominance was indicated when ‘P’ was − 1 or + 1, except for zero, which indicates the absence of dominance. Over dominance was indicated when the potence ratio exceeded + 1. The positive and negative signs indicate the direction of the dominance of either parent.

基于泊松回归广义线性模型拟合到F的SS数据₅F₆和F₇RILs from the, Chuan Mai 25 × Ritchie cross using glm() function in R and heritability was calculated based on ANOVA using the formula: h²＝\（{\增量} _g ^ 2 / \）（\（{\ delta} _g ^ 2 + \）\({\三角洲}_e ^ 2 \)),\（{\增量} _g ^ 2 \）和\({\三角洲}_e ^ 2 \)分别为估计的基因型方差和误差方差。估计的基因型和误差方差计算为:\（{\增量} _g ^ 2 \）\（= \压裂{MSG-MSE} {R} \）和\({\三角洲}_e ^ 2 \)\（= \ frac {mse} {r} \）其中MSg为RILs的均方，MSe为残差，r为重复次数。此外，利用Wright公式估算了每个杂交组合中控制metriczin抗性的基因数量[39.，40]．

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

公元前_年代：

F1回交至感亲本

公元前_T：

F1对宽容父母的回车

厘米：

川麦25

CYP：

细胞色素P450

d:

加性基因效应

D:

匕首

呃：

鹰岩

F：

丰杜莱亚490

F1：

第一子代

F2：

子二代

GPX:

谷胱甘肽过氧化物酶

销售税:

谷胱甘肽S-转移酶

GT：

糖基转移酶

H：

优势基因效应

凯西:

风筝

马斯：

标记辅助选择

熔点：

中父价值

主成分分析:

Principlal成分分析

psii：

光系统II

R：

里奇

S：

矛

SNP:

单核苷酸多态性

SS：

衰老得分

作者对Ifeyinwa onyemaobi和Guannan Liu女士进行了衷心的感谢，用于技术援助和Robert Creasy和其他Glasshouse员工，以帮助他们的帮助。作者要感谢Jacqueline Batley教授和Aneeta Pradhan博士在90 K SNP阵列基因分型中提供帮助。

鲁帕利感谢澳大利亚政府资助她的博士研究的研究培训项目奖学金。Yitpi研究基金会(根据《植物育种者权利法》注册的作物科学研究基金会)支持这项研究的设计，并支付杂交、数据收集、数据分析和数据解释所需的材料费用。澳大利亚工业、创新和科学部的全球创新联系计划(GIL53853)资助了SNP的工作。

从属关系

1. 农业和环境，西澳大利亚珀斯大学，WA，6009，澳大利亚西澳大学学院

   Roopali Bhoite，平四，刘晖，凌虚与桂军燕

2. 澳大利亚州西澳大利亚大学UWA农业研究所，珀斯，6009，澳大利亚

   Roopali Bhoite，平四，刘晖，Kadambot H. M.西迪基与桂军燕

3. 浙江理工大学生命科学学院，浙江省植物次生代谢与调控重点实验室，杭州310018

   凌旭

贡献

RB，SP，KHMS和GY构思和设计了实验;RB进行了主要实验，HL和LX辅助人口发育和除草剂喷涂;RB和HL分析了数据;RB写了稿件，HL，SP，GY和KHMS批判性地审查了稿件。所有作者批准了稿件的最终版本。

相应的作者

对应到林贵军则严．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们在这项研究中没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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